金樹霞， 王 力， 朱 莉， 李菲菲， 劉麗萍，詹曉北， 鄭志永，4， 高敏杰*

（1． 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2． 江蘇艾津農(nóng)化有限責(zé)任公司，江蘇 南京211511；3． 無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫2141254；4． 江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

熱凝膠主要由土壤桿菌在氮源受限的情況下合成[1]，是一種不溶于水且由β-1，3-糖苷鍵連接的直鏈線性葡聚糖[2]，其水解產(chǎn)物β-1，3-葡寡糖具有多種生理功能，例如誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素[3]，觸發(fā)人類單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α（TNF-α）[4]，刺激植物防御反應(yīng)[5]，并抑制人的α-淀粉酶[6]，在保健品、食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。 目前酶解法與酸解法是商品熱凝膠水解的常用方法[7]，酸解法反應(yīng)條件復(fù)雜、難以控制、產(chǎn)率低且易造成環(huán)境污染；酶解法反應(yīng)條件溫和、易于控制與操作、產(chǎn)率高，是當(dāng)下熱凝膠水解的研究熱點(diǎn)，但是市面上銷售的β-1，3-葡聚糖酶是內(nèi)切酶與外切酶的混合物，不能專一的水解熱凝膠且高活性的葡聚糖酶比較少。

作者所在研究室前期研究中利用哈茨木霉GIM3.442 生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶， 發(fā)現(xiàn)其能有效水解熱凝膠[8]。 基于此，作者所在研究室建立了土壤桿菌-哈茨木霉及畢赤酵母-土壤桿菌[9-10]兩種共培養(yǎng)體系，可直接獲得熱凝膠寡糖。 但是仍然存在很多不足：1）哈茨木霉在產(chǎn)生內(nèi)切酶的同時還會產(chǎn)生外切酶，且外切酶占總酶量的70%～80%[11]，其水解產(chǎn)物主要是葡萄糖；2）哈茨木霉對剪切力敏感且會在一定程度上抑制土壤桿菌的生長且不易放大[10]；3）畢赤酵母中表達(dá)出來的酶活比較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到我們的需求，有待于進(jìn)一步提高。近年來，定向進(jìn)化越來越受到學(xué)者們的關(guān)注，酶的定向進(jìn)化是一種蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計， 可人為創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外改造基因，從構(gòu)建的突變庫中定向選擇出符合目的的突變酶[12]。 由于操作簡單、快捷且有效，易錯PCR 成為定向進(jìn)化最為常用的手段之一[13-14]。 有關(guān)定向進(jìn)化內(nèi)切葡聚糖酶的報道比較多[15]，雖然酶活性提高方面也有報道[16-18]，但主要集中在pH 與熱穩(wěn)定性等方面的研究[19-21]。作者通過定向進(jìn)化策略對來源哈茨木霉GIM3.442 的內(nèi)切β-1，3-葡 聚 糖 酶 基 因 （GenBank Accession：X84085.1）進(jìn)行定向進(jìn)化，通過高通量篩選手段獲得了高酶活的突變酵母菌株，并將獲得的突變體酶與親本酶蛋白質(zhì)純化，進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 菌株與載體見表1。

表1 菌株與載體Table 1 Strains and vectors

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、Sal I、Taq Premix、DNA maker、DNA 連接酶（Solution I） 、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit 和DNA 純化試劑盒：購自TaKaRa 生物公司（大連）；Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒、 質(zhì)粒小量抽提試劑盒、氨芐青霉素：購自上海生工有限公司；DNA 膠回收試劑盒： 購自上海康寧公司； 薄層層析板（Thin layer chromatography，TLC Silica gel 60）： 購自北京綠百草科技有限公司；其他生物與化學(xué)試劑：均為國產(chǎn)或進(jìn)口試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：甘油20，酵母粉10，蛋白胨20，YNB 13.4， 生物素4×10-4， 瓊脂20；100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 6）。

雙層鑒別培養(yǎng)基： 下層為甘油20 g/L， 酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，YNB13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，瓊脂20 g/L，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 6）；上層為2 g/L 的熱凝膠懸浮液1 mL，瓊脂0.04 g/L，100 mmol/L 乙酸緩沖液 （pH 5.5） 5 mL，1 g/L 的剛果紅5 mL，1 mol/L NaCl 5 mL。

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR 擴(kuò)增及突變體庫構(gòu)建 根據(jù)已知的哈茨木霉（T. harzianum）GIM3.442 的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因（GenBank Accession：X84085.1）設(shè)計引物， 同時在上下游引物中引入EcoR I 和Not I 兩個酶切位點(diǎn)，引物見表2，由上海生工合成，PCR 擴(kuò)增出的片段為2 340 bp。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

