李詩佳 陳秋宇 鄒靜 黃睿潔

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心

四川大學華西口腔醫(yī)院兒童口腔科 成都610041

尼古丁是一種存在于煙草中的生物堿，約占煙草干重的0.6%~3.0%。尼古丁可以侵入人體的多種系統(tǒng)，導致心血管疾病、癌癥和其他系統(tǒng)性疾病[1]。同時，尼古丁也可促進口腔疾病，如口腔癌、牙周病和齲齒[2]的發(fā)生。健康口腔具有高度的多樣性和特異性，具有獨特的口腔核心微生物群[3]。2005年，Aas等[3]檢測口腔正常菌群，結果發(fā)現(xiàn)：正?？谇恢杏?00多種細菌或系統(tǒng)類型，其中大多數(shù)細菌于人類而言是友好的共生菌，是維持健康重要的組成部分。一些學者[4]曾提出：有益菌和致病菌之間的競爭導致了人類的健康或疾病狀態(tài)。Ebersole等[5]發(fā)現(xiàn)：吸煙者菌群變化較大，如鏈球菌屬、嗜酸性細菌屬、口桿菌屬和真細菌屬明顯增多，而纖細菌門和螺旋體菌門的數(shù)量明顯減少。Shiloah等[6]還發(fā)現(xiàn)：吸煙的量會影響口腔致病菌的定植量。在常見口腔細菌的體外實驗中，尼古丁對變異鏈球菌的研究較多。前期研究[7-8]發(fā)現(xiàn)：尼古丁可以促進變異鏈球菌和格氏鏈球菌生物膜的形成和生物膜的代謝活性。當血鏈球菌和變異鏈球菌單獨培養(yǎng)時，尼古丁可以同時促進2種菌的生長；而2種菌混合培養(yǎng)時，隨尼古丁質(zhì)量濃度的增加，變異鏈球菌的相對數(shù)量增加而血鏈球菌的數(shù)目下降，提示尼古丁的質(zhì)量濃度和其他細菌的存在均可影響細菌的生長[9]。除了尼古丁會對細菌數(shù)量產(chǎn)生影響，在混合菌種情況下，細菌相互之間也存在競爭關系。Kreth等[10]發(fā)現(xiàn)：變異鏈球菌對格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、血鏈球菌的抑制活性顯著，對口腔鏈球菌的抑制活性中等；同樣，血鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌也可抑制變異鏈球菌的生長，但抑制原理和抑制強度有所不同，血鏈球菌和格氏鏈球菌通過產(chǎn)生過氧化氫抑制變異鏈球菌的生長[11]，而口腔鏈球菌則通過更快的繁殖速度與變異鏈球菌競爭[12]。

由于口腔細菌種類繁多，相互作用復雜，在多菌群環(huán)境中尼古丁是否會改變菌群平衡，是否依然可以促進變異鏈球菌的生長不詳。本研究擬采用混合模型模擬口腔菌群狀態(tài)，研究尼古丁對包括變異鏈球菌在內(nèi)的細菌的影響。由于口腔細菌種類繁多，本研究主要納入口腔常見共生菌細菌（格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌）、口腔齲病及牙髓病細菌（變異鏈球菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌）和口腔內(nèi)檢出率較低的卻具備潛在致病能力的細菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌）。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 實驗菌株 變異鏈球菌（ATCC 700610/UA159）、格氏鏈球菌（ATCC 35105）、緩癥鏈球菌（ATCC 49456）、口腔鏈球菌（ATCC 35037）、唾液鏈球菌（ATCC 27975）、血鏈球菌（SK36）、金黃色葡萄球菌（COL）、糞腸球菌（ATCC 29212）、干酪乳桿菌（ATCC 393）、表皮葡萄球菌（PR62A）。

1.1.2 培養(yǎng)條件 細菌解凍前，在25%的甘油中凍存于-80 ℃。細菌復蘇于心腦浸液（brain heart in‐fusion，BHI）加0.5%酵母提取物（yeast extract，YE）并含5%羊血的平板上。如無特殊說明，細菌的培養(yǎng)及浮游細菌的檢測使用BHI+5%YE培養(yǎng)基。在細菌的生物膜培養(yǎng)中，使用BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基。在厭氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，氣體環(huán)境為5%CO2、85%N2、10%H2，37 ℃。

