胥欣欣， 王春迪， 陳 帥， 高曉冬

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

在真核生物中，N-糖基化是一個高度保守的蛋白質(zhì)修飾過程[1-3]。 該過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，起始于多萜醇寡糖前體 （Dolichol Linked Oligosaccharide，DLO）的生物合成，其中14 個單糖依次轉(zhuǎn)移到多萜醇焦磷酸 （PP-Dol） 基團(tuán)上形成核心寡糖前體Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol[2，4-7]。 一系列ER 膜上的糖基轉(zhuǎn)移酶（GTases）統(tǒng)稱為Alg（Asparagine-linked glycosylation）蛋白，有序催化DLO 的合成[1，8-9]。 DLO合成的前7 個反應(yīng)發(fā)生在ER 的胞質(zhì)側(cè)， 生成Man5GlcNAc2-PP-Dol 中間體， 隨后會翻轉(zhuǎn)至ER腔內(nèi)進(jìn)一步被延伸[10]。 最終，寡糖基轉(zhuǎn)移酶（OST）會將DLO 寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生多肽Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺（Asn）殘基上（X 指除脯氨酸外的氨基酸）[11]。

在N-糖基化途徑中，ALG2 基因編碼的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶具有雙功能，催化第二和第三個甘露糖的添加，即以GDP-mannose 為供體，向ManGlcNAc2-PP-Dol 添加α-1，3 和α-1，6 連鍵的甘露糖， 形成分支結(jié)構(gòu)的Man3GlcNAc2-PP-Dol[12-15]。有文獻(xiàn)報道Alg1、Alg2 和Alg11 會形成異聚復(fù)合體共同參與胞質(zhì)側(cè)甘露糖的添加[16-17]。 最初，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 中， 研究人員通過篩選獲得一種溫度敏感性突變體alg2-1，它在限制性溫度下會積累脂連的Man2GlcNAc2[18]，表明alg2-1 的糖基轉(zhuǎn)移酶存在缺陷， 無法催化α-1，6 甘露糖的添加，繼而通過回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)克隆得到ALG2 基因[19]。 關(guān)于人類ALG2-CDG 疾病相關(guān)突變體的報道也表明，ALG2 基因是添加α-1，3 連接的甘露糖所必需的[20]。利用表達(dá)ScAlg2 的大腸桿菌膜組分，Alg2 的雙功能性得到了初步鑒定，后續(xù)研究中也進(jìn)一步利用酵母微粒體膜部分制備的ScAlg2 和純化的TrxAScAlg2 證明了其可以轉(zhuǎn)移α-1，3/1，6 連鍵的甘露糖，會以不同的催化速率同時合成α-1，3 或α-1，6連鍵Man2GlcNAc2PP-Dol 兩種中間體[12-13，21]。 最近研究人員成功地將從人類胚胎腎（HEK）293 細(xì)胞中純化的hAlg2 應(yīng)用于化學(xué)酶法生產(chǎn)Man5GlcNAc2-PP-Dol 類似物[22]。

然而， 用動物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)成本相對較高。目前， 在大腸桿菌中表達(dá)hAlg2 的相關(guān)研究鮮有報道。 在真核細(xì)胞中，Alg2 的天然底物是Man1GlcNAc2-PP-Dol。 多萜醇（Dolichol）的碳鏈較長，使得該天然底物的合成和純化難度較高。 有研究表明，GlcNAc2-PP-Phytanyl （PPGn2） 可被用作Alg1 天然底物的替代物[23]。因此，使用碳鏈短且結(jié)構(gòu)相似的植烷醇（Phytanol）替代天然底物中的多萜醇是目前的極佳選擇。 作者所在課題組曾在大腸桿菌中表達(dá)了酵母來源的重組蛋白Alg1ΔTM，詳細(xì)闡明了其酶學(xué)性質(zhì)， 并成功合成了Man1GlcNAc2-PPPhy（PPGn2M1）[24]作為hAlg2 的底物用以研究其體外活性。

