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      定點突變提高β-木糖苷酶Xln-DT 的酶活

      2021-05-18 00:35:46童欣怡姜云鵬蔣玉潔李冬冬趙林果
      關(guān)鍵詞:糖苷酶突變體緩沖液

      李 琦, 童欣怡, 姜云鵬, 蔣玉潔, 李冬冬, 趙林果

      (1. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京210037;2. 南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京210037)

      β-木糖苷酶(1,4-β-D-xylan xylohydrolase,EC 3.2.1.37)常與內(nèi)切木聚糖酶聯(lián)用,降解富含木聚糖的農(nóng)林植物纖維原料,繼而將木糖開發(fā)成可用于燃料、食品等行業(yè)中的系列化學(xué)品[1-2]。 此外,β-木糖苷酶也被越來越多地應(yīng)用于植物資源中帶有木糖基的天然活性物質(zhì)(如萜類、黃酮類、甾體類化合物)的生物轉(zhuǎn)化,進而獲得更強藥理活性的天然產(chǎn)物衍生物[3-5]。 無論是木聚糖的降解還是天然活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化,獲得活性高、專一性強、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)異的β-木糖苷酶是關(guān)鍵的技術(shù)。

      近年來,學(xué)者們已就β-木糖苷酶的來源、優(yōu)良菌種的篩選、基因克隆和表達等方面進行了大量的深入研究[6-7]。 然而,現(xiàn)有的β-木糖苷酶仍存在著含量少、酶活低、穩(wěn)定性差、底物特異性不佳等缺點,遠不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷革新,酶分子的體外定向進化技術(shù)已成為蛋白酶分子改造的有力工具[8]。 周海巖等[9]利用定點飽和突變技術(shù)將L-脯氨酸-4-羥化酶(P4H)的酶活提高了58%。 秦海彬等[10]在α-酮戊二酸半醛脫氫酶E120 位點處引入了天冬氨酸后, 酶活提高了322%。 蔡劉滕子等[11]利用定點突變技術(shù)對黑曲霉來源的木聚糖酶進行熱穩(wěn)定性改造,突變酶的最適溫度提高了5 ℃,45 ℃下的半衰期由7 min 提高到15 min。李琦等[12]通過定點突變技術(shù)在木聚糖酶MxynB的相應(yīng)位置引入二硫鍵, 并通過基因融合技術(shù)在N端融合了來源于嗜熱菌的纖維素結(jié)合域CBD,使原酶的溫度穩(wěn)定性顯著提高。

      由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的β-木糖苷酶Xln-DT[13]在大腸桿菌中的表達量較低,筆者通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子對接等手段確定了β-木糖苷酶Xln-DT 可突變的位點。 利用反向PCR 技術(shù)擴增突變基因、 構(gòu)建重組表達載體并獲得突變酶,并對比分析了突變前后的酶學(xué)性質(zhì), 旨在獲得酶活高、耐熱性能強的優(yōu)勢突變酶,為后續(xù)的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 菌種和質(zhì)粒

      大 腸 桿 菌Escherichia coli Top10F′ 、 E.coli BL21(DE3)和重組質(zhì)粒pET28a-xln-DT:均由南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院微生物技術(shù)研究室保藏;表達質(zhì)粒pET28a(卡那霉素(kana)抗性):購自美國Novagen 公司。

      1.2 培養(yǎng)基

      Lysogeny broth( LB)培養(yǎng)基:蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 1 g,溶于100 mL 蒸餾水中,121℃滅菌20 min 后備用,主要用于大腸桿菌菌種的活化及重組基因工程菌株的誘導(dǎo)表達。LB 固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂。

      1.3 酶和化學(xué)試劑

      Prime STAR HS DNA 聚 合 酶、T4 DNA 磷 酸 化激酶、T4 DNA 連接酶、dNTP、DL 5 000 DNA Marker等:購自日本TaKaRa 公司;蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準Marker: 購自美國Promega 公司; 質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、卡那霉素等:購自美國Axygen公司;胰蛋白胨、酵母提取物:購自英國Oxoid 公司;對硝基苯基-β-L-木糖苷(p NPX):購自美國Sigma公司;其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。 引物合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

