劉明宇， 李樹(shù)紅， 楊 娟， 林 昊， 楊 珂， 譚小千

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安625000）

木瓜蛋白酶Papain 是一類半胱氨酸蛋白酶，由212 個(gè)氨基酸殘基組成，并含有3 對(duì)二硫鍵。構(gòu)成其三維結(jié)構(gòu)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)縫隙，縫隙內(nèi)含有酶的活性位點(diǎn)[2]，而半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine proteinase inhibitors，CPIs） 是一類蛋白質(zhì)水解酶抑制因子，其分子活性中心含有半胱氨酸殘基（Cys-His）活性基團(tuán)。它的3 個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了一個(gè)可外露的鍥形結(jié)構(gòu)邊緣，與Papain 在結(jié)構(gòu)上高度互補(bǔ)，進(jìn)而專一地抑制Papain 的活性[3]。 因此，可在分離半胱氨酸蛋白酶抑制劑時(shí)，將Papain 作為配基，偶聯(lián)在活化的載體上，如曾仲奎[4]等曾以Papain為配基純化百合巰基蛋白酶抑制劑。

Cystatins 廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，屬于CPIs 的一個(gè)類群，目前對(duì)魚(yú)類Cystatins 的性質(zhì)及應(yīng)用研究尚有不足。 對(duì)魚(yú)源Cystatins 的精準(zhǔn)分離純化是研究其酶學(xué)特性的前提；另一方面，本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，魚(yú)卵、皮、肝胰等加工廢棄組織及魚(yú)糜加工的廢棄漂洗水[5-8]中存在大量Cystatins 活性。 有報(bào)道顯示，魚(yú)源Cystatin 在抑制魚(yú)糜凝膠軟化[9]、魚(yú)片抑菌[10]和保鮮[11]等食品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，但目前尚缺少對(duì)從魚(yú)類廢棄組織及漂洗水中回收Cystatin 的高效方法。

基于團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)制備的重組魚(yú)類Cystatins能專一高效地與Papain 結(jié)合[11]，作者所在實(shí)驗(yàn)室自制了親和填料（CNBr-Papain-Speharose 4B）并以木瓜蛋白酶Papain 為配基，以對(duì)鰱魚(yú)重組Cystatins 的吸附性能為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 測(cè)定了該填料配基偶聯(lián)密度、穩(wěn)定性、貯藏性能及重復(fù)性。 以魚(yú)糜漂洗水為例，對(duì)該填料的CPIs 回收情況進(jìn)行了驗(yàn)證。 該研究為今后探索精準(zhǔn)分離、 高效回收魚(yú)源Cystatins 的方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 CNBr：購(gòu)自美國(guó)Adamas 公司，純度≥97%；KBr： 購(gòu)自西亞試劑公司， 純度≥99.5%；Papain：購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，使用前配制成5 mg/mL 的溶液；Sepharose 4B： 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；重組鰱魚(yú)Cystatin：參考陳海等[11]的方法，由作者所在實(shí)驗(yàn)室制備，純度≥90%，使用前配制成5 mg/mL。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀： 型號(hào)Varioskan flash， 購(gòu)自美國(guó)Thermo electron 公司；傅立葉變換紅外光譜儀：型號(hào)FTIR-650，購(gòu)自天津港東科技發(fā)展公司； 高效液相色譜儀： 型號(hào)LC-2010ChT，購(gòu)自日本島津公司；全自動(dòng)低中高壓層析系統(tǒng)：型號(hào)Duo/Flow，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和填料的制備