作者利用釀酒酵母生長表型回補(bǔ)系統(tǒng)，對hALG2 基因的體內(nèi)功能和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了分析。此外，利用原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單，成本低廉的特點(diǎn)， 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了TrxA-hAlg2 重組蛋白， 并進(jìn)行了分離純化。 結(jié)合基于LC-MS 的Alg-MTase 體外活性測定法[21，24-26]，對純化的TrxA-hAlg2進(jìn)行了體外的活性測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 釀酒酵母w303a 模式菌株：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌克隆宿主細(xì)胞XL10-Gold：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；用于原核表達(dá)的大腸桿菌感受態(tài)Rosetta （DE3） 和用于原核表達(dá)的載體pET28a 和pET32a： 購于默克密理博公司；質(zhì)粒YEp351GAPII 和pRS315：作者在實(shí)驗(yàn)室保藏。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10；TBK 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物24，胰蛋白胨12，三水合磷酸氫二鉀16.4，磷酸二氫鉀2.31；加入體積分?jǐn)?shù)0.4%的甘油。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可在相應(yīng)的培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度100 μg/mL 氨芐霉素或34 μg/mL 氯霉素。

YPAD/YPAG 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物10，蛋白胨20， 腺嘌呤0.03；SD/SG 缺陷型培養(yǎng)基（g/L）：YNB 6.7，氨基酸缺陷粉末2。YPAD 或SD 中額外加入終質(zhì)量濃度2 g/dL 的葡萄糖；YPAG 或SG 中額外加入終質(zhì)量濃度2 g/dL 的半乳糖。

1.1.2 主要試劑和儀器 PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、Mighty Mix DNA 連接酶、 一系列限制性內(nèi)切酶：購于寶生物工程（大連）公司；GoldView I 型核酸染色劑：購于索萊寶公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），PCR 產(chǎn)物純化、DNA 膠回收和DNA 小量抽提試劑盒：購于生工生物工程（上海）公司；BCA蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE 蛋白凝膠制備試劑盒： 購于碧云天生物公司；Protease inhibitor cocktail、Anti-FLAG Mouse mAb： 購于西格瑪公司；Anti-Dpm1 Mouse mAb： 購于艾博抗公司；Anti-His Mouse mAb、Goat Anti-Mouse IgG HRP、Blue Plus II Protein Marker、1 kb Plus DNA Ladder： 購于全式金生物公司；PCR 儀、凝膠成像儀、半干電轉(zhuǎn)儀：購于伯樂公司；1 mL HisTrap HP 親和層析柱、ImageQuantTMLAS 4000 mini 顯 像 儀： 購 于GE healthcare 公司；NanoDrop2000、 三重四極桿液質(zhì)連用儀： 購于賽默飛公司； 液相色譜柱粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm：購于沃特世公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液 Lysis buffer （酵母細(xì)胞裂解液）：0.2 mol/L 山梨醇，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）；5×Sample buffer （蛋白質(zhì)上樣緩沖液）：10 g/dL SDS，0.5 g/dL 溴酚藍(lán)，250 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），體積分?jǐn)?shù)50%甘油，5 g/dL β-巰基乙醇；Running buffer（蛋白質(zhì)RFM 電泳緩沖液）：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），192 mmol/L 甘氨酸，0.1 g/dL SDS；Transfer buffer（轉(zhuǎn)膜緩沖液）：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），192 mmol/L 甘氨酸， 體積分?jǐn)?shù)20%甲醇；TBST （洗膜緩沖液）：137 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl （pH 7.6）， 體 積 分 數(shù)0.05%Tween-20；Buffer A （E. coli 裂 解 液）：150 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；Buffer B（平衡緩沖液）：150 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），體積分?jǐn)?shù)0.3% Triton X-100；在Buffer B 的基礎(chǔ)上，按咪唑濃度20、60、500 mmol/L 配制梯度洗脫緩沖液；Buffer C （除鹽液）：50 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）， 體積分?jǐn)?shù)5%甘油；Buffer D （活性反應(yīng)液）：38 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），1.8 mmol/L DTT，0.28 mmol/L EDTA，0.26 g/dL NP40。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒YEp351GAPII-FLAGhALG2 的構(gòu)建如下：以人cDNA 為模板，X22：CGGG AGCTCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGCT CGAGGCGGAGGAGCAGGGCCGGG 和X23：GCTCT AGATTATACCAGCAGTTTGGTAAC 為上下游引物（劃線部分依次為Sac I 和Xba I 酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增目的基因FLAG-hALG2。 經(jīng)Sac I 和Xba I 雙酶切后，將片段連入相同酶切的YEp351GAPII。