以質(zhì)粒pMD19-T-BGN13.1a 為模板，易錯PCR擴(kuò)增體系中各種試劑的添加量按照Diversify PCR RandomMutagenesisKit 的說明書進(jìn)行，體系為50 μL，見表3。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；接著運(yùn)行以下25 個循環(huán)（94 ℃變性30 s，68 ℃延伸150 s）；然后68 ℃再延伸60 s，最后4 ℃保溫。

表3 易錯PCR 擴(kuò)增體系Table 3 Error-prone PCR amplification system

易錯PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳后，純化回收目的條帶。純化后的易錯PCR 產(chǎn)物與表達(dá)載體pGAP9k 經(jīng)EcoR I 和Not I 于37 ℃雙酶切后進(jìn)行膠回收，將膠回收后的目標(biāo)條帶與表達(dá)載體按照比例混合后加入DNA 連接酶連接過夜， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞中并涂布于LB （含有100 μg/mL 的Amp） 平板上（表面涂有IPTG 和XGal），37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到大量滲入不同突變的重組質(zhì)粒。 提取這些重組質(zhì)粒并經(jīng)Sal I 線性化后， 于2.5 kV 電轉(zhuǎn)入感受態(tài)P. pastoris GS115 中，涂布于MD 平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，構(gòu)建內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因突變體庫。

1.2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定 將MD 平板上長出的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種到Y(jié)PD 平板上，并同時復(fù)制到一塊BMGY 平板上。 YPD 平板于30 ℃培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，提取基因組，進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。BMGY 平板于30 ℃培養(yǎng)3～4 d，取5 mL 熱凝膠半固體 （2 g/dL 熱凝膠懸浮液1 mL，0.8 g/dL 瓊脂，5 mL 100 mmol/L 的醋酸鹽緩沖液） 覆蓋在上面，待凝固后，用封口膜封閉好，將其置于50 ℃保溫2 h，加入0.1%的剛果紅染色，用剛果紅染色法篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

挑取比值大且含有目的基因的轉(zhuǎn)化子于30 ℃、200 r/min 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)4 d，同時將原始菌株（重組畢赤酵母） 活化并在30 ℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵4 d。 將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清液作為粗酶液測定酶活力，并在相同的操作下測定原始菌株與突變菌株的酶活，重復(fù)測定3 次，每次3 個平行，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

酶活測定參照文獻(xiàn)[7]略做改動，酶反應(yīng)體系為：1.5 mL 預(yù)處理的2 g/dL 的熱凝膠懸浮液、2.5 mL pH 5.5 的0.1 mol/L 的醋酸鹽緩沖液，1 mL 酶液，50 ℃反應(yīng)2 h，沸水浴10 min，參照文獻(xiàn)[22]對蒽酮比色法稍作改動，并測定水解液中的總糖質(zhì)量濃度。 1 個酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1 μmol 還原糖（以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)）所需要的酶量。

1.2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證 將獲得的突變菌株K827 進(jìn)行5 次傳代，經(jīng)過搖瓶（100 mL/500 mL）在30 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)4 d， 測定其各代的內(nèi)切酶的酶活、生物量、發(fā)酵結(jié)束后的pH 等來驗(yàn)證菌種的產(chǎn)酶能力是否穩(wěn)定。

1.2.4 突變株K827 的SDS-PAGE 分析 將突變株K827 與原始菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)4 d，按測酶活方法獲得粗酶液，進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，將經(jīng)過純化的酶液與4×SDS-PAGE loading buffer 混勻，沸水浴處理10 min，冷卻，離心后取20 μL 上清液進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳分析，操作過程見文獻(xiàn)[23]。

1.2.5 突變酶K827 水解產(chǎn)物分析 將突變體酶K827 的發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清得到粗酶液，按照文獻(xiàn)[7]配制酶反應(yīng)體系：1.5 mL 預(yù)處理的2 g/dL 的熱凝膠懸浮液、2.5 mL pH 5.5 的0.1 mol/L 的醋酸鹽緩沖液，1 mL 酶液，置于50 ℃水浴鍋，保溫2 h，煮沸10 min， 8 000 r/min離心10 min，取上清液（水解產(chǎn)物）測定酶活，重復(fù)測定3 次，將水解液進(jìn)行TLC 薄層色譜及MALDITOF MS 分析。

