程安瑋，張夢(mèng)迪，王厚偉，孫金月，王新坤，劉 超，王 青，郭 溆

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 長(zhǎng)沙410128 2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南250100 3山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南250355）

炎癥的發(fā)生、發(fā)展是由眾多受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子共同參與的復(fù)雜反應(yīng)。炎癥介質(zhì)的生成是高耗能的過程，細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存的器官，還是重要的內(nèi)分泌器官。脂肪細(xì)胞可分泌多種炎性因子和脂肪因子，這些炎性與脂肪因子的異常分泌將對(duì)機(jī)體機(jī)能產(chǎn)生很大影響。代謝性炎癥是由脂肪組織的脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同發(fā)起和調(diào)控的，兩者協(xié)同的應(yīng)激反應(yīng)為炎癥的發(fā)生和發(fā)展提供了一個(gè)銜接口。

研究證明多酚類成分具有明顯的抗炎活性，而兒茶素是茶多酚中的主要功效成分，占總量的70%以上。炎性脂肪細(xì)胞模型的構(gòu)建，需要一定劑量的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為誘導(dǎo)劑。巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α 可作為炎性脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，是否與通過直接添加TNF-α 的作用效果一致？ 本文通過建立巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系，基于腺苷酸活化蛋白激酶/組蛋白去乙酰化酶（AMPK/SIRT1）信號(hào)通路，研究?jī)翰杷貙?duì)不同處理組中炎癥標(biāo)志物白介素（IL）與炎性酶基因表達(dá)水平的影響，以及對(duì)AMPK/SIRT1 磷酸化水平的影響，初步闡明兒茶素的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞 （GDC180）、小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞（No.GDC143），中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）。兒茶素標(biāo)品（純度≥98%）、胰島素（Inslulin）、甲基亞砜（DMSO），Solarbio 公司（北京）；小牛血清（FCS），Gibco 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、TNF-α，Sigma 公司（美國(guó)）；PBS 緩沖液，Hyclone 公司（美國(guó)）；EASYspin Plus 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒，昊鑫生物公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒、定量PCR 試劑（Rox），南京Vazyme 公司；RIPA 裂解液，碧云天公司；BCA 蛋白定量試劑盒，艾德萊公司；AMPK（Thr172）抗體、AMPKα 抗體、Sirt 1（Ser27）抗體、Sirt1 抗體，美國(guó)Abconal 公司。

1.2 儀器和設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（CCL-170A-8），ESCO 公司；倒置相差顯微鏡（CKX41），Olympus 公司；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），蘇凈安泰；低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（TDL-5），上海安亭科學(xué)儀器廠；臺(tái)式高速離心機(jī)（Centrifuge 5417），Eppendorf 公司；熒光定量PCR儀7500（ABI Stepone plus）、雙垂直電泳槽（DYCZ-24DN）、迷你雙轉(zhuǎn)印電泳槽（DYCZ-40D）、轉(zhuǎn)移電泳儀（DYY-7C）、多用脫色搖床（WD-9405B），北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（JD801），江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基（含10%FCS，1%青鏈霉素）調(diào)整巨噬細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，一組為純培養(yǎng)基，另一組培養(yǎng)基含終質(zhì)量濃度1 μg/mL LPS，放置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37 ℃）培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 緩沖液沖洗2 次。

1.3.2 3 T3-L1 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 用完全培養(yǎng)基（含10%FCS，1%青鏈霉素），調(diào)整脂肪細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL 置于六孔培養(yǎng)板中，接觸抑制培養(yǎng)2 d 后（即誘導(dǎo)分化第0 天），每孔加入含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX 和10 μg/mL Inslulin 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。分化到第2 天吸出1 mL 培養(yǎng)液，再加入1 mL 含有10 μg/mL Inslulin的FBS，第3 天重復(fù)1 次。以后每48 h 換液1 次，第10 天分化為成熟的脂肪細(xì)胞備用。