質(zhì)粒pRS315-ALG2pr-FLAG-hALG2-ALG2ter的構(gòu)建如下：以YEp351GAPII-FLAG-hALG2 為模板，X48：TGCTCTAGAATGGACTACAAAGACGATGA 和X19：AAAAAAGCTTTTATACCAGCAGTTTGGTAAC為上下游引物，擴(kuò)增基因FLAG-hALG2。經(jīng)Xba I 和Hin d III 雙酶切后， 片段連入相同酶切的pRS315-ALG2pr-ALG2ter。

質(zhì)粒pET32a-hALG2的構(gòu)建如下：以YEp351GAPIIFLAG-hALG2 為 模 板，X17：CGCGGATCCGCGGAG GAGCAGGGCCGGGA 和X19：AAAAAAGCTTTTAT ACCAGCAGTTTGGTAAC 為上下游引物， 擴(kuò)增基因hALG2。 經(jīng)Bam H I 和Hin d III 雙酶切后，片段連入相同酶切的pET32a。

1.2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的構(gòu)建 以pFA6a-His3MX6-PGAL1 為模板，X33：TAGATACA GTAGTAAAGACAGATAAAAAAGAGTCGATTAGAC AAGCAAAAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 和X34：CCTAGGTCTGGATGAATAAAAGCAATCGTTCTTTT ATCCTTTTCAATCATTTTGAGATCCGGGTTTT 為上下游引物， 擴(kuò)增含有釀酒酵母ALG2 啟動子區(qū)域同源臂和半乳糖啟動子的基因片段。 經(jīng)乙醇沉淀法提取后， 線性轉(zhuǎn)化至野生型酵母w303a 中， 涂布至SD-HIS 缺陷型固體培養(yǎng)基上。 陽性轉(zhuǎn)化子由菌落PCR 和基因組PCR 驗(yàn)證后獲得， 上游引物F：CCATAGGATGATAATGCG，下游引物R：TTATATTT CTTCATAAGG。

1.2.3 酵母點(diǎn)板實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞，OD600在1～3 之間均可。根據(jù)分光光度計測量的菌體OD 值， 計算并調(diào)節(jié)每個樣品的起始OD 數(shù)相同，用去離子水按10 倍稀釋，共4 個梯度，每個梯度分別取5 μL， 依次點(diǎn)于YPAD 或YPAG 固體培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)36 h。

1.2.4 酵母蛋白質(zhì)的提取 取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞，OD600在1～3 之間均可， 收集6～7 個OD 單位的細(xì)胞，用1 mL 去離子水洗滌一次。 加入200 μL Lysis buffer 重懸，同時加入適量0.3～0.4 mm 規(guī)格玻璃珠1×Protease inhibitor cocktail；振蕩1 min，冰上1 min，重復(fù)10 次，以下步驟在4 ℃下進(jìn)行。 1 000 g離心5 min，去除未破碎細(xì)胞和細(xì)胞碎片。 取上清液200 μL，3 000 g 離心5 min， 進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核組分，取上清液180 μL 為全細(xì)胞蛋白質(zhì)；13 000 g 離心30 min， 取沉淀為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分，用180 μL Lysis buffer 重 懸。 蛋 白 質(zhì) 濃 度 用NanoDrop2000 測定。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將含有原核表達(dá)載體pET32a-hALG2 的大腸桿菌Rosetta（DE3）單克隆轉(zhuǎn)化子，接種于5 mL 含氨芐霉素和氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜。 次日，轉(zhuǎn)接2 mL 過夜培養(yǎng)的菌液至200 mL 含卡那霉素和氯霉素的TBK 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)3 h 左右。 測得菌體A600nm達(dá)到0.6～0.8 后，16 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)1 h。最后加入終濃度0.1 mmol/L IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。

離心收集所有菌體，20 mL BufferA 重懸后冰上超聲破碎；4 000 g 離心20 min， 去除細(xì)胞碎片；取上清液20 000 g 離心90 min，取沉淀重懸于10 mL Buffer B，靜置30 min；12 000 g 離心30 min，得上清液為膜蛋白，以上過程在4 ℃下完成。