1.2 方法

1.2.1 確定尼古丁分別對10 種單獨培養(yǎng)細菌浮游細 胞 的 影 響 1×107CFU·mL-1［CFU （colonyforming units）為菌落形成單位］細菌在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+5%YE培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)24 h，氣體環(huán)境為5% CO2、85% N2、10%H2，37 ℃。后利用Molecular Devices Spectra‐Max 190酶標儀測細菌每孔的光密度（optical den‐sity，OD）（OD595nm），每個質(zhì)量濃度平行重復3次。

1.2.2 確定尼古丁分別對10 種混合培養(yǎng)細菌浮游細胞的影響 各自密度為1×106CFU·mL-1的10種細菌混合后（混合后總菌液密度為1×107CFU·mL-1），在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+5%YE培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)24 h，氣體環(huán)境為5% CO2、85%N2、10%H2，37 ℃。每個質(zhì)量濃度平行重復3次。參考Huang等[13]設計的10種細菌的特異性引物（表1）來擴增特異性序列。24 h培養(yǎng)結束后，離心并收集細菌，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次。每個樣品加入DNeasy 96 Blood&Tissue Kit（QIAGEN公司，美國）的Buf‐fer AL，然后超聲震蕩10 s（52%振幅，聲波分解器，模式500），在冰上重復5次。其余DNA提取步驟按照制造商的指示進行。使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美國）檢測DNA的數(shù)量和質(zhì)量。使用特異性引物（0.25 μmol·mL-1）和TaKaRa Taq 聚 合 酶（Chemicon International 公司，美國）擴增每個菌株的總DNA（100 ng）。初始化步驟為94 ℃、5 min，擴增步驟為30個循環(huán)，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，最終延伸步驟為72 ℃、10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認、證明。細菌定量前，參考Huang等[13]的報道繪制Ct-CFU標準曲線[13]，后根據(jù)Ct值計算混合菌群中各菌數(shù)量。

表1 10種細菌的特異性引物Tab 1 Specific primers for ten bacteria species

1.2.3 確定尼古丁分別對10 種單獨培養(yǎng)細菌生物膜的影響 1×107CFU·mL-1細菌在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)24 h，氣體環(huán)境為5%CO2、85%N2、10%H2，37 ℃，每個質(zhì)量濃度平行重復3次。培養(yǎng)結束后，棄去上清液，保留孔板底部生物膜。PBS輕輕洗滌生物膜2次，4%甲醇固定生物膜30 min，PBS輕輕洗滌清除甲醇，用1%結晶紫溶液染色20 min，PBS輕輕洗滌3次，以去除盡未黏附的結晶紫，室溫晾干后加入無水乙醇靜置20 min，然后將含有從生物膜中萃取結晶紫的乙醇溶液轉移到新的96孔板中，于酶標儀上檢測其光密度（OD490nm）。

1.2.4 確定尼古丁分別對10 種混合培養(yǎng)細菌生物膜的影響 各自密度為1×106CFU·mL-1的10種細菌混合后（混合后總菌液密度為1×107CFU·mL-1），在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基中，于96孔板中培養(yǎng)24 h，氣體環(huán)境為5%CO2、85% N2、10% H2，37 ℃，每個質(zhì)量濃度平行重復3次。培養(yǎng)結束后，棄去上清液，保留孔板底部生物膜，PBS輕輕洗滌生物膜2次，如1.2.2提取總DNA，行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴增，并計算混合菌群中各菌數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學處理

每項實驗都獨立重復3次以上，統(tǒng)計方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行單因素的方差分析，使用post-hoc進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 單獨培養(yǎng)浮游細胞的情況

實驗的10種菌其浮游細胞生長情況多表現(xiàn)為尼古丁依賴。其中，在尼古丁存在的情況下，格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌和干酪乳桿菌浮游細胞的生長明顯受到促進，且尼古丁的質(zhì)量濃度為0~4 mg·mL-1，浮游細胞的數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關。變異鏈球菌、唾液鏈球菌和表皮葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁存在時變化不明顯，金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著下降。血鏈球菌浮游細胞數(shù)量在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時明顯增加，在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時則呈下降趨勢（圖1）。

