發(fā)酵時間對安岳壇子肉風(fēng)味及壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

肖 嵐， 安攀宇， 楊 芳， 何 蓮， 杜雙巧， 曾小婷， 劉 威

（四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都610100）

四川安岳壇子肉是將油炸之后的豬五花肉用香辛料調(diào)味，然后與蘿卜絲一起入壇發(fā)酵而形成的發(fā)酵肉制品，因入陶壇中發(fā)酵而成名，故名壇子肉。壇子肉的醬香風(fēng)味濃郁，這應(yīng)該與其入壇發(fā)酵密切相關(guān)，陶壇內(nèi)特有的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)通過自身新陳代謝對壇子肉進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，如酯類、烷烴類、醇類、醛類、酮類、酚類等化合物[1]，形成了壇子肉的特殊風(fēng)味。 目前，國內(nèi)學(xué)者對發(fā)酵肉制品的微生物菌群結(jié)構(gòu)變化與風(fēng)味關(guān)系的研究主要集中在湖南壇子肉[2]、漢源罐罐肉[3]、發(fā)酵火腿[4-5]、發(fā)酵香腸[6-7]、發(fā)酵臘肉[8-9]、發(fā)酵魚[10]。在本研究的前期實驗中，關(guān)于發(fā)酵溫度對壇子肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響進(jìn)行了研究[11-12]，蘿卜絲入壇發(fā)酵對壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演替變化的影響[13]、發(fā)酵終點對壇子肉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響也進(jìn)行了研究[1]。 然而，發(fā)酵終點前以及發(fā)酵終點后的壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化、壇子肉風(fēng)味變化暫未有系統(tǒng)研究。 在壇子肉的實際生產(chǎn)中，壇子肉發(fā)酵終點的確定是根據(jù)有經(jīng)驗的老師傅進(jìn)行感官評價的結(jié)果，不同季節(jié)、不同陶壇制備的壇子肉的發(fā)酵終點差異較大，比如壇子肉冬季發(fā)酵終點一般在60～80 d 內(nèi)，夏季發(fā)酵終點一般在45～60 d 內(nèi)。 生產(chǎn)企業(yè)為了提高生產(chǎn)效率，只要達(dá)到壇子肉風(fēng)味的基本要求，企業(yè)即會停止其發(fā)酵，關(guān)于延長發(fā)酵時間的壇子肉的風(fēng)味輪廓以及壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化暫未有報道。 因此，為系統(tǒng)了解發(fā)酵時間對安岳壇子肉風(fēng)味以及壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響，作者制備了發(fā)酵時間長達(dá)135 d 的壇子肉樣品以進(jìn)行動態(tài)研究， 利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對壇內(nèi)的壇子肉、蘿卜絲的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，并使用電子鼻、電子舌對不同發(fā)酵時間節(jié)點的壇子肉的風(fēng)味輪廓進(jìn)行比較分析，獲得不同發(fā)酵時間節(jié)點的壇子肉風(fēng)味以及壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異關(guān)系，為詳盡了解發(fā)酵時間與壇子肉風(fēng)味、壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.?Stool DNA Kit）：上海哈研生物科技有限公司；壇子肉：由四川安岳縣普州壇子肉食品有限公司代生產(chǎn)（按照冬季生產(chǎn)工藝生產(chǎn)[1]，分別在入壇發(fā)酵第20、40、60、75、90、105、120、135 天進(jìn)行取樣，經(jīng)真空包裝后保存于-80℃，備用）；蘿卜絲：在發(fā)酵第20、40、60、75、90、105、120、135 天時與壇子肉一起從壇內(nèi)取出， 經(jīng)真空包裝后保存于-80 ℃，備用；MiSeq Reagent Kit V3：美國Illumina 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq 測序儀：美國Illumina 公司；α-Astree 型電子舌：法國Alpha MOS 公司；AUW220D 電子天平（精度為0.1 mg）： 日本島津公司；FOX4000 系統(tǒng)電子鼻：法國Alpha MOS 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和測序 參考肖嵐[1]等的方法提取壇子肉、 蘿卜絲樣品中細(xì)菌的總DNA， 并對DNA純度、 DNA 濃度進(jìn)行檢測、擴增（擴增的目標(biāo)區(qū)域是16S rDNA 基因的V3+V4 區(qū)域）[14]、測序。