      1.4 主要儀器

      PCR 儀:德國Eppendorf 公司產(chǎn)品;5415R 臺式高速冷凍離心機、SX-500 全自動高溫高壓蒸汽滅菌鍋:日本Tomy 產(chǎn)品;凝膠成像儀:美國Bio-rad 公司產(chǎn)品;ZHWY-2102C 搖床: 上海智誠產(chǎn)品;SpectraMax190 全波長酶標儀: 美國Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

      1.5 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測和相關(guān)軟件

      利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN 6.0 進行氨基酸序列分析并進行Blast 比對。 利用PyMOL、Swiss Model 和I-TASSER Server 軟件進行Xln-DT 蛋白結(jié)構(gòu)模擬和活性催化中心預(yù)測。

      基于I-TASSER Server 對Xln-DT 蛋白結(jié)構(gòu)進行 預(yù)測[14],在I-TASSER Server 在線網(wǎng)站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)上輸入β-木糖苷酶Xln-DT 的氨基酸序列, 得到蛋白質(zhì)的三維預(yù)測結(jié)果及配體結(jié)合位點的具體信息。

      1.6 酶與底物的分子對接

      從Pubchem 下載p NPX 分子2D 結(jié)構(gòu)[15],并以Sdf 格式保存,使用Schrodinger 2015 對p NPX 和β-木糖苷酶Xln-DT 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理, 并使用Glide 6.6[16]在該蛋白質(zhì)的配體結(jié)合位點處準備晶格文件,根據(jù)1.5 中獲得的配體結(jié)合位點,將晶格中心坐標設(shè)置為x:80.92,y:91.18,z:82.72, 配體對接框長度2.0 nm,蛋白質(zhì)的范德華半徑比例因子設(shè)為0.8,絕對部分電荷的截斷值設(shè)為0.15。 最后將預(yù)處理好的小分子p NPX 在晶格文件中進行對接, 軟件運行后獲得優(yōu)化的預(yù)測對接構(gòu)象。

      1.7 氨基酸親和性提高突變位點預(yù)測

      基于分子對接的結(jié)果, 使用BioLuminate 1.8[17]對p NPX 周圍的氨基酸(活性口袋處的氨基酸)進行飽和突變,計算突變前后的親和力變化,具體原理見圖1。根據(jù)突變能由高到低排序,挑選出突變能排序靠前的突變位點進行后續(xù)突變實驗。 計算時,將突變的氨基酸看作配體,余下的所有氨基酸看作受體。 在此情況下,親和力的改變可以用突變能ΔΔG(bind)來表征,該數(shù)值的負值代表著突變體比母體對小分子結(jié)合的更緊密。 具體計算公式為:

      式(1)中,ΔG1為非突變體自由能變化,kJ/mol;ΔG2為 突 變 體 自 由 能 變 化,kJ/mol;ΔG3為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的非突變體和突變體之間的自由能變化,kJ/mol;ΔG4為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的結(jié)合配體后非突變和突變體之間的自由能變化,kJ/mol。

      圖1 蛋白質(zhì)親和力改變的突變能計算原理圖Fig. 1 Schematic diagram of mutation energy calculation for protein affinity change

      1.8 實驗方法

      1.8.1 定點突變引物設(shè)計 利用同源建模、生物信息學(xué)分析、分子對接等手段,改變β-木糖苷酶Xln-DT 的部分氨基酸, 設(shè)計突變位點, 以嗜熱菌D. thermophilum DSM 3960 的GH39 家族的β-木糖苷酶基因序列xln-DT 為模板, 設(shè)計帶有酶切位點的引物,每個突變位點設(shè)計正反向兩條寡核苷酸序列,見表1。 利用反向PCR 技術(shù)獲得突變序列。