2.2 混合培養(yǎng)浮游細胞的情況

混合培養(yǎng)浮游細胞時，在尼古丁存在的情況下，格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、唾液鏈球菌、表皮葡萄球菌的浮游細胞數(shù)量明顯增加，且格氏鏈球菌、唾液鏈球菌、表皮葡萄球菌浮游細胞數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關（0~4 mg·mL-1）。干酪乳桿菌浮游細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯減少，且與尼古丁質(zhì)量濃度呈負相關。變異鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌數(shù)量無顯著改變。血鏈球菌、金黃色葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時無顯著變化，在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時增加（圖2）。

在混合培養(yǎng)的10種浮游細胞中，表皮葡萄球菌數(shù)量極低。糞腸球菌和口腔鏈球菌浮游細胞數(shù)量最多，在各種尼古丁質(zhì)量濃度下約占浮游細胞總量的80%，且隨尼古丁質(zhì)量濃度增加，其占比略微下降。干酪乳桿菌、變異鏈球菌和血鏈球菌數(shù)量最少，這3種細菌浮游細胞數(shù)量之和在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占浮游細胞總量不足5%，且隨尼古丁質(zhì)量濃度增加，其占比略微升高。變異鏈球在各尼古丁質(zhì)量濃度組均為1%左右。格氏鏈球菌、唾液鏈球菌的占比隨尼古丁質(zhì)量濃度增加而增高。緩癥鏈球菌的占比在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時增高，在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時降低（圖2、3）。

圖 1 10種細菌單獨浮游培養(yǎng)24 h后的生長情況Fig 1 Growth of 10 species of bacteria after individual planktonic culture for 24 h

圖 2 10種細菌混合浮游培養(yǎng)24 h后的生長情況Fig 2 Growth of 10 species of bacteria after mixed planktonic culture for 24 h

圖 3 經(jīng)不同質(zhì)量濃度尼古丁處理的10種細菌混合浮游細胞培養(yǎng)24 h后數(shù)量的占比情況Fig 3 Proportion of 10 species of bacteria after mixed planktonic culture for 24 h with different concentrations of nicotine

2.3 單獨培養(yǎng)生物膜細胞的情況

與細菌單獨培養(yǎng)浮游細胞的情況相似，實驗的10種細菌其生物膜形成情況多表現(xiàn)為尼古丁依賴。變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、表皮葡萄球菌生物膜形成情況在尼古丁存在時明顯受到促進，且其促進作用與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關。緩癥鏈球菌生物膜形成在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時無顯著改變，在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時有抑制趨勢（差異無統(tǒng)計學意義）。金黃色葡萄球菌生物膜形成情況在尼古丁存在時明顯受到抑制。糞腸球菌生物膜形成情況與尼古丁無明顯相關（圖4）。

圖 4 10種細菌單獨培養(yǎng)24 h后生物膜的形成情況Fig 4 Biofilm formation of 10 species of bacteria after individual culture for 24 h

2.4 混合培養(yǎng)生物膜細胞的情況

混合培養(yǎng)生物膜細胞時，變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌的生物膜細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯增加，且變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌生物膜細胞數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關（0~4 mg·mL-1）。在尼古丁存在時，緩癥鏈球菌、金黃色葡萄球菌生物膜細胞數(shù)量呈減少趨勢，干酪乳桿菌生物膜細胞數(shù)量顯著減少，且這3種菌都與尼古丁質(zhì)量濃度呈負相關（圖5）。

在混合培養(yǎng)的10種生物膜細胞中，表皮葡萄球菌數(shù)量極低?？谇绘溓蚓图S腸球菌生物膜細胞數(shù)量最多，在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量超過80%?？谇绘溓蚓疃?，隨尼古丁質(zhì)量濃度增加，其占比下降；其次為糞腸球菌，隨尼古丁質(zhì)量濃度增加，其占比升高。唾液鏈球菌在無尼古丁存在的情況下占生物膜細胞總量的9%，其占比在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時輕微增高，在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時輕微降低。變異鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌數(shù)量最少，這5種細菌生物膜細胞數(shù)量之和在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量不超過6%（圖5、6）。

圖 5 10種細菌混合培養(yǎng)24 h后生物膜的形成情況Fig 5 Biofilm formation of 10 species of bacteria after mixed culture for 24 h

圖 6 經(jīng)不同質(zhì)量濃度尼古丁處理的10種細菌混合培養(yǎng)24 h后生物膜的占比情況Fig 6 Proportion of biofilm of 10 species of bacteria after mixed culture for 24 h with different concentrations of nicotine