1.3.2 壇子肉風(fēng)味屬性的感官評定 感官評定參考美國化學(xué)協(xié)會規(guī)定的方法[15]。 評定小組由受過專業(yè)培訓(xùn)的感官評定人員組成，共10 人，男女各半，分別從醬香、肉鮮、肉酸、余味殘留、整體風(fēng)味5 個角度打分，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：風(fēng)味特別強烈（9～10 分）；風(fēng)味強烈（6～8 分）；風(fēng)味中等（4～6 分）；風(fēng)味較弱（2～4 分）；風(fēng)味可無可有（0～2 分）[16]。

1.3.3 壇子肉電子舌和電子鼻測定 電子鼻分析：參照易宇文[17]等的方法，準(zhǔn)確稱量2.0 g 壇子肉并充分切碎，置于頂空瓶，密封，用于電子鼻測試。

電子舌分析：參照范文教[18]等的方法，將20.0 g壇子肉充分切碎， 置于錐形瓶中并加入200 mL 蒸餾水，超聲波處理10 min，經(jīng)普通濾紙過濾去上清液，收集80 mL 用于電子舌測試。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)3 次平行試驗后得到。 電子鼻、電子舌檢測數(shù)據(jù)采用Alpha MOS 公司配套統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行判別因子分析[19]。 壇內(nèi)細(xì)菌菌群Miseq 測序完成后， 利用overlap 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得最終的OTU 豐度及代表序列，并進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?壇內(nèi)細(xì)菌Alpha 多樣性分析

為了解在發(fā)酵過程中壇內(nèi)的細(xì)菌變化規(guī)律，對不同發(fā)酵時間的壇子肉、蘿卜絲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。 不同發(fā)酵時間的各樣品的Alpha 多樣性指數(shù)見表1。 菌群覆蓋度指數(shù)（Goods coverage）反映測序量相對于整體樣本的覆蓋程度[21]。 本次16 組樣品的菌群覆蓋度指數(shù)均能達(dá)到98% 以上。 Chao1指數(shù)用于估計樣品中所含 OTU 數(shù)目，OTUs（Operational Taxonomic Units） 是將16 組樣品獲得的有效序列數(shù)（ 38 247 條）按照97% 的序列相似度進(jìn)行聚類[22]，得到每個cluster 的序列及其代表序列即為OTU。

發(fā)酵60 d 壇子肉、 蘿卜絲的平均Chao1 指數(shù)均最高，分別為596.35、585.05，說明其含有的稀有群落的豐富度最高， 發(fā)酵105 d 壇子肉的稀有群落的豐富度也較高（Chao1 搦數(shù)596.10）。壇子肉、蘿卜絲的observed species 指數(shù)隨發(fā)酵時間延長呈先上升后下降的變化趨勢，其中，發(fā)酵60 d 壇子肉、蘿卜絲的平均observed species 指數(shù)均最高， 分別為412.33 和345.33， 樣品中含有的物種數(shù)目最多。Simpson 指數(shù)越高反映樣品物種多樣性越高， 發(fā)酵90 d 壇子肉、發(fā)酵120 d 蘿卜絲的Simpson 指數(shù)最高；Shannon 指數(shù)越高反映OTU 出現(xiàn)的紊亂和不確定性越高，發(fā)酵60 d 壇子肉、蘿卜絲的Shannon 指數(shù)均最高。 由以上結(jié)果可知，發(fā)酵60 d 的壇內(nèi)樣品（包括壇子肉和蘿卜絲） 的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性高于其他發(fā)酵時間樣品，說明發(fā)酵促進(jìn)了壇內(nèi)細(xì)菌的生長繁殖；發(fā)酵75 d 時，壇內(nèi)菌群豐富度和多樣性開始下降，且在隨后的發(fā)酵時間內(nèi)呈波動下降趨勢。

2.2 壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異的比較

不同顏色的樹枝代表不同樣品組， 如圖1 所示，不同發(fā)酵時間的壇子肉以及蘿卜絲在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)上有較大差異。 大部分壇子肉樣品與大部分蘿卜絲樣品分別位于兩個不同的分支，然而，發(fā)酵60、120 d 蘿卜絲在壇子肉分支中，發(fā)酵75 d 壇子肉在蘿卜絲分支中， 說明發(fā)酵60、120 d 的蘿卜絲與其他發(fā)酵時間的蘿卜絲在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)上有較大差異， 發(fā)酵75 d 壇子肉與其他發(fā)酵時間的壇子肉在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)上有較大差異。 另外， 60 d 壇子肉與其他發(fā)酵時間的壇子肉不在一個分支， 說明60 d壇子肉與其他發(fā)酵時間的壇子肉在細(xì)菌菌群組成上存在差異； 20 d 蘿卜絲與其他發(fā)酵時間的蘿卜絲不在一個分支， 說明20 d 蘿卜絲與其他發(fā)酵時間的蘿卜絲在細(xì)菌菌群組成上存在差異。 綜上，發(fā)酵時間少于或多余60 d 的壇子肉與發(fā)酵60 d 的壇子肉在細(xì)菌菌落組成上差異較大，而壇子肉生產(chǎn)企業(yè)在冬季的生產(chǎn)發(fā)酵時間一般控制在60 d 左右，說明60 d 發(fā)酵時間是壇子肉風(fēng)味質(zhì)變的一個關(guān)鍵節(jié)點。