用10 mL Buffer B 過His Trap HP（1mL）親和層析柱，平衡；取上清液膜蛋白過柱，上樣；10 mL Buffer B 去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)； 分別用10 mL 含20、60 mmol/L 咪唑和含500 mmol/L 咪唑+體積分?jǐn)?shù)5%的甘油的BufferA 依次洗脫并收集至離心管，利用SDS-PAGE 檢測純化蛋白質(zhì)。 最后，將含純化的蛋白質(zhì)洗脫液加至Amicon Ultra 10 K NMWL 濃縮管， 離心濃縮， 并以BufferC 除鹽。 蛋白質(zhì)濃度由BCA 試劑盒檢測。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 取適量蛋白質(zhì)樣品，加入對應(yīng)5×Sample buffer 后混勻，95 ℃處理5 min。根據(jù)不同樣品的蛋白質(zhì)濃度，計算并保持所有蛋白質(zhì)上樣量的一致。 裝配電泳裝置， 加注適量1×running buffer 后上樣和蛋白質(zhì)Marker， 在180 V 恒壓條件下運(yùn)行80 min。 電泳完成后采用半干法轉(zhuǎn)膜，條件設(shè)置為25 V、0.1 A、30 min。 轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜浸于含5 g/dL 脫脂奶粉的TBST 中封閉， 室溫放置1～2 h。 一抗/二抗均稀釋于含5 g/dL 脫脂奶粉的封閉液中，一抗稀釋比例1∶3 000，二抗稀釋比例1∶5 000。 封閉完成后取出PVDF 膜，按順序加入相應(yīng)一抗、二抗，抗體孵育時間為室溫1～2 h 或4 ℃過夜。 抗體孵育完成后， 用TBST 洗滌PVDF 膜10 min，重復(fù)3 次。 取適量ECL 顯示劑A 液和B 液，以體積比1∶1 混勻。將顯色液均勻散布在PVDF 膜上，靜置1 min， 用Image Quant LAS 4000 mini 進(jìn)行自動曝光拍攝。

1.2.7 體外活性反應(yīng)體系 PPGn2M1 的合成詳見文獻(xiàn)[24]。 加入終濃度50 μmol/L PPGn2、2 mmol/L GDP-Man、10 mmol/L MgCl2至Buffer D 中， 終體系為100 μL，加入2 μg 純化的Alg1NΔTM，30 ℃靜置孵育1 h， 得TrxA-hAlg2 的底物PPGn2M1。 對于TrxA-hAlg2 的反應(yīng)，取上述反應(yīng)液50 μL，直接加入2.5 μg 純化的TrxA-hAlg2，30 ℃靜置孵育1 h。

1.2.8 LC-MS 檢測糖鏈 向反應(yīng)體系加入等體積20 mmol/L 鹽酸，100 ℃終止反應(yīng)， 同時酸解釋放脂肪鏈上的糖鏈后，利用Supelclean ENVI-Carb Slurry對糖鏈進(jìn)行固相萃??； 純化所得糖鏈經(jīng)冷凍干燥后，用去離子水重懸；通過超效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000 UPLC 自動進(jìn)樣到氨基色譜柱UPLC BEH Amide Column（粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm）中，乙腈線性梯度洗脫（溶液A：乙腈；溶液B：去離子水）。洗脫條件：0～2 min 體積分?jǐn)?shù)20%B；2～15 min，體積分?jǐn)?shù)20%～50% B；15～18 min， 體積分?jǐn)?shù)50%B；流量：0.2 mL/min。 分離所得底物和產(chǎn)物，再經(jīng)由ESI-MS 儀器TSQ Quantum Ultra 在正離子模式下同步檢測相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 人源Alg2 蛋白的疏水性預(yù)測

釀酒酵母Alg2（ScAlg2）的N 端含兩個跨膜結(jié)構(gòu)域，C 端兩個疏水序列以非跨膜方式和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合[13]。 利用在線軟件TMpred（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html） 對hAlg2 進(jìn)行跨膜預(yù)測，結(jié)果見圖1。 hAlg2 僅在N 端具有一個疏水性區(qū)域，位于氨基酸85-104 位，是潛在的惟一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合域。

hAlg2 這種膜結(jié)合形式與ScAlg2 呈現(xiàn)出明顯的差異， 這也就引出了hAlg2 在釀酒酵母中或在大腸桿菌中表達(dá)并純化后，是否和ScAlg2 之間存在差異的疑問。