3 討論

現(xiàn)代口腔生物學認為，齲病在本質(zhì)上是口腔菌群生態(tài)失衡導致的。在外來致病因素的影響下，牙菌斑內(nèi)致齲菌的比例將會異常升高，而有益菌的比例則會隨之下調(diào)[14]。吸煙是導致齲病的重要原因之一，作為煙草的主要成分，尼古丁在齲病發(fā)生、發(fā)展過程中有其獨特的病理作用，其機制可能是尼古丁刺激變異鏈球菌浮游細胞葡糖基轉移酶（glucosyltransferase，Gtf）和葡聚糖結合蛋白（glucan-binding protein，Gbp）的表達，導致更多的浮游細胞附著在牙齒生物膜上，從而促進齲病的發(fā)展[15]。口腔微環(huán)境十分復雜，與齲病相關的病原菌多種多樣，細菌之間也存在競爭、共生等密切的相互作用[16]，因此，研究尼古丁對混合菌群的作用是非常重要的。本實驗選取10種口腔中具有代表性的細菌種類進行研究，對以往實驗進行了有力的拓展與補充。

如上所述，細菌在口腔中有浮游細胞和生物膜細胞2種形式，兩者蛋白質(zhì)表達不盡相同，代謝活動也有所差異[17]。在真實的口腔環(huán)境中，生物膜是大多數(shù)細菌的首選生長形式，因此，研究尼古丁對口腔致齲菌生物膜的影響是十分必要的。結果顯示：在尼古丁培養(yǎng)時，變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、表皮葡萄球菌生物膜形成情況明顯受到促進，其中變異鏈球菌、干酪乳桿菌等致齲菌的活躍可能在一定程度上解釋了吸煙者患齲的風險更高。相比之下，尼古丁誘導浮游細胞生長上調(diào)的能力似乎不那么顯著。變異鏈球菌、唾液鏈球菌和表皮葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁存在的情況下變化并不明顯?？梢钥闯觯峁哦≡鰪娚锬ぜ毎L的能力更顯著和普遍。

在混合菌群的培養(yǎng)中，口腔鏈球菌和糞腸球菌生物膜細胞數(shù)量最多，在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量超過80%，其中口腔鏈球菌最多，這可能是因為口腔鏈球菌的傳代時間較短，在相同的時間內(nèi)繁殖的代數(shù)多，有利于其與其他菌種的競爭。變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌的生物膜細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯增加，且與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關，這說明在混合菌群中，尼古丁依然能使變異鏈球菌等致齲菌的數(shù)量上調(diào)，這比單獨培養(yǎng)更能體現(xiàn)尼古丁在復雜口腔環(huán)境中的作用。這些菌在混合菌群中的相互作用值得關注，Kreth等[10]的研究顯示：在營養(yǎng)豐富的生長條件下，如蔗糖環(huán)境，血鏈球菌和變異鏈球菌之間沒有抑制作用?；旌吓囵B(yǎng)中格氏鏈球菌的絕對細胞數(shù)量也因尼古丁的作用而增加，這些增加的格氏鏈球菌細胞既能產(chǎn)生更多的過氧化氫抑制變異鏈球菌的生長，也能為變異鏈球菌的附著提供更多的結合位點[10]。值得一提的是，作為齲病的重要病原菌，干酪乳桿菌在浮游和生物膜混合培養(yǎng)中，數(shù)量均顯著減少，這意味著尼古丁的存在對干酪乳桿菌的生長不利，但具體的機制還待進一步探索。

總結和比較本實驗和國內(nèi)外關于細菌種類細胞數(shù)量變化的研究?？偟膩碚f，尼古丁對大部分的菌都有促進作用，但促進程度不同，當混合培養(yǎng)時，尼古丁在促進細菌的同時也會調(diào)節(jié)菌群各種之間的比例，因而尼古丁對各菌的作用在混合培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)中是不同的。其中，尼古丁對變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌3種菌的促進作用最明顯，在單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)情況下，其浮游細胞和生物膜細胞數(shù)量均增加，而對其他細菌的促進作用受細菌狀態(tài)影響較大。因此，尼古丁導致口腔菌群朝利于致齲菌群生長的方向發(fā)展，進而增加了吸煙者的齲風險。當然，由于本研究中納入的細菌同種類數(shù)量與人類口腔微生物組相差甚遠，目前的研究只是一個多物種研究的試點研究，進一步的研究會包括更多的細菌種類和優(yōu)化生長條件。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。