1）Sepharose 4B 的活化 以Axéan 等[12-13]的方法為基礎(chǔ)，略作改動(dòng)，對(duì)介質(zhì)Sepharose 4B 進(jìn)行活化，即取6 g 搗碎后的CNBr，溶于50 mL 蒸餾水，分批小心倒入50 mL 預(yù)處理后的Sepharose 4B（pH 10.0）中。該操作在40 ℃水浴鍋中進(jìn)行，并用5 mol/L K3PO4-K2HPO4緩沖液（pH 9.3）調(diào)節(jié)pH，使pH 值恒定 在11.0。 用0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩 沖 液（pH 9.5） 對(duì)已活化的Sepharose 4B 進(jìn)行快速抽洗，抽干后， 即可得活化的Sepharsoe 4B， 即CNBr-Sepharsoe 4B。

2）CNBr-Papain-Sepharose 4B 的偶聯(lián) 取3 g CNBr-Sepharsoe 4B， 用0.6 mol/L HCl 溶液進(jìn)行多次沖洗，后分別與一定體積的的5 mg/mL Papain 溶液于4 ℃混合過(guò)夜進(jìn)行偶聯(lián)。 后加入40 mL 的0.2 mol/L 甘氨酸溶液（pH 8.0）封閉，4 ℃攪拌過(guò)夜。 而后用含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L CH3COOH 溶液和0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液重復(fù)沖洗3次， 即得已偶聯(lián)Papain 的親和層析填料CNBr-Papain-Sepharose 4B， 將其置于體積分?jǐn)?shù)30%乙醇中于4 ℃下保存，備用。

1.2.2 CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和填料的性能分析

1）紫外光譜分析 參考Amostová 等[14]的方法，分別將Sepharose 4B、CNBr-Sepharsoe 4B 及CNBr-Papain-Sepharose 4B 的甘油混勻樣于220～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描。

2）紅外光譜分析 參考陳嫚等[15]的方法，分別制 備Sepharose 4B、CNBr-Sepharose 4B 及CNBr-Papain-Sepharose 4B 與KBr 的干燥壓片樣品。 以KBr 為背景， 于紅外光譜儀上分別測(cè)定各樣品紅外光譜，波數(shù)范圍為0～4 000 cm-1。

3）微球性狀描述 參照孫永亮[16]等方法，各取少 量Sepharose 4B、CNBr-Sepharose 4B 和CNBr-Papain-Sepharose 4B 分別混合于蒸餾水中并均勻的涂于載玻片，置于光學(xué)顯微鏡（×100）下觀察并拍照。

4）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 以史新昌等[17]的方法為基礎(chǔ)，略作改動(dòng)。 用超純水測(cè)定C18 RP-HPLC 色譜柱的峰面積S0， 后分別將0、1、2、3、4、5 mg/mL 的Papain 及重組Cystatin 在相同條件下 （上樣量均為100 μL）進(jìn)行C18 RP-HPLC 分析，求得樣品的峰面積Se作為標(biāo)品。 以Se/S0的比值為縱坐標(biāo)，以Papain及重組Cystatin 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 繪制C18 RP-HPLC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)樣品Se/S0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及質(zhì)量。

5） 配基Papain 的有效偶聯(lián)密度測(cè)定 參照張琦等[18]方法，即首先按照1.2.1 的方法進(jìn)行5 組偶聯(lián)反應(yīng)，各組取3 g 抽干的CNBr-Sepharsoe 4B 活化，加 入 不 同 體 積（12、15、18、21、24 mL）的Papain（5 mg/mL）， 同時(shí)以未活化的Sepharose 4B 做5 組空白。此時(shí)實(shí)驗(yàn)組及各空白組Papain 的加量即偶聯(lián)前蛋白質(zhì)質(zhì)量，各組3 次重復(fù)。 反應(yīng)后過(guò)濾填料，收集各組濾液，凍干。 凍干粉溶于1 mL 超純水，微濾后取100 μL 按1.2.2 中（4）的方法檢測(cè)并計(jì)算各組偶聯(lián)反應(yīng)后Papain 的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及質(zhì)量，即未偶聯(lián)蛋白質(zhì)量，得出偶聯(lián)量和相對(duì)偶聯(lián)率。