      表1 定點突變引物表Table 1 Nucleotide sequences of used primers

      1.8.2 定點突變實驗方案 將上、 下游引物用TE緩沖溶液稀釋成10 μmol/L 工作液,以pET28a-xln-DT 為模板, 利用反向PCR 技術(shù)獲得重組突變表達質(zhì)粒。

      PCR 反應(yīng)體系如下:0.5 μL pET28a-xln-DT,各1.0 μL 的引物F 和引物R,4.0 μL dNTP Mixture,10.0 μL 5×PS 緩沖液,0.5 μL Prime STAR HS DNA聚合酶,44 μL 蒸餾水。

      PCR 反應(yīng)條件如下:98 ℃保溫5 min,98 ℃變性0.5 min,60 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸4.5 min,18個循環(huán),72 ℃延伸10 min 后于4 ℃保持。 將擴增后PCR 片段于37 ℃下磷酸化反應(yīng)1 h, 加入1 μL T4 ligase 連接酶,于16 ℃下連接3 h 后在42 ℃水浴鍋中熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli Top 10F′感受態(tài)細胞中,挑取單菌落接入到含有Kana 抗性的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒后進行測序鑒定。

      1.9 突變酶的酶活測定、純化及SDS-PAGE 分析

      將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET-28a-xln-DT-161、pET-28a-xln-DT-167、pET-28a-xln-DT-202 和pET-28a-xln-DT-231 熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中。 挑取單菌落至5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中, 加入0.01 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)過夜誘導(dǎo)表達后離心,沉淀加入檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)重懸,經(jīng)超聲破碎后離心10 min,上清液即為粗酶液。將收集的粗酶液進行酶活測定,以pNPX 為底物,根據(jù)文獻[18]進行酶活測定。酶活定義如下:75 ℃、pH 6.0 時每分鐘產(chǎn)生摩爾質(zhì)量為1 mmol 對硝基苯酚所需的酶量為1 個酶活單位。

      酶的純化方式如下:Ni2+親核層析柱平衡后,將粗酶液以1 mL/min 上樣,將25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液以同流速洗去未吸附的酶蛋白及雜質(zhì); 隨后用200 mmol/L 的咪唑緩沖液進行洗脫, 并收集蛋白質(zhì);純化后的酶液經(jīng)透析除鹽后進行SDS-PAGE 分析。 目的蛋白質(zhì)采用Bradford 法進行蛋白質(zhì)濃度的測定。 酶活(A)以及比酶活(B)的計算公式如下:

      式中:c 為由對硝基苯酚標準方程計算出的酶反應(yīng)后的對硝基苯酚的量,μmol;t 為酶與底物反應(yīng)時間,min;V1為反應(yīng)體系總體積,mL;V2為酶液體積,mL;N 為酶液稀釋倍數(shù);C 為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL。

      1.10 突變酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

      最適溫度: 在pH 6.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中,分別測定突變酶和Xln-DT 在65、70、75、80、85℃下的酶活, 以測定的最高酶活為100%計算相對酶活,最高酶活對應(yīng)的溫度即為最適溫度。

      最適pH:在各自的最適溫度下,分別測定突變酶和Xln-DT 在pH 值為4.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 下的酶活,以測定的最高酶活為100%計算相對酶活,最高酶活對應(yīng)的pH 即為最適pH。

      溫度穩(wěn)定性: 將酶質(zhì)量濃度分別為1.10、1.25、1.29、1.09 mg/mL 的野生型酶Xln-DT、突變酶Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下分別保溫30、60、90、120、180、240 min,以未育溫的酶液所測定的酶活為100%計算剩余酶活力,即為溫度穩(wěn)定性。

      pH 穩(wěn)定性:在4 ℃下,分別將突變酶和Xln-DT置于不同pH 值(4.0~7.0)的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中保存24 h, 在最適溫度及最適pH 下測定其殘余酶活力, 以未經(jīng)pH 緩沖液處理的酶液所測定的酶活為相對100%,即為pH 穩(wěn)定性。