表1 壇內(nèi)細(xì)菌菌群豐富度和多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial Community Richness and Diversity Index in the Tank

圖1 UPGMA 層次聚類分析Fig. 1 UPGMA Hierarchical C?lustering Analysis

2.3 壇內(nèi)細(xì)菌菌群的物種注釋

為了直觀展現(xiàn)物種分類及樣品距離之間的關(guān)系， 對豐度前20 的物種進(jìn)行Bray-Curtis 距離聚類，如圖2 所示[1]。細(xì)菌菌群在種水平相對豐度最高的是乳酸桿菌屬（Lactobacillus），各發(fā)酵時間的壇子肉相對豐度均達(dá)到99%以上； 然而在發(fā)酵20、40 d的蘿卜絲中，乳酸桿菌屬的相對豐度較低，分別為88.17% 和94.97%，但隨發(fā)酵時間的延長，乳酸桿菌豐度增加（P＞0.05），蘿卜絲發(fā)酵60 d 后的乳酸桿菌相對豐度均達(dá)到99% 以上。 藍(lán)細(xì)菌屬（Streptophyta）在發(fā)酵20 d 蘿卜絲中的相對豐度達(dá)到7.47%，40 d蘿卜絲中的相對豐度是4.50%， 其他各發(fā)酵時間的蘿卜絲以及所有發(fā)酵時間的壇子肉中的相對豐度均未超過1%。 伯克氏菌屬（Burkholderia）僅在發(fā)酵20 d 蘿卜絲中的相對豐度超過1%。 其他各菌屬的相對豐度在各樣品中均不超過1%。 以上結(jié)果提示，乳酸桿菌屬是安岳壇子肉中第一優(yōu)屬，然而前人多報道葡萄球菌[8]、乳球菌屬[9-10]也是發(fā)酵肉制品常見的優(yōu)勢菌屬，這可能與安岳壇子肉獨特的加工工藝有關(guān)，即壇子肉、蘿卜絲混合入壇發(fā)酵，因此壇子肉具有獨特的醬香風(fēng)味。

為了更直觀反映多個樣品在各分類水平上組成的相似性和差異性，根據(jù)各樣品相對豐度表對相對豐度最高20 個的菌群組成數(shù)據(jù)的相似度加以聚類，見圖3[1]。 從圖3 可以看出，60 d 壇子肉與40 d壇子肉聚類最近，說明其菌群組成較為相似；另外，60 d 壇子肉與90 d 壇子肉、75 d 壇子肉雖在同一分支，但是聚類較遠(yuǎn)，特別是與75 d 壇子肉的聚類更遠(yuǎn)。此外，105 d 壇子肉與105 d 蘿卜絲的聚類最近， 90 d 壇子肉與120 d 蘿卜絲的聚類最近，說明其菌群組成最相似。以上結(jié)果提示，40、60、75、90 d壇子肉在屬水平上聚類較近， 特別是60 d 壇子肉與40 d 壇子肉；隨著發(fā)酵時間的延長，壇子肉在屬水平上聚類變遠(yuǎn)；另外，隨著發(fā)酵時間延長，壇子肉與蘿卜絲在屬水平聚類上趨于穩(wěn)定，也就是陶壇中的壇子肉、 蘿卜絲所攜帶的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)趨于一致。

