聶佳佳

(上海市第八人民醫(yī)院消化內科，上海 200233)

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，患者預后極差，5年生存率低下。吉西他濱是用于胰腺癌治療的一線化療藥物，但單藥治療的臨床獲益有限，聯合順鉑、5-氟尿嘧啶等其他化療藥物或厄洛替尼等靶向藥物的不良反應大,且尚無足夠證據表明聯合用藥能獲得更理想的生存獲益[1-2]。五味子甲素是中藥五味子中的一類木質素化合物，多項胰腺癌相關的細胞實驗[3-4]表明，五味子甲素能夠抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，表明五味子甲素可能具有抗胰腺癌的潛在作用過于絕對。有實驗[5]表明，五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制肝癌細胞增殖，同時抑制β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路的激活。但五味子甲素與吉西他濱聯用是否能夠協(xié)同抑制胰腺癌細胞的增殖、以及是否抑制β-catenin通路的激活均尚不明確。為此，本實驗將以胰腺癌PANC-1細胞株為實驗對象，具體分析五味子甲素協(xié)同吉西他濱調控β-catenin通路抑制胰腺癌細胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1材料 胰腺癌PANC-1細胞株購自ATCC公司，五味子甲素購自MCE公司，MTS法細胞活力檢測試劑盒購自Promega公司，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)購自Sigma公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒北京索萊寶公司，B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)、細胞周期素D1(cyclinD1)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(Phosphorylation Glycogen synthase kinase3β，p-GSK-3β)購自Abcam公司。

1.2方法 PANC-1細胞在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換1次完全培養(yǎng)液，待細胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶進行消化并傳代。傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板內進行分組給藥，對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理；吉西他濱組用含有50 μg/mL吉西他濱的培養(yǎng)基處理；五味子甲素組用含有25 μmol/L五味子甲素的培養(yǎng)基處理；吉西他濱+五味子甲素組用含有50 μg/mL吉西他濱及25 μmol/L五味子甲素的培養(yǎng)基處理。將PANC-1細胞接種在96孔培養(yǎng)板中，分組給藥后24，36，48 h時，采用MTS法細胞活力檢測試劑盒進行實驗，向每個培養(yǎng)孔內加入20 μL檢測液并在培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后取出培養(yǎng)板、在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光值A490。將PANC-1細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，分組給藥后48 h時，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，80%冷甲醇-20℃固定過夜；次日，離心收集細胞并調整密度至1×107/mL，取100 μL細胞懸液、加入400 μL PI染液，避光孵育30 min，最后在流式細胞儀上檢測細胞周期。將PANC-1細胞接種在12孔培養(yǎng)板內，分組給藥后48 h時，棄培養(yǎng)基、保留細胞，用RIPA裂解液裂解細胞并提取蛋白樣本，用BCA法試劑盒測定樣本中的蛋白含量，根據測定結果取含有20 μg蛋白的樣本進行Western blot檢測。電泳后電轉移至NC膜，封閉1 h后孵育Bcl-2、Bax、cyclinD1、β-catenin、p-GSK-3β、β-actin一抗4過夜，次日孵育二抗1 h，最后將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，得到蛋白條帶簡述，根據條帶的灰度值計算表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件錄入數據，四組間計量資料的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1PANC-1細胞活力的比較 藥物干預24，36，48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組的A490水平均明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組的A490水平均明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)；吉西他濱組、五味子甲素組、吉西他濱+五味子甲素組內干預24，36，48 h時A490的兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 四組PANC-1細胞活力的比較

2.2PANC-1細胞周期的比較 藥物干預48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組G0/G1期比例明顯增加，S期、G2/M期比例明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組G0/G1期比例明顯高于吉西他濱組、五味子甲素組，S期、G2/M期比例明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見表2。

表2 四組PANC-1細胞周期的比較

2.3PANC-1細胞中增殖及細胞周期相關基因表達的比較 藥物干預48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組Bcl-2、cyclinD1的表達水平明顯降低，Bax的表達水平明顯增加(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組Bcl-2、cyclinD1的表達水平明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組，Bax的表達水平明顯高于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 四組PANC-1細胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1的蛋白條帶

表3 四組PANC-1細胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1表達的比較

2.4PANC-1細胞中β-catenin表達的比較 藥物干預48 h后，與對照組比較，吉西他濱組、五味子甲素、吉西他濱+五味子甲素組β-catenin、p-GSK-3β的表達水平明顯降低(P<0.05)且吉西他濱+五味子甲素組β-catenin、p-GSK-3β的表達水平明顯低于吉西他濱組、五味子甲素組(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 四組PANC-1細胞中β-catenin、p-GSK-3β的蛋白條帶

表4 四組PANC-1細胞中β-catenin、p-GSK-3β表達的比較

3 討 論

五味子甲素是一種具有抗癌活性的木質素類化合物，提取自中藥五味子，對胰腺癌、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[6-8]，也有研究[9]報道能夠誘導膠質瘤細胞的細胞周期發(fā)生停滯。本實驗在使用五味子甲素處理胰腺癌PANC-1細胞后觀察到,細胞活力A490水平及細胞周期S期、G2/M期比例均降低，G0/G1期比例增加，表明五味子甲素能夠抑制胰腺癌細胞的增殖及細胞周期的進程，與既往關于五味子甲素具有抑癌活性的研究結果一致。本實驗采用五味子甲素聯合吉西他濱處理胰腺癌細胞后觀察到，細胞活力A490水平及細胞周期S期、G2/M期比例的降低及G0/G1期比例的增加均較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著。表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌的增殖，五味子甲素聯合吉西他濱能夠取得更強的抗胰腺癌作用。

有研究[3,7]顯示，五味子甲素能夠在胰腺癌、肺癌中抑制Bcl-2、增加Bax的表達；另有研究[8,10]顯示，五味子甲素能夠在甲狀腺癌、卵巢癌中抑制cyclinD1的表達。Bcl-2和Bax是調控線粒體對細胞色素C通透性的分子，前者抑制細胞色素C釋放、后者促進細胞色素C釋放，細胞色素C釋放后促進細胞凋亡、抑制細胞增殖[11]；cyclinD1參與細胞周期調控，能夠促進細胞快速通過細胞周期的檢查點并進行有絲分裂[12]。本實驗在用五味子甲素干預胰腺癌細胞后觀察到：Bcl-2、cyclinD1表達減少，Bax表達增加，與既往其他研究關于五味子甲素調控基因表達的結果一致；在五味子甲素聯合吉西他濱干預后，Bcl-2、cyclinD1表達減少及Bax表達增加均較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著，表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱調節(jié)胰腺癌細胞中增殖及細胞周期相關基因的表達，與其協(xié)同抑制細胞增殖及細胞周期的作用吻合。

本實驗還對五味子甲素發(fā)揮上述協(xié)同作用的分子機制進行了初步探究。本實驗在用五味子甲素及吉西他濱處理胰腺癌細胞后觀察到：細胞中β-catenin、p-GSK-3β的表達均明顯降低且五味子甲素聯合吉西他濱干預后，β-catenin、p-GSK-3β表達減少較單用五味子甲素或單用吉西他濱更顯著，表明五味子甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌細胞中β-catenin通路的激活，這可能是其協(xié)同發(fā)揮抗胰腺癌作用的分子機制。

綜上所述，五味子甲素具有協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌細胞增殖的作用，該作用與靶向抑制β-catenin通路有關，但β-catenin通路在五味子甲素聯合吉西他濱抗胰腺癌中的直接作用仍有待今后更多的研究來證實。