CNBr-Speharose 4B 對(duì)Papain 的偶聯(lián)性能計(jì)算公式為：

式中：m1為實(shí)驗(yàn)組偶聯(lián)前蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m2為實(shí)驗(yàn)組未吸附蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m3為空白組偶聯(lián)前蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m4為空白組未吸附蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；M 為偶聯(lián)前填料質(zhì)量，g。

6）對(duì)重組Cystatin 有效吸附性能的測(cè)定 參考代軍等[19]方法，略作改動(dòng)，向1.2.2（5）中各組偶聯(lián)Papain 后的親和層析填料中添加重組Cystatin（5 mg/mL），添加比例仍以抽干的活化CNBr-Speharose 4B 為基準(zhǔn)，即按CNBr-Speharose 4B∶Cystatin 為1∶5（g∶mL）將二者混勻后，于37 ℃振蕩吸附2 h；同時(shí)以（5）中的各空白組填料（即以未活化的Sepharose 4B 偶聯(lián)papian 的處理） 與重組Cystatin 混合作為Cystatin 有效吸附性能測(cè)試的各空白組，各組重復(fù)3次。 反應(yīng)后抽濾，收集濾液，凍干后溶于1 mL 超純水，微濾后取100 μL，按（4）的方法檢測(cè)吸附后濾液中的Cystatin 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及質(zhì)量， 即未吸附Cystatin 蛋白質(zhì)質(zhì)量，計(jì)算得出吸附量和相對(duì)吸附率。

CNBr-Papain-Speharose 4B 對(duì)Cystatin 的 吸 附性能計(jì)算公式為：

式中：m1為空白組未吸附Cystatin 量，mg；m2為實(shí)驗(yàn)組未吸附Cystatin 量，mg；M 為加入的親和填料總量，g。

7） 熱穩(wěn)定性測(cè)定 對(duì)CNBr-Papain-Sepharose 4B 進(jìn)行熱處理（4 ℃、10～70 ℃，12 h），而后過(guò)濾洗滌，收集濾液凍干。 凍干粉溶于1 mL 超純水，微濾后取100 μL 按 （4） 的方法檢測(cè)各組洗滌液中Papain 的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和質(zhì)量， 以計(jì)算配體Papain 的殘留結(jié)合量與結(jié)合率。 后按（6）檢測(cè)各處理下填料對(duì)Cystatin 的有效吸附性能， 所有實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。 以Papain 的結(jié)合率和Cystatin 的吸附率為縱坐標(biāo)，以溫度為橫坐標(biāo)作圖，從而確定熱穩(wěn)定性。

Papain 的殘留結(jié)合量和殘留結(jié)合率計(jì)算公式為：

式 中：m1為Papain 總 偶 聯(lián) 量，mg；m2為 反 應(yīng) 組Papain 總脫落量，mg；M 為填料質(zhì)量，g。

8） 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 取CNBr-Papain-Sepharose 4B 與各緩沖液（pH 2.0～13.0）按1∶20（g∶mL）混合，37 ℃孵育12 h，后過(guò)濾并洗滌，濾液與洗滌液合并收集。各處理組的Papain 殘留結(jié)合量與結(jié)合率及Cystatin 的吸附性能， 測(cè)試計(jì)算方法同（7）。以Papain 的結(jié)合率和Cystatin 的吸附率為縱坐標(biāo)，以pH 值為橫坐標(biāo)作圖，從而確定其酸堿穩(wěn)定性。

9） 貯藏穩(wěn)定性 各組CNBr-Papain-Sepharose 4B 與超純水均按1∶20（g∶mL）混合，4 ℃下貯存6 個(gè)月，每月取樣，以超純水充分過(guò)濾洗滌，收集洗滌液，測(cè)各取樣點(diǎn)填料的Papain 殘留結(jié)合量與結(jié)合率及Cystatin 的吸附性能， 測(cè)試計(jì)算方法同1.2.2 中（7）。 以Papain 的結(jié)合率和Cystatin 的吸附率為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，從而確定其貯藏穩(wěn)定性。