圖2 各樣品在屬水平的豐度柱狀圖Fig. 2 Abundance histogram of each sample at genus level

2.4 發(fā)酵時間對壇子肉特殊風(fēng)味的影響

如表2 所示， 各壇子肉樣品的醬香味非常濃郁，其中90 d 壇子肉醬香味的評分最高，為9.75；各壇子肉樣品的鮮味不明顯，可能是濃郁的醬香味掩蓋了其鮮味，60 d 壇子肉的鮮味評分最高，為5.92；各壇子肉樣品的酸味似有似無，可能正是酸味使壇子肉吃起來肥而不膩，135 d 壇子肉的酸味評分最高，為3.04；試驗中評定的醬香味、鮮味、酸味以及整體風(fēng)味都是壇子肉的頭香，而余味殘留是指品嘗完壇子肉后嘴里余留的香味，60 d 壇子肉余味殘留評分最高，為7.43。 風(fēng)味與風(fēng)味之間會發(fā)生相互作用從而相互影響，這就需要對壇子肉的風(fēng)味進(jìn)行綜合評價，即整體風(fēng)味。 整體風(fēng)味評分最高的是60 d 發(fā)酵壇子肉，發(fā)酵時間不足以及過度發(fā)酵都會影響壇子肉的整體風(fēng)味，其中，發(fā)酵時間超過90 d的壇子肉的整體風(fēng)味評分較低（P＜0.01），且發(fā)酵時間越長風(fēng)味越差。 感官評價受品評員主觀以及環(huán)境客觀因素的影響較大，且目前暫時未有生產(chǎn)企業(yè)結(jié)束發(fā)酵后的壇子肉的風(fēng)味研究數(shù)據(jù)。 作者將采用電子鼻、電子舌客觀評價60、75、90、105、120、135 d 發(fā)酵的壇子肉的風(fēng)味，見圖3。

2.5 壇子肉電子舌、電子鼻風(fēng)味指紋圖譜分析

判別因子分析 （discriminant factorial analysis，DFA）[16]是將電子鼻、 電子舌的傳感器數(shù)據(jù)重新組合，縮小組內(nèi)樣品變量差距，而組間樣品變量差距盡可能擴大，達(dá)到區(qū)分各組樣品的目的[23-25]。 各壇子肉樣品的DFA 分析圖見圖4。在DFA （左）中60 d壇子肉與90 d 壇子肉在氣味上的距離最近， 經(jīng)多元方差分析（MANOVA）發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著（P＞0.05）；105 d 壇子肉與120 d 壇子肉在氣味上的距離最近，差異不顯著（P＞0.05）；其余各組間均有明顯的離散趨勢， 各組間差異顯著 （P＜0.05）， 特別是135 d 壇子肉離散最遠(yuǎn)， 75 d 壇子肉次之。 以上結(jié)果說明， 發(fā)酵時間會對壇子肉的氣味產(chǎn)生影響，長時間發(fā)酵的壇子肉（105 d 壇子肉與120 d 壇子肉）氣味較為接近， 適度發(fā)酵壇子肉 （60 d 壇子肉與90 d 壇子肉） 氣味較為接近； 135 d 壇子肉、 75 d壇子肉與其他壇子肉的氣味差異較大[26]。

表2 不同發(fā)酵階段的壇子肉的風(fēng)味感官評定Table 2 Flavor sensory evaluation of Anyue ceramic-pot sealed meat at different fermentation stages

圖3 各樣品在屬水平的熱圖Fig. 3 Thermogram of each sample at genus level

在DFA （右）中， 60 d 壇子肉與其他壇子肉在滋味上有明顯的離散趨勢， 差異極顯著（P＜0.01）；105 d 壇子肉與120 d 壇子肉在滋味上的距離最近（P＞0.05）；其余各組間均有明顯的離散趨勢，各組間差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果顯示，發(fā)酵時間也會對壇子肉的滋味產(chǎn)生較大影響。

綜上，發(fā)酵時間會對壇子肉的風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，長時間發(fā)酵的壇子肉的風(fēng)味較為接近，短時間發(fā)酵的壇子肉的風(fēng)味較為接近。 在氣味上， 135 d壇子肉、 75 d 壇子肉與其他壇子肉的差異較大（P＜0.01）；在滋味上， 60 d 壇子肉與其他壇子肉差異較大（P＜0.01）。

圖4 不同發(fā)酵時間的壇子肉的DFA 分析圖Fig. 4 DFA analysis of ceramic -pot sealed meat had different fermentation time

3 討 論

Illumina MiSeq 高通量測序檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間對壇內(nèi)菌相產(chǎn)生較大影響。 根據(jù)OUT 豐度、細(xì)菌Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)， 60 d 發(fā)酵的壇子肉及蘿卜絲的細(xì)菌菌群豐富度和多樣性均高于其他樣品，說明發(fā)酵促進(jìn)了壇內(nèi)細(xì)菌的生長繁殖。 當(dāng)發(fā)酵75 d 時，壇子肉、蘿卜絲的菌群豐富度及多樣性開始下降， 且在隨后的發(fā)酵時間內(nèi)呈波動下降趨勢， 這與優(yōu)勢菌群大量繁殖抑制雜菌有密切關(guān)系，這在2.3 的試驗結(jié)果中得到了證實。