1.2.6 突變株K827 內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1） 突變株K827 內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH 與酸堿穩(wěn)定性 在2.5 mL 0.1 mol/L 不同pH 的醋酸鹽緩沖液中分別加入1.5 mL 預(yù)處理的2 g/dL 的熱凝膠懸浮液和1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液，置于50 ℃水浴鍋，保溫2 h，煮沸10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，測定酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。 將原酶液置于不同pH 值的緩沖液中，4 ℃保溫12 h， 然后在其最適pH 值下配制酶反應(yīng)體系，置于50 ℃水浴鍋，保溫2 h，煮沸10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，測定剩余酶活，從而確定pH 穩(wěn)定性。

2） 突變株K827 內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性 首先，在最適反應(yīng)pH 條件下配制酶反應(yīng)體系：1.5 mL 預(yù)處理的2 g/dL 的熱凝膠懸浮液，2.5 mL 0.1 mol/L 的醋酸鹽緩沖液，1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，分別在不同的溫度梯度下保溫2 h，煮沸10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，然后測定酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。 然后再將適當(dāng)稀釋的酶液置于不同的溫度梯度下，保溫100 min，每隔20 min 取樣，再配制酶反應(yīng)體系，在50 ℃水浴鍋中保溫2 h，煮沸10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，測定剩余酶活，從而測定其熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯PCR 與突變體庫的構(gòu)建

目的基因BGN13.1a 的大小為2 340 bp， 以質(zhì)粒pMD19-T-BGN13.1a 為模板，按照Diversify PCR Random Mutagenesis Kit 的說明書進(jìn)行易錯PCR，見圖1。 在2 400 bp 附近有條帶出現(xiàn)（泳道1），說明目的基因已經(jīng)成功滲入突變。

圖1 易錯PCR 的電泳圖Fig. 1 Patterns of error-prone PCR

經(jīng)Amp 抗性及藍(lán)白斑雙重篩選后，將長出的白色菌落全部接種到一個搖瓶里培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒， 線性化電轉(zhuǎn)入感受態(tài)P. pastoris GS115 酵母菌中，MD 平板上長出的轉(zhuǎn)化子即為構(gòu)建好的目的基因突變體庫。

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

提取陽性轉(zhuǎn)化子的基因組， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示每一個陽性轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出2 340 bp 的條帶，說明滲入突變的內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因已經(jīng)成功導(dǎo)入到畢赤酵母中。對BMGY 平板長出的菌落， 進(jìn)行底物覆蓋2 h 及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% 剛果紅染色1 h，再用1 mol/L NaCl 脫色多次。 若轉(zhuǎn)化子具有酶活，那么菌落周圍會出現(xiàn)明顯的透明光圈，透明光圈與菌落的比值越大，說明轉(zhuǎn)化子的酶活越高[24]。最終篩選得到一株高酶活的突變株，命名為K827。

挑取突變株K827，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時將原始菌株進(jìn)行培養(yǎng)，離心取上清液，測定兩者的酶活，突變株K827 水解熱凝膠的比酶活為（82.42±0.75）U/mg，比原始菌株（65.84±0.62） U/mg 提高了25%。

2.3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

為檢測最終獲得的突變株K827 產(chǎn)BGN13.1a的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)了5 代，測定各代發(fā)酵參數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 突變株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證Table 4 Genetic stability verification of mutant strains

從表4 可以看出， 各代菌株發(fā)酵結(jié)束時的pH在6.38 左右，生物量在8.00 左右，酶活在62.22 U/mL左右。 發(fā)現(xiàn)該突變株在每一次傳代培養(yǎng)結(jié)束時的酶活、生物量及發(fā)酵結(jié)束后的pH 均未發(fā)生明顯變化，說明該突變株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定， 各項(xiàng)參數(shù)較為穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 突變酶K827 的SDS-PAGE 分析

軟件Expasy 預(yù)測目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在70 000 左右，見圖2。 泳道M、1、2 依次為蛋白質(zhì)Marker（High）、純化的野生型BGN13.1a、純化的突變株K827， 其中泳道1、2 在70 000 附近都出現(xiàn)條帶，說明表達(dá)的目的蛋白質(zhì)與預(yù)期相符。

圖2 野生型和突變體酶K827 的SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the wild-type and the mutant enzyme K827