10） 填料重復(fù)性測(cè)定 取5 g 按最佳料液比制備的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和填料， 裝柱，后用Buffer A （含50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA及1 mmol/L β-巰基乙醇的25 mmol/L 乙酸鈉，pH 6.0）壓實(shí)、平衡，之后按照1.2.2（6）中所確定的Cystatin 最大吸附量進(jìn)行加樣 （即5 g 填料上樣106.3 mg），收集流出液，凍干。 后用Buffer B（含1 mol/L NaCl 的Buffer A，pH 6.0） 洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，以Buffer A 除鹽后，用洗脫液Buffer C（含50 mmol/L NaCl 及1 mmol/L EDTA 的0.25 mol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 11.0） 進(jìn)行梯度洗脫，流量0.3 mL/min，收集流出液并凍干，再用Buffer A 進(jìn)行平衡，重復(fù)以上操作3 次，以上操作均于4 ℃進(jìn)行。

將3 次收集的流出液凍干粉分別溶于1 mL 超純水，微濾后按1.2.2 中（4）的方法檢測(cè)3 次流出液中的未吸附Cystatin 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度及質(zhì)量， 并計(jì)算吸附率。

Cystatin 的吸附率計(jì)算公式為：

式 中：M 為 加 入Cystatin 的 總 質(zhì) 量；m 為 未 吸 附Cystatin 的質(zhì)量。

1.2.3 鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水中CPIs 的CNBr-Papain-Sepharose 4B 層析回收 參考李樹(shù)紅[20]方法，取魚(yú)糜漂洗水進(jìn)行酸處理（pH 4.0，37 ℃，30 min）及硫酸銨分級(jí)沉淀處理， 后用少量Buffer A 溶解沉淀，充分透析后濃縮至適當(dāng)體積，得到濃縮CPIs 粗提液。

將CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和填料裝柱后，用Buffer A 壓實(shí)、平衡，將濃縮粗提液微濾后上樣。以Buffer A 洗去不吸附的蛋白質(zhì)，以Buffer B 洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)， 經(jīng)Buffer A 除鹽后，用Buffer C 進(jìn)行梯度洗脫，流速0.3 mL/min，收集洗脫液。 根據(jù)Anastasi 等[21]的方法測(cè)定親和層析后各收集管樣品對(duì)Papain 水解熒光合成肽底物Z-Phe-Arg-MCA 的抑制活性，以確定目的蛋白質(zhì)的洗脫峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的紫外光譜分析

紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。 CNBr-Sepharose 4B 和CNBr-Papain-Sepharose 4B 均在紫外波長(zhǎng)約220 nm 處呈現(xiàn)強(qiáng)吸收峰， 該峰為溴化氰中雙鍵在紫外光照射下能級(jí)躍遷產(chǎn)生的典型吸收峰， 說(shuō)明在Sepharose 4B 載體上成功引入了溴化氰。 CNBr-Papain-Sepharose 4B 在280 nm 處的吸收峰， 表明Papain 已成功偶聯(lián)到載體上。

圖1 紫外光譜分析Fig. 1 Assay of ultraviolet spectroscopy

2.2 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的紅外光譜分析

紅外光譜的結(jié)果見(jiàn)圖2。 未活化的Sepharose 4B 在3 446 cm-1處的吸收峰（1）是由締合羥基（υO(shè)H）伸縮引起的，2 844 cm-1處（2）出現(xiàn)的是υcH吸收峰，1 381 cm-1處 （6） 出現(xiàn)的峰是O-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δO-H）的吸收峰，1 275 cm-1（7）出現(xiàn)的是O-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)（δO-H）的吸收峰，1 188 cm-1（9）為糖苷鍵υC-O-C伸縮振動(dòng)吸收峰，852 cm-1（10）是糖環(huán)的σC-H伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，751 cm-1處（11）出現(xiàn)糖環(huán)擴(kuò)張運(yùn)動(dòng)引起的吸收峰。CNBr 活化的Sepharose 4B 除具有上述光譜特征外，還在2 210 cm-1（3）出現(xiàn)了氰伸縮振動(dòng)（σC≡N） 的特征吸收峰。 在此基礎(chǔ)上， 偶聯(lián)Papain 后的填料，還分別在1 672 cm-1處（4）、1 547 cm-1處（5）出現(xiàn)典型的酰胺I 峰（σC＝O）、酰胺II 峰（σN-H+υC-N），而在1 249 cm-1處（8）出現(xiàn)的較弱的酰胺III 峰， 可能是被Sepharose 4B 的δO-H吸收峰（7）掩蓋。