1.3.3 分組處理 共設(shè)4 個(gè)處理組，處理方式：1）N 組：脂肪細(xì)胞分化成熟后，培養(yǎng)基中分別加入含有終質(zhì)量濃度0，50，100 μg/mL 的兒茶素，標(biāo)記為N0、N50 和N100；2）T 組：成熟脂肪細(xì)胞用10 ng/mL TNF-α 誘導(dǎo)24 h 后，分別添加終質(zhì)量濃度為0，50，100 μg/mL 兒茶素，標(biāo)記為T0、T50 和T100；3）R 組：將成熟脂肪細(xì)胞與未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞于Transwell 培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24 h 后，分別添加終質(zhì)量濃度為0，50，100 μg/mL 兒茶素，標(biāo)記為R0、R50 和R100；4）L 組：將分化成熟的脂肪細(xì)胞與經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞于Transwell 培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24 h 后，分別添加終質(zhì)量濃度為0，50，100 μg/mL 兒茶素，標(biāo)記為L(zhǎng)0、L50 和L100。Transwell 培養(yǎng)板上層為巨噬細(xì)胞，下層為脂肪細(xì)胞，以上處理培養(yǎng)48 h，收集脂肪細(xì)胞備用。

1.3.4 熒光定量PCR 測(cè)定細(xì)胞因子基因的表達(dá)完全吸棄Transwell 板中的培養(yǎng)液，PBS 沖洗1次，收集脂肪細(xì)胞，RNA 提取按昊鑫生物公司試劑盒說明書操作。RNA 反轉(zhuǎn)錄按南京Vazyme 公司試劑盒說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：反應(yīng)管中加入XμL RNA、2 μL 5×HiScriptRII qRT Super-Mix II，輕混勻，然后25 ℃10 min，50 ℃30 min，85 ℃10 min，終止反應(yīng)后cDNA 保存于-20 ℃。利用合成的相應(yīng)基因的引物（序列見表1）進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系見表2。首先95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸40 s，共40 個(gè)循環(huán)。GAPDH 為內(nèi)參基因，對(duì)照組（N0）的2-（ΔΔCt）定義為1。

表1 定量PCR 的引物序列Table 1 The sequence of primers used for quantitative PCR

（續(xù)表1）

表2 定量PCR 反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of fluorescent quantitative PCR

1.4 Western blotting 測(cè)定AMPK/SIRT1 的磷酸化水平

收集的各處理細(xì)胞用冷PBS 溶液洗滌2 次，然后每孔加入200 μL PIPA 裂解液及2 μL 蛋白酶抑制劑，進(jìn)行蛋白提取。用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用12%SDS-PAGE 分離膠、5%濃縮膠分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%BSA 封閉1.5 h，加入1∶1 000 稀釋的一抗p-AMPK 和p-SIRT1，4 ℃孵育過夜，室溫下TBST 洗3 次，每次10 min，加入二抗稀釋液（1∶1 000）并與膜接觸，孵育1 h 后，TBST 再洗3 次，ECL 發(fā)光顯色試劑盒顯影成像。用凝膠圖象處理系統(tǒng)和ImageJ2 軟件分析目的條帶的凈光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中促炎性因子基因表達(dá)的影響