2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的鑒定

在釀酒酵母中，ALG2 是必需基因，直接敲除會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 因此，難以實(shí)現(xiàn)通過基因敲除獲得完全無ALG2 基因背景的菌株。 通過基因改造母株w303a 獲得的菌株w303a-GAL1pr-ALG2， 見圖2（a）。其基因組上ALG2 自身啟動子（ALG2pr）由半乳糖啟動子（GAL1pr）取代。該菌株在半乳糖培養(yǎng)基中，ALG2 基因會被表達(dá)，細(xì)胞能夠正常生長；在葡萄糖培養(yǎng)基中，ALG2 基因會被抑制表達(dá)， 細(xì)胞會死亡。通過觀察XGY29 在葡萄糖培養(yǎng)基上的生長表型，可以判斷在菌株中外源表達(dá)的基因是否具有體內(nèi)活性。

以圖2（a）中所示F、R 為上下游引物，取菌落PCR 驗(yàn)證正確的1 號、2 號單菌落基因組后進(jìn)一步PCR 驗(yàn)證，均得位于1 500～2 000 bp 之間的單一條帶，和理論大小1 753 bp 相符；而野生型（WT）中由于不含引物F 序列，無法擴(kuò)增出目的帶（圖2（b））。將w303a-GAL1pr-ALG2 （1 號） 和w303a 點(diǎn)板于YPAD 固體培養(yǎng)基上，前者表現(xiàn)出明顯的生長缺陷，即其無法在含有葡萄糖的條件下生長（圖2（c））。這些結(jié)果說明w303a-GAL1pr-ALG2 菌株構(gòu)建成功。

圖1 hAlg2 蛋白的TMpred 跨膜預(yù)測Fig. 1 Transmembrane prediction of hAlg2 protein using TMpred

2.3 h ALG2 在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中的表型回補(bǔ)和蛋白質(zhì)表達(dá)

將融合FLAG 標(biāo)簽的h ALG2 基因分別構(gòu)建入含 TDH3 強(qiáng) 啟 動 子 的 多 拷 貝 （2μ） 質(zhì) 粒YEp351GAPII（圖3（a）、（b））和含酵母ALG2 啟動子（ALG2pr）的單拷貝質(zhì)粒pRS315（圖3（c）、（d））中， 構(gòu)建成功的兩種質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳驗(yàn)證，均顯示有兩個條帶，即載體條帶和目的基因條帶（理論大小為1 281 bp）。

隨后，將YEp351GAPII（作為空載對照）和上述兩個質(zhì)粒分別在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中表達(dá)。 如圖4（a）所示，在YPAG 培養(yǎng)基上，w303a-GAL1pr-ALG2 在分別轉(zhuǎn)入3 種質(zhì)粒后均能正常生長， 說明這些質(zhì)粒不影響Sc ALG2 正常表達(dá)時細(xì)胞的生長； 在YPAD 培養(yǎng)基上， 僅當(dāng)過表達(dá)外源的h ALG2 時，才能回補(bǔ)該菌株的生長缺陷。 提取對應(yīng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白組分進(jìn)行免疫印記分析，僅能檢測到過表達(dá)條件下的hAlg2p 條帶 （50 000 左右），見圖4（b）。 這些結(jié)果說明，h ALG2 基因在酵母細(xì)胞中具有功能同源性，而且僅在其過表達(dá)的條件下才能發(fā)揮功能。

圖2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 2 Construction and verification of w303a-GAL1pr-ALG2 strain

圖3 在酵母中表達(dá)h ALG2 的質(zhì)粒構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 3 Construction and verification of yeast plasmids containing h ALG2

圖4 h ALG2 基因在GAL1pr-ALG2 酵母中的回補(bǔ)和表達(dá)Fig. 4 Growth recovery and protein expression in GAL1pr-ALG2 strain by h ALG2 gene

2.4 h ALG2 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

表達(dá)質(zhì)粒pET32a-h ALG2 示意圖見圖5（a）。經(jīng)雙酶切后電泳驗(yàn)證（圖5（b）），顯示為兩個條帶，下端條帶大小對應(yīng)擴(kuò)增的h ALG2 條帶（1 267 bp）；上端條帶為載體片段，該質(zhì)粒經(jīng)過測序驗(yàn)證無堿基突變，說明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 質(zhì)粒pET32a-h ALG2 的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 5 Construction and verification of pET32a-h ALG2

2.5 TrxA-hAlg2 蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化

重組菌Rosetta （DE3）/pET32a-h ALG2 在IPTG終濃度為0.1 mmol/L 的含氨芐霉素抗性的TB 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。 離心收集菌體，破碎離心純化上清液蛋白質(zhì)，將洗脫后的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。