圖2 紅外光譜分析Fig. 2 Assay of infrared spectroscopy

2.3 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的微球性狀描述

CNBr 活化和配基Papain 偶聯(lián)前后瓊脂糖凝膠介質(zhì) （Sepharose 4B、CNBr-Sepharose 4B 和CNBr-Papain-Sepharose 4B） 的微粒性狀照片見(jiàn)圖3。Sepharose 4B 的粒徑在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終介于100～200 μm 之間，無(wú)明顯變化，且表面光滑，說(shuō)明活化和偶聯(lián)的整個(gè)過(guò)程對(duì)凝膠介質(zhì)的性能沒(méi)有明顯影響，這對(duì)于提高選擇性分離具有積極意義[22]。 因此，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)所制備的親和層析填料符合實(shí)際應(yīng)用的要求。

圖 3 Sepharose 4B、CNBr -Sepharose 4B 和 CNBr -Papain-Sepharose 4B 在顯微鏡下的形態(tài)Fig. 3 Microscopic graphs of Sepharose 4B, CNBr -Sepharose 4B and CNBr-Papain-Sepharose 4B

2.4 Papain 偶聯(lián)密度及Cystatin 吸附性能測(cè)定

2.4.1 C18 RP-HPLC 測(cè)Papain 及重組Cystatin 質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同質(zhì)量濃度的Papain 及重組Cystatin 進(jìn)行C18 RP-HPLC 色譜柱繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4-5。 Papain 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=2.052 8x+1.252 5 （R2=0.990 2）， 重組Cystatin蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y=2.085 4x+1.139 7（R2=0.991 2）

圖4 C18 RP-HPLC 的Papain 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Standard curve of Papain of C18 RP-HPLC

圖5 C18 RP-HPLC 的重組Cystatin 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of recombinant Cystatin of C18 RP-HPLC

2.4.2 Papain 偶聯(lián)密度及Cystatin 吸附性能測(cè)定各Papain 添加量組、Papain 偶聯(lián)量及相對(duì)偶聯(lián)率值以及相應(yīng)組別的親和填料對(duì)Cystatin 的吸附量和相對(duì)吸附率見(jiàn)表1。

表1 Papain 偶聯(lián)密度及Cystatin 吸附性能測(cè)定Table 1 Determination of coupling density of Papain and adsorption performance of Cystatin

隨著Papain 的添加量的增加， 每克CNBr-Sepharose 4B 對(duì)Papain 的偶聯(lián)量隨之增加。 在各組吸附性能測(cè)定中， 前三組親和填料對(duì)Cystatin 的吸附量與Papain 的偶聯(lián)量成正相關(guān)，第四組親和填料對(duì)Cystatin 的吸附量為21.26 mg/g，為最大吸附量，同時(shí)達(dá)到了最大相對(duì)吸附率 （100%）。 此后隨著Papain 偶聯(lián)量增大， 親和填料對(duì)Cystatin 的吸附量反而下降。 因此，每克CNBr-Sepharose 4B 加入7 mL Papain（5 mg/mL），即配體與配基的料液比為1∶7（g∶mL）時(shí)，偶聯(lián)制備的親和填料CNBr-Papain-Sepharose 4B 對(duì)Cystatin 的相對(duì)吸附率最佳，即每克活化的CNBr-Sepharose 4B 對(duì)Papain 的偶聯(lián)量為32.17 mg， 此時(shí)的填料對(duì)Cystatin 表現(xiàn)為最大吸附量21.26 mg。