分別對(duì)不同處理組中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12 等促炎性因子基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析（圖1）。N 組中，兒茶素對(duì)IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-12 4 個(gè)因子的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響，這是因?yàn)橹炯?xì)胞沒有經(jīng)過TNF-α 的誘導(dǎo)分化，沒表現(xiàn)為炎性狀態(tài)，因此炎性因子的分泌量和基因表達(dá)水平較低。T 組中，脂肪細(xì)胞經(jīng)過TNF-α 誘導(dǎo)分化后呈炎性狀態(tài)，炎性因子的分泌及表達(dá)水平明顯上升，添加兒茶素后各因子的表達(dá)水平明顯被抑制，并且隨著添加質(zhì)量濃度的增加，抑制效果越明顯，呈劑量依賴關(guān)系。R 和L 組為巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)組，R 組中巨噬細(xì)胞未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)，然而分泌量的少量TNF-α 可將脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成炎性狀態(tài)，加入兒茶素后各因子變化趨勢(shì)同T 組。L 組中的巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)TNF-α 的分泌量更高，加入兒茶素后變化趨勢(shì)同T 和R 組。比較R 和L 2個(gè)共培養(yǎng)體系，經(jīng)LPS 和未經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α 的分泌量完全可將共培養(yǎng)體系中脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成炎性狀態(tài)，促使IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-12 促炎性因子的大量分泌和基因表達(dá)。

圖1 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中促炎性因子基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of catechin on the gene expression of pro-inflammatory factors in macrophage and adipocyte co-culture system

2.2 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中抗炎性因子基因表達(dá)的影響

進(jìn)一步分析了兒茶素對(duì)不同處理組中抗炎性因子IL-4 和IL-10 基因表達(dá)水平的影響（圖2）。不同處理組中，兒茶素對(duì)抗炎性因子影響的變化趨勢(shì)與促炎性因子的變化趨勢(shì)相反。N 組中，抗炎性因子的基因表達(dá)量最高，然而差異不明顯。T、R和L 組中，脂肪細(xì)胞經(jīng)過外源添加TNF-α 或者共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞分泌TNF-α 的誘導(dǎo)作用，抗炎性因子的基因表達(dá)量明顯降低；添加兒茶素后，隨著添加量的增加，抗炎性因子的表達(dá)量也明顯上升，呈劑量依賴關(guān)系。

圖2 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中抗炎性因子基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of catechins on the gene expression of anti-inflammatory factors in macrophage and adipocyte co-culture system

2.3 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中炎性酶基因表達(dá)的影響

測(cè)定了不同處理組中兒茶素對(duì)炎性酶iNOS、COX-2 基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果見圖3。各處理組中兒茶素對(duì)炎性酶影響的變化趨勢(shì)同促炎性因子一致。不添加兒茶素的4 個(gè)處理組中，與N0 相比，TNF-α 誘導(dǎo)的T0、R0、L0 處理中iNOS、COX-2 炎性酶基因的表達(dá)水平明顯上升。添加兒茶素后，炎性酶基因的表達(dá)明顯受到抑制，并且隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，抑制效果更加明顯。

圖3 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中炎性酶基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of catechins on the gene expression of inflammatory enzymes in macrophage and adipocyte co-culture system

2.4 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中AMPK/SIRT1 磷酸化水平的影響

由圖4結(jié)果表明，隨著兒茶素處理質(zhì)量濃度的增加，不同處理組中AMPK/SIRT1 的磷酸化水平明顯上升。共培養(yǎng)R 組、L 組同T 組相比，磷酸化水平更高，然而R 和L 兩組之間差異不明顯。從結(jié)果來看，兒茶素對(duì)AMPK 和SIRT1 磷酸化水平的影響變化趨勢(shì)基本一致，兩者呈協(xié)同作用。

圖4 兒茶素對(duì)巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系中AMPK/SIRT1 磷酸化水平的影響Fig.4 Effects of catechins on the AMPK/SIRT1 signal pathway enzymes in macrophage and adipocyte co-culture system

3 討論與結(jié)論

3T3-L1 細(xì)胞屬于小鼠源的成纖維細(xì)胞系，為前脂肪細(xì)胞，經(jīng)特殊的誘導(dǎo)分化劑作用后，可以分化為成熟的脂肪細(xì)胞。該脂肪細(xì)胞在預(yù)防代謝綜合征方面具有重要作用，慢性炎癥與肥胖、高血脂、糖尿病等代謝性疾病的相關(guān)性已經(jīng)逐漸成為學(xué)術(shù)界的共識(shí)。