理論上目的蛋白質(zhì)TrxA-hAlg2 的相對分子質(zhì)量為61 400，如圖6（a）所示，相比于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后在50 000～70 000 之間出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，表明TrxA-hAlg2 蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。純化后可以得到一條清晰的蛋白質(zhì)條帶，與誘導(dǎo)后條帶大小相同。 蛋白質(zhì)免疫印跡也能檢測到對應(yīng)相對分子質(zhì)量的純化后蛋白質(zhì)（見圖6（b）），這說明TrxA-hAlg2 蛋白成功從大腸桿菌破碎上清液中純化得到。 濃縮除鹽處理后得質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的TrxA-hAlg2 蛋白。

圖6 TrxA-h Alg2 蛋白的表達(dá)和純化Fig. 6 Expression and purification of TrxA-h Alg2 protein

2.6 TrxA-hAlg2 蛋白的活性分析

以PPGn2 代替天然底物，GDP-mannose 為供體， 由Alg1NΔTM 催化反應(yīng)1 h 后，100 ℃下2 min終止反應(yīng)并滅活A(yù)lg1NΔTM。 取一半反應(yīng)液， 作為TrxA-hAlg2 的反應(yīng)底物PPGn2M1， 加入純化后的TrxA-hAlg2 后，繼續(xù)30 ℃下反應(yīng)1 h。 最后均向兩份反應(yīng)體系中加入等體積的20 mmol/L HCl，100 ℃下酸解1 h，釋放脂肪鏈上的糖鏈。 糖鏈經(jīng)固相萃取后，進(jìn)行LC-MS 分析。

對于Alg1NΔTM 的反應(yīng)， 在UPLC 液相色譜中分別出現(xiàn)8.73、9.03 的峰（見圖7（a）），ESI-MS 質(zhì)譜分析該峰對應(yīng)的質(zhì)荷比m/z 為609， 即其反應(yīng)產(chǎn)物糖鏈的加鈉值[Gn2-M1+Na]+（見圖7 （b））。 對于TrxA-hAlg2 的反應(yīng)，Gn2-M1 對應(yīng)的峰完全消失，證明底物被TrxA-hAlg2 完全反應(yīng)； 液相色譜顯示在10.57、10.78 和12.25、12.45 有兩組峰 （圖7（a）），ESI-MS 質(zhì)譜分析兩組峰對應(yīng)的質(zhì)荷比m/z 分別為771 和933， 對應(yīng)其反應(yīng)產(chǎn)物糖鏈的加鈉值[Gn2-M2+Na]+和[Gn2-M3+Na]+（圖7（b））。這些結(jié)果說明，在大腸桿菌中表達(dá)純化的TrxA-hAlg2 蛋白同樣具有α-1，3/1，6 甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性， 即向PPGn2M1上添加兩個甘露糖形成PPGn2M3。

圖7 TrxA-hAlg2 蛋白的活性測定Fig. 7 Activity assay of TrxA-hAlg2 protein

3 結(jié) 語

通過分析發(fā)現(xiàn)，人源Alg2 蛋白的84～104 位氨基酸是潛在的惟一膜結(jié)合區(qū)域，且疏水性較小。 盡管這和釀酒酵母ScAlg2 蛋白的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全不同， 但在釀酒酵母中過表達(dá)h ALG2 基因時，hAlg2蛋白能穩(wěn)定表達(dá)， 且能夠回補(bǔ)Sc ALG2 基因缺失時細(xì)胞的生長缺陷。 hAlg2 蛋白在酵母細(xì)胞體內(nèi)的功能同源性和低疏水性的膜蛋白性質(zhì)，為其在大腸桿菌中的表達(dá)純化和后續(xù)活性測定提供理論依據(jù)。 作者在大腸桿菌中表達(dá)了hAlg2 并對其進(jìn)行了純化，相比動物細(xì)胞表達(dá)體系，成本較低。 在體外活性實(shí)驗(yàn)中， 結(jié)合LC-MS 技術(shù)， 證實(shí)hAlg2 具有催化PPGn2M1 形成中間體PPGn2M2 和終產(chǎn)物PPGn2M3的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶功能。 對N-糖基化途徑中人源的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶hAlg2 的外源表達(dá)和體外活性進(jìn)行的研究，為將來進(jìn)一步探索Alg2 的酶學(xué)性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。 此外，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)提純的hAlg2， 也為研究ALG2-CDG 病人相關(guān)突變體的體外活性提供了更加直接、方便、快捷的方法。