2.5 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的熱穩(wěn)定性

CNBr-Papain-Sepharose 4B 的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。 在4～40 ℃的溫度范圍內(nèi)，填料的Papain殘留結(jié)合率及對(duì)重組Cystatin 的吸附率均為100%，說(shuō)明此時(shí)制備的親和填料穩(wěn)定性高。 50 ℃時(shí)，兩指標(biāo)均開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且此后隨著溫度的升高而迅速降低，證明已偶聯(lián)上的Papain 會(huì)隨著溫度的升高而脫落， 進(jìn)而Cystatin 的吸附性能也會(huì)因其受到影響。 因此，本實(shí)驗(yàn)所制備的親和填料最理想的操作溫度為4～40 ℃。

配基Papain 作為一種蛋白質(zhì)， 其在50 ℃以下時(shí)穩(wěn)定性較好，更高的溫度會(huì)導(dǎo)致其活性下降[23]，這也可能是該親和填料在50 ℃時(shí)，Papain 結(jié)合率下降的原因之一。 同時(shí)，以蛋白質(zhì)為配基的親和填料，其可操作溫度通常處于4～40 ℃之間， 本實(shí)驗(yàn)制備的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和層析填料的熱穩(wěn)定性結(jié)果說(shuō)明其在實(shí)際應(yīng)用中可行。 此外，擬用該親和層析填料純化的魚(yú)源Cystatin 是具有半胱氨酸蛋白酶抑制作用的活性蛋白，其純化的過(guò)程需要保持4 ℃低溫條件[24]，而本實(shí)驗(yàn)中制備的親和填料在4 ℃下性能非常穩(wěn)定，恰好符合該類蛋白質(zhì)層析操作的溫度要求。

圖6 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of CNBr-Papain-Sepharose 4B

2.6 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的酸堿穩(wěn)定性

CNBr-Papain-Sepharose 4B 的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。 在pH 3.0～12.0 之間，Papain 的殘留結(jié)合率很高，均在95.7%以上，且對(duì)Cystatin 的吸附率在85.0%以上， 說(shuō)明在此pH 范圍內(nèi)制備的親和填料比較穩(wěn)定；而在pH 2.0 極酸和pH 13.0 極堿的條件下， 親和填料的配基Papain 不穩(wěn)定， 易脫落，對(duì)Cystatin 的吸附率極顯著降低； 另一方面， 在pH 6.0～8.0 之間， 親和填料Papain 的殘留結(jié)合率和對(duì)Cystatin 的吸附率均最高，接近100%。 因此，本研究制備的親和填料在pH 3.0～12.0 之間穩(wěn)定， 最理想的保存及使用pH 為6.0～8.0。

圖7 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的pH 穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of CNBr-Papain-Sepharose 4B

對(duì)于大部分蛋白質(zhì)而言，pH 6.0～8.0 是較為溫和適宜的pH 環(huán)境，此外，在層析純化過(guò)程中，洗脫緩沖液的pH 值偏離目的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI 0.5 單位時(shí)， 會(huì)更好地維持目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 大部分Cystatin 的等電點(diǎn)也在pH 6.0～8.0 附近， 如鰱魚(yú)Cystatin 的等電點(diǎn)pI 為6.5[25]，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）PtCystatin 的等電點(diǎn)pI 為5.24[26]。 因此進(jìn)行魚(yú)源Cystatin 純化時(shí)，所用適宜的pH 值條件都基本處于pH 6.0～8.0 之間，而此時(shí)制備的親和填料最穩(wěn)定，對(duì)Cystatin 的有效吸附性能最高，意味在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中， 該填料會(huì)更有利于目的Cystatin類蛋白的純化，分離效果更高效。