3.1 炎性因子與炎癥反應(yīng)

炎性細(xì)胞因子是一類主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞生成的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性多肽，可介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)中起著重要作用。IL 是炎性細(xì)胞因子的重要一大類，IL-1、IL-6、IL-12 作為促炎性因子能夠激活炎癥反應(yīng)，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，IL-4 和IL-10 作為抗炎性因子下調(diào)炎癥反應(yīng)，能夠抑制前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生。iNOS 和COX-2 作為細(xì)胞中的炎性酶，在細(xì)胞受到刺激而被激活發(fā)揮著重要功效。褚武菁等[2]以3T3-L1 細(xì)胞為模型，證明胡柚乙醇提取物能明顯降低細(xì)胞中IL-6 的分泌量。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系中，巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α 可作為脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，兒茶素能明顯抑制促炎性因子IL-1、IL-6、IL-12 的基因表達(dá)，對(duì)炎性酶iNOS 和COX-2 的基因表達(dá)也呈抑制作用，然而對(duì)IL-4 和IL-10 的基因表達(dá)呈增加趨勢(shì)，都表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

3.2 AMPK/SIRT1 與炎癥反應(yīng)

AMPK 作為機(jī)體重要的能量代謝感受器，主要在糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。SIRT1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子基因家族成員之一[4]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，AMPK 被激活后可顯著減輕炎癥介質(zhì)的表達(dá)和組織的炎癥損傷，成為抗炎調(diào)節(jié)的一個(gè)新靶點(diǎn)[5-7]，若抑制AMPK 的活性，炎癥反應(yīng)增加；SIRT1 可通過減少炎性因子的產(chǎn)生及減輕炎性因子作用后的病理損傷來抑制炎癥反應(yīng)[5]。Sirt1 可去乙?；⒓せ罡渭っ窧1，后者通過磷酸化AMPK （Thr172） 并抑制磷酸化酶對(duì)AMPK 的去磷酸化作用從而使其激活[8]。Lee 等[9]研究證明，從大麥中分離的多酚可以激活A(yù)MPK 通路，進(jìn)而抑制促炎性因子TNF-α 及IL-6 的血漿水平；紅茶中的茶黃素-3，3’-二肉桂酸酯（theaflavin-3，3’-digallate） 通過AMPK 途徑抑制由脂肪-巨噬細(xì)胞交互引起的炎癥反應(yīng)[7]。多酚類物質(zhì)，如槲皮素、兒茶酚等通過激活SITR1 調(diào)控炎癥反應(yīng)[10-11]。本文的研究結(jié)果表明，兒茶素可激活不同處理組中AMPK 和SITR1 的磷酸化表達(dá)水平，并與劑量呈正相關(guān)。相同添加質(zhì)量濃度，共培養(yǎng)體系R 組和L 組細(xì)胞中AMPK 和SITR1 的磷酸化表達(dá)水平超過T 組。AMPK 和SIRT1 均對(duì)機(jī)體的能量狀態(tài)代謝敏感，兩者常常發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，AMPK 的抗炎效應(yīng)依賴SIRT1，AMPK 活性的改變影響到SIRT1 的含量及活性，兩者具有正相關(guān)性[5，12]。本試驗(yàn)的研究結(jié)論支持AMPK 和SIRT1 在抗炎作用中發(fā)揮著協(xié)同作用，并對(duì)AMPK 和SITR1 激活效應(yīng)呈量效關(guān)系。

通過巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究證明，兒茶素作為多酚中的一種重要成分，可經(jīng)由AMPK/SIRT1 信號(hào)途徑，通過抑制促炎性因子和炎性酶的基因表達(dá)，促進(jìn)抗炎性因子的基因表達(dá)發(fā)揮明顯的抗炎作用，這對(duì)預(yù)防和治療代謝綜合征等方面具有重要作用。