      耐木糖系數(shù)Ki:在添加不同濃度木糖的反應(yīng)體系中,在最適溫度和pH 下測定突變酶和Xln-DT 的酶活力值,以不加糖所測的酶活力值為100%,計算并獲得不同木糖濃度下重組酶的相對酶活力值,以相對酶活力值為50%時所對應(yīng)的木糖濃度即為Ki。

      動力學(xué)常數(shù):以p NPX 為底物,底物濃度范圍為0.01~3.00 mmol/L, 分別測定純化后的突變酶和Xln-DT 的酶活。采用雙倒數(shù)作圖法[19]計算突變酶和Xln-DT 的動力學(xué)參數(shù)(Vmax,Km,Vmax/ Km)。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 突變位點的選擇

      由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的Xln-DT蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析,基于PDB 在線數(shù)據(jù)庫中來源于Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的GH 39 家族的β-木糖苷酶XynB (1UHV)[20]與Xln-DT 具有70.18%的同源性。 利用Swiss-Model 在線軟件對Xln-DT 進行同源建模,使用可視化工具PyMOL 對Xln-DT 進行結(jié)構(gòu)模擬,結(jié)果見圖2。 利用Glide 6.6軟件對人工底物p NPX 與β-木糖苷酶Xln-DT 進行分子對接,計算篩選出3 個正相關(guān)的關(guān)鍵突變位點(GLU161、CYS202 和TYR231) 和1 個陰性對照位點(PHE167),見表2。

      圖2 β-木糖苷酶Xln-DT 的分子模型Fig. 2 Molecular model of Xln-DT

      表2 Xln-DT 突變能計算Table 2 Calculation of Xln-DT mutation energy (binding)

      2.2 突變體重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達

      以重組表達質(zhì)粒pET-28a-Xln-DT 為模板,通過反向PCR 引入6 個位點的氨基酸基因,經(jīng)測序驗證所有點突變編碼正確。 將突變正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞,隨機挑取轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)表達結(jié)果見圖3。 當GLU161 突變成HIS 和LEU、TYR231 突變成TRP 之后, 酶活喪失, 而CYS202 突變成PHE 和LEU 后酶活分別提高了3.28 和2.97 倍, 而PHE167 突變成ALA 之后酶活降低了50%。 結(jié)合表2 中突變能的預(yù)測數(shù)值可知, 除去經(jīng)試驗驗證的酶活喪失的陰性突變體GLU161HIS、TYR231TRP、GLU161LEU 外, 突變體CYS202PHE、CYS202LEU、PHE167ALA 的ΔΔG 逐次升高,分別為-1.22、-1.15、1.33,而實驗結(jié)果顯示這3 個突變體表達的酶活則依次降低,由此可見ΔΔG 的數(shù)值為負值且數(shù)值越小,突變體比野生型原酶對小分子的結(jié)合越緊密,理論上較野生型原酶的親和力就越強,從而可通過提高突變體的比酶活來提高表達的酶活力。 因此,為了驗證此猜想,作者對各突變體及野生型原酶進行了純化,以比較其比酶活、動力學(xué)參數(shù)等。

      圖3 酶活提高關(guān)鍵位點突變后的酶活Fig. 3 Enzyme activity after mutation of key site for enzyme activity improvement

      收集發(fā)酵后的Xln-DT 及突變體經(jīng)鎳柱純化后, 獲得電泳純的Xln-DT、Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 多位點突變體,見圖4。 將純化后的Xln-DT 和突變體分別測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和比酶活,其中,CYS202 突變成PHE 和LEU 后,比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍,由此可知,202 位點為酶活提高的關(guān)鍵氨基酸位點。

      圖4 重組酶Xln-DT 及突變體的蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE of recombinant protein Xln-DT and 202/167 mutants