而魚(yú)源Cystatin 種類較多，來(lái)源廣泛，個(gè)別魚(yú)源Cystatin 是酸性蛋白或堿性蛋白， 如斑狼鳚（spotted wolffish）Cystatin 的等電點(diǎn)pI 為3.6[27]；從中華鱘（Acipenser sinensis） 中提取得到的Cystatin C 的等電點(diǎn)pI 為9.3[28-29]。 因此在層析純化過(guò)程中，洗脫緩沖液的pH 值變化可能較大。 該自制親和填料在pH 3～12 范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性， 證明其對(duì)于魚(yú)源Cystatin 有較好的適用性。 此外，以Sepharose 做為介質(zhì)的層析填料在再生或者在位清洗時(shí)常會(huì)用到較為激烈的堿性環(huán)境， 如使用0.1 mol/L NaOH（pH 12.0 左右）作為清洗溶液，而該填料具有較好的酸堿穩(wěn)定性，證明其可以進(jìn)行短時(shí)間的在位清洗和再生，具有現(xiàn)實(shí)可操作性。

2.7 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的貯藏穩(wěn)定性

不同貯藏時(shí)間內(nèi)制備的親和填料CNBr-Papain-Sepharose 4B 的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。 由圖可知，CNBr-Papain-Sepharose 4B 在4 ℃初始貯藏點(diǎn)時(shí)，其Papain 的殘余結(jié)合率及其對(duì)Cystatin 的吸附率均為100%，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩指標(biāo)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；2 個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定，4 個(gè)月時(shí)，其Papain 的殘余結(jié)合率仍在92%以上；貯藏6 個(gè)月之后， 其Papain 的殘余結(jié)合率有所降低， 仍保持在80%以上， 但此時(shí)對(duì)Cystatin 的吸附率明顯降低為64.95%。

圖8 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的貯藏穩(wěn)定性Fig. 8 Storage stability of CNBr-Papain-Sepharose 4B

實(shí)驗(yàn)制備的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和填料在6 個(gè)月的貯藏期內(nèi)， 保持了大部分的穩(wěn)定性。 其在6 個(gè)月時(shí)對(duì)Cystatin 吸附率降低的主要原因應(yīng)該是與本實(shí)驗(yàn)中采用的貯藏溶液有關(guān)。 通常商業(yè)化產(chǎn)品的保存液為適宜pH 條件下的含有體積分?jǐn)?shù)20%或30%乙醇的緩沖溶液，而本實(shí)驗(yàn)所用的貯藏溶液為超純水，并不有利于維持配基蛋白Papain的穩(wěn)定性。 由此可以推測(cè)，改進(jìn)貯藏溶液的成分將會(huì)進(jìn)一步提高該親和填料的貯藏穩(wěn)定性。 本團(tuán)隊(duì)將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步、更全面地優(yōu)化填料的貯藏條件，提高貯藏性能。

2.8 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的使用重復(fù)性

CNBr-Papain-Sepharose 4B 的使用重復(fù)性見(jiàn)表2。 從表2 可以看出，填料對(duì)Cystatain 的吸附率很穩(wěn)定，在連續(xù)3 次使用時(shí)均維持在95%以上，證明填料的重復(fù)性能較好。 使用重復(fù)性測(cè)定時(shí)， 填料對(duì)Cystatin 的吸附量均低于2.4.2 中所測(cè)得的Cystatin最大吸附量， 主要是因?yàn)?.4.2 在測(cè)定吸附性能時(shí)采用了靜態(tài)吸附載量法，而1.2.2 中（10）采用動(dòng)態(tài)吸附載量法，更接近實(shí)際的層析操作過(guò)程。 然而由于存在動(dòng)態(tài)的吸附、解吸平衡及一定的樣品漏出率（通常允許在5%以內(nèi)）， 所以實(shí)驗(yàn)測(cè)得的動(dòng)態(tài)吸附載量和吸附率均比靜態(tài)吸附時(shí)要低些， 是正常的。盡管本實(shí)驗(yàn)制備的填料使用重復(fù)性比較穩(wěn)定，但是任何填料的有效重復(fù)使用次數(shù)都受多種因素的影響，例如柱的種類、樣品性質(zhì)、填料保存和再生方法、層析操作細(xì)節(jié)習(xí)慣以及純化的要求，因此不可能永久再生。 本實(shí)驗(yàn)制備的填料也是具有一定的使用壽命，探究該填料的各項(xiàng)性能，對(duì)合理使用填料、延長(zhǎng)使用壽命都有指導(dǎo)意義。