根據(jù)2.2 的試驗結(jié)果，75 d 壇子肉、40 d 蘿卜絲的3 個樣品中均有1 個樣品離散在群體之外，這與試驗過程中開壇取樣有關(guān)。 為了確保壇內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定， 在壇子肉生產(chǎn)企業(yè)的實際生產(chǎn)中，發(fā)酵終止前是不能開壇的。此外， 2.2 與2.3 的試驗結(jié)果是一致的，即長時間發(fā)酵壇子肉（105、120、135 d）在菌群構(gòu)成上較為相似， 適中發(fā)酵時間的壇子肉（40、60、90 d）在菌群構(gòu)成上較為相似，而發(fā)酵75 d壇子肉與其他壇子肉在菌群構(gòu)成上存在較大差異，因此推斷，壇子肉發(fā)酵75 d 后若再繼續(xù)發(fā)酵，其細(xì)菌菌群組成將發(fā)生較大變化，并影響其特殊風(fēng)味的形成，這在2.4、2.5 的 試驗結(jié)果中得到了證實。

壇肉細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生酮醛酯等風(fēng)味物質(zhì)，賦予壇子肉特殊的風(fēng)味。 為了解發(fā)酵時間對壇子肉風(fēng)味的影響，首先采用壇子肉生產(chǎn)企業(yè)常用的感官評定法對不同發(fā)酵時間的壇子肉的風(fēng)味進(jìn)行評定，結(jié)果與企業(yè)的實際情況一致，不同發(fā)酵時間壇子肉在醬香味、鮮味、酸味、余味殘留、整體風(fēng)味均有明顯差異。整體風(fēng)味評分最高的是60 d 發(fā)酵壇子肉； 超過90 d 發(fā)酵時間的壇子肉的整體風(fēng)味評分極顯著降低（P＜0.01），且發(fā)酵時間越長風(fēng)味越差。結(jié)合壇內(nèi)細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行推斷，壇內(nèi)細(xì)菌菌群的改變影響了壇子肉的風(fēng)味。 根據(jù)電子鼻、電子舌繪制的不同發(fā)酵時間壇子肉的風(fēng)味指紋圖譜，進(jìn)一步證實了發(fā)酵時間對壇子肉風(fēng)味的影響，即壇內(nèi)細(xì)菌菌群影響壇子肉的風(fēng)味。 在氣味上，75 d 壇子肉與其他壇子肉的差異較大（P＜0.01）；滋味上， 60 d 壇子肉與其他壇子肉差異較大（P＜0.01）。綜上，本試驗結(jié)果與壇子肉生產(chǎn)企業(yè)的實際情況是相符合的，即壇子肉在冬季的生產(chǎn)發(fā)酵時間控制在60～75 d 內(nèi)較為適宜。

4 結(jié) 語

乳酸桿菌屬是壇子肉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，始終保持在99% 以上。 壇子肉發(fā)酵60 d 時，壇子肉中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性最高；發(fā)酵75 d 時，壇子肉菌群多樣性開始下降，且在隨后的發(fā)酵時間內(nèi)呈波動下降趨勢。 發(fā)酵75 d 壇子肉與其他發(fā)酵時間的壇子肉在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)上有較大差異，隨著發(fā)酵時間的延長，壇子肉中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與蘿卜絲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異變小。

發(fā)酵時間不僅壇子肉的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化，也會影響壇子肉的風(fēng)味。 根據(jù)傳統(tǒng)的人工感官評定結(jié)果，整體風(fēng)味評分最高的是60 d 發(fā)酵壇子肉，發(fā)酵時間不足以及過度發(fā)酵都會影響壇子肉的整體風(fēng)味。 電子鼻及電子舌分析發(fā)現(xiàn)，75 d 壇子肉與其他壇子肉在氣味上的差異較大（P＜0.01）， 60 d 壇子肉與其他壇子肉在滋味上差異較大（P＜0.01）。

綜上，壇內(nèi)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是與發(fā)酵時間密切相關(guān)的，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化會影響壇子肉特殊風(fēng)味的形成。 此外，壇子肉發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的種類及其含量尚未明確，本團(tuán)隊將繼續(xù)深入研究，為壇子肉的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)調(diào)控提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。