2.5 突變酶K827 水解產(chǎn)物分析

通過TLC 薄層色譜及MALDI-TOF MS 分析突變體酶K827 水解熱凝膠的產(chǎn)物，結(jié)果見圖3。由圖3 可知， 目標(biāo)糖的質(zhì)荷比 （m/z） 分別為365.146、527.149、689.177、851.249、1 013.324、1 175.393、1 337.46、1 499.51、1 661.558， 顯示突變體酶K827 水解熱凝膠產(chǎn)物的聚合度主要為DP=2～10，這與TLC 薄層色譜結(jié)果一致。 同時通過TLC薄層色譜與Image J 軟件定量得出DP=2～10 的寡糖產(chǎn)量分別為0.348、0.519、0.419、0.079、0.017、0.078、0.015、0.011、0.006 g/L，共1.492 g/L。

圖3 突變體酶K827 水解產(chǎn)物薄層層析和MALDI-TOF MS 分析結(jié)果Fig. 3 TLC and MALDI-TOF MS analysis of mutant enzyme K827 hydrolysate

2.6 突變株K827 內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 突變株K827 酶的最適反應(yīng)pH 將酶反應(yīng)的0.1 mol/L 的醋酸鹽緩沖液的pH 配成4.5～7.5（梯度為0.5），按照文獻(xiàn)[7]配制酶反應(yīng)體系，置于50 ℃水浴鍋，保溫2 h，煮沸10 min，測定酶活，重復(fù)測定3 次，定義最高酶活為100%。結(jié)果表明：突變體酶與原始酶的最適反應(yīng)pH 值為5.5， 突變體酶在pH 4.5～6 的酶活力可達(dá)到80%以上， 而原始酶的酶活力在pH 5～5.5 才能達(dá)到80%以上，結(jié)果見圖4（a），由此可見，與原始酶相比，突變體酶在更寬的pH 范圍，都能保持較高的酶活性。

2.6.2 突變株K827 酶的pH 穩(wěn)定性 將酶置于pH 4.5～7.5（梯度為0.5） 0.1 mol/L 的醋酸鹽緩沖液中，于4 ℃處理12 h，按照文獻(xiàn)[7] 配制酶反應(yīng)體系，置于50 ℃水浴鍋，保溫2 h，煮沸10 min，測定酶活，重復(fù)測定3 次，定義最高酶活為100%。 結(jié)果表明，突變體酶與原始酶在pH 4.5～6.5 的緩沖液中4 ℃處理12 h， 突變體酶在pH 5～6 剩余酶活力保持90%以上， 而原始酶只能在最適pH 附近剩余酶活達(dá)到90%以上，結(jié)果見圖4（b），由此可見，與原始酶相比，突變體酶的pH 穩(wěn)定性有明顯提高。

圖4 突變體酶的最適p H 與pH 穩(wěn)定性Fig. 4 Optimal pH and pH stability of the mutant endonuclease

2.6.3 突變株K827 酶的最適反應(yīng)溫度 將按照文獻(xiàn)[7]配制的酶反應(yīng)體系置于30～70 ℃（梯度為5 ℃）的水浴鍋中，保溫2 h，煮沸10 min，測定酶活，定義最高酶活為100%，見圖5（a）。結(jié)果表明，突變體酶與原始酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃， 突變體酶在40～55 ℃范圍內(nèi)酶活可達(dá)到60%以上，而原始酶在50 ℃附近才能達(dá)到60%以上。 由此可見，突變體酶在更寬的溫度范圍內(nèi)都能保持較高的酶活性。

2.6.4 突變株K827 酶的熱穩(wěn)定性 將突變體酶與原始酶的酶液用pH 5.5 的緩沖液稀釋后，置于30～70 ℃（梯度為10 ℃）中保溫，每隔20 min 取樣，取完后立即冰浴，并按照文獻(xiàn)[7]配制酶反應(yīng)體系，于50 ℃測定剩余酶活， 定義最高酶活為100%（圖5（b）、（c）、（d）、（e）、（f））。 結(jié)果表明，突變體酶在30、40 ℃處理100 min 后，剩余酶活仍可保持在60%以上，而原始酶在30～70 ℃范圍內(nèi)處理100 min，其剩余酶活都不能達(dá)到60%。 由此可見，與原始酶相比，突變體酶的熱穩(wěn)定性有明顯提高。

3 結(jié) 語

作者通過對野生型酶BGN13.1a 進(jìn)行基因突變，獲得了最佳突變體酶K827，酶活較原始菌提高了25%。 在獲得熱凝膠寡糖的水解體系中，相比較野生型酶， 同等條件下的突變體酶K827 能夠提高熱凝膠的水解效率、縮短熱凝膠水解時間，寡糖產(chǎn)量為1.492 g/L（聚合度2～10），該突變菌株具有較強(qiáng)的開發(fā)和應(yīng)用潛力。

圖5 突變體酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig. 5 Optimal temperature and temperature stabilityof mutant endonuclease