表2 CNBr-Papain-Sepharose 4B 的重復(fù)使用性Table 2 Reusability of CNBr-Papain-Sepharose 4B

2.9 鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水中CPIs 的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和層析

鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水中CPIs 的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和層析圖見(jiàn)圖9。 可以看出，CPIs 濃縮粗提液經(jīng)CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和層析后， 于吸光度A280處監(jiān)測(cè)到3 個(gè)明顯的獨(dú)立蛋白質(zhì)峰（峰I，峰II 和峰III）。 其中經(jīng)Buffer A 洗脫下大量雜蛋白質(zhì)， 即峰I， 伴隨有少量的活性損失；經(jīng)Buffer B 洗脫下的非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)峰II 沒(méi)有呈現(xiàn)出Papain 抑制活性； 而經(jīng)BufferC 洗脫液梯度洗脫后， 主要在洗脫液比例升至58%時(shí)得到峰III，該峰A280蛋白質(zhì)峰值最低， 而Papain 抑制活性最高，說(shuō)明其具有明顯的Papain 抑制比活性，證明CNBr-Papain-Sepharose 4B 填料成功地實(shí)現(xiàn)了鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水CPIs 的高效回收純化。

圖9 鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水中CPIs 的CNBr-Papain-Sepharose 4B 親和層析圖Fig. 9 CNBr-Papain-Sepharose 4Baffinity chromatography of CPIs from silver carpsurimi rinse water

3 結(jié) 語(yǔ)

利用溴化氫活化法對(duì)sepharose 4B 進(jìn)行活化并將其與Papain 偶聯(lián)制得親和填料CNBr-Papain-Sepharose 4B。 通過(guò)結(jié)構(gòu)表征， 綜合220 nm 及280 nm 紫外吸收峰、氰伸縮振動(dòng)（σC≡N）的特征吸收峰（2 210 cm-1） 以及典型的酰胺峰 （1 672、1 547、1 249 cm-1），可靠地證實(shí)了Sepharose 4B 被CNBr 活化，且Papain 偶聯(lián)成功。

利用重組鰱魚(yú)Cystatin 的吸附率為指標(biāo)來(lái)篩選活化的瓊脂糖介質(zhì)對(duì)Papain 適宜的偶聯(lián)密度并測(cè)定親和填料的穩(wěn)定性。 結(jié)果表明，CNBr-Speharose 4B 和Papain 最 佳 料 液 比 為1 ∶7 （g ∶mL），CNBr-Papain-Sepharose 4B 在4～40 ℃下熱穩(wěn)定性最高，pH 6.0～8.0 之間CNBr-Papain-Sepharose 4B 最穩(wěn)定，pH 3.0～12.0 之間仍具有較高的可操作性。 在4 ℃下以超純水作為貯藏溶液， 制備的填料在6 個(gè)月內(nèi)保持80%以上的Papain 殘留結(jié)合率及65%以上的Cystatin 吸附率。連續(xù)重復(fù)使用3 次后，填料對(duì)目的蛋白質(zhì)的吸附率均保持在95%以上，具有較好的重復(fù)性。最后，制備的CNBr-Papain-Sepharose 4B親和填料成功高效地回收了鰱魚(yú)魚(yú)糜漂洗水中的CPIs。