      2.3 突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究

      2.3.1 突變體的最適溫度和最適pH 突變體酶和Xln-DT 的最適溫度見圖5(a)。 Xln-DT 的最適溫度為75 ℃, 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-167ALA 的最適溫度維持不變,而Xln-DT-202LEU則升高至80 ℃。

      突變體酶和Xln-DT 的最適pH 見圖5(b)。Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適pH 由原酶的6.0 分別下降至4.5 和5.0, 而Xln-DT-167ALA 則降為5.0。

      圖5 202/167 突變體的最適溫度和最適pHFig. 5 Optimal temperature and p H values of 202/167 mutants

      2.3.2 突變體的溫度穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性 對突變體酶和Xln-DT 在75、85 ℃下的熱穩(wěn)定性進行研究,結(jié)果見圖6。突變體Xln-DT-202PHE 在75 ℃下的溫度穩(wěn)定性有顯著提高,保溫2 h 后,剩余酶活力仍能保持100%。 而突變體Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下的溫度穩(wěn)定性均有明顯下降。 由圖1 可知,配體的自由能不變, 所以當突變體的△△G 為負值時,可理解為突變酶蛋白質(zhì)的自由能均小于野生型酶蛋白的自由能,而自由能越小酶越穩(wěn)定,因此表現(xiàn)為突變酶的熱穩(wěn)定性提高。

      圖6 202/167 突變體的溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Temperature stability of mutants 202/167

      突變體酶和Xln-DT 的pH 穩(wěn)定性結(jié)果見圖7。突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 在pH 值為4.0~7.0 的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較原酶略有下降,但仍能保持80%以上的相對酶活力。

      圖7 202/167 突變體的p H 穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of 202/167 mutants

      2.3.3 突變體的耐糖系數(shù)Ki和動力學(xué)參數(shù) 將純化后的Xln-DT 和突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 分別測定耐糖系數(shù)Ki和動力學(xué)常數(shù),結(jié)果見表3。 其中,突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的Km值較原酶Xln-DT 相比下降明顯,說明其對p NPX 的親和力提高了,這與預(yù)測的△△G 結(jié)果一致,見表2。 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 突變后△△G為負值,對配體的親和力更強;突變后的Ki系數(shù)顯著降低,由原酶的3 394 mmol/L 降低到249 mmol/L和592 mmol/L, 但仍要高于已報道的β-木糖苷酶,尤其是GH 3 家族來源的β-木糖苷酶[18]。 而突變體Xln-DT-167ALA 動力學(xué)常數(shù)Km、Vmax變化不大,耐糖系數(shù)Ki則下降至1 023 mmol/L。

      表3 202/167 突變體耐糖系數(shù)和動力學(xué)參數(shù)Table 3 Xylose tolerance coefficient and kinetic parameters of 202/167 mutants

      3 結(jié) 語

      以來源于D. thermophilum 的β-木糖苷酶Xln-DT 為研究對象,通過分子對接、定點突變和酶學(xué)性質(zhì)分析等手段, 對Xln-DT 的酶活提高關(guān)鍵位點進行研究,主要結(jié)論如下:

      1) 利用I-TASSER Server 在線軟件對Xln-DT進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測, 利用p NPX 與Xln-DT 分子對接計算篩選出基于酶活提高的關(guān)鍵氨基酸位點202, 并獲得突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU。

      2)與Xln-DT 相比,突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的酶活分別提高了3.28 和2.97倍,比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍。Km值也較原酶小, 說明突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 對p NPX 的親和力提高, 但突變后的Ki系數(shù)顯著降低。

      3)與Xln-DT 相比,突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適溫度維持不變;最適pH 則下降明顯。 突變體Xln-DT-202LEU 的溫度穩(wěn)定性有顯著提高; 而所有突變體的pH 穩(wěn)定性均有不同程度下降,但仍能保持80%以上的相對酶活力。

      研究結(jié)果不但顯著提高了酶的活力,而且熱穩(wěn)定性也得到顯著改善,從而為該酶的進一步改造和實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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