陳夙,朱夢琳,宋加昊,徐雪,孫樂雯,陳文芳

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種多功能的膠質(zhì)細(xì)胞，與其他類型細(xì)胞相互作用發(fā)揮著多種生理功能[1-2]。近年來星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用被廣泛報道，有研究顯示，阿爾茨海默病(AD)病人大腦皮質(zhì)淀粉樣斑塊周圍存在大量反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[3-4]，并伴有一些促炎細(xì)胞因子或炎癥標(biāo)志物的表達(dá)增加[3]。炎性因子及β-淀粉樣蛋白能夠直接誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[5-6]，形成有害的神經(jīng)炎癥循環(huán)。越來越多的研究表明，神經(jīng)炎癥貫穿于AD發(fā)生發(fā)展的始終[7-8]。因此，針對星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的AD炎癥病理，開發(fā)有效的抗炎藥物，可能有助于減緩AD的發(fā)生發(fā)展。既往研究表明，傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷可以通過限制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激在AD病理中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[9-10]，而淫羊藿素(ICT)作為淫羊藿苷的代謝衍生物，也具有很強的抗炎作用[11-12]。研究已顯示，ICT能夠與雌激素受體(ER)結(jié)合，發(fā)揮類雌激素樣作用[13]。胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)介導(dǎo)的信號途徑參與大腦發(fā)育、突觸傳遞等功能[14]。ER與IGF-1R在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有廣泛的共表達(dá)[15-16]。有研究表明，IGF-1R可以與ER相互作用，協(xié)同促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的增殖并抑制炎癥[17]。本實驗室前期的研究已經(jīng)證實，10 μmol/L的ICT可以通過ER信號途徑對抗脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的原代中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[18]，在整體動物水平，ICT能夠通過IGF-1R信號途徑抑制海馬炎癥反應(yīng)[19]。但是IGF-1R信號通路是否參與ICT對抗LPS誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，目前尚不清楚。本研究應(yīng)用LPS誘導(dǎo)原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)，探討ICT對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達(dá)的影響以及JB-1的阻斷作用，以期為AD提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ICT購自上海同田生物公司，應(yīng)用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 mmol/L的溶液；LPS及JB-1購自Sigma公司，用無菌生理鹽水配制成1 g/L的溶液；DMEM/F12培養(yǎng)液和胎牛血清購自BI公司；青霉素/鏈霉素儲存液購自新華制藥廠，分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；多?D-賴氨酸(poly-D)購自Sigma公司；新生SD大鼠(<24 h)購自青島大任富城畜牧有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR Green購于Takara公司；引物由Takara公司設(shè)計并合成。

1.2 原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組

在超凈工作臺中將新生SD大鼠斷頭，取腦，置于含有DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，在體式顯微鏡下分離大腦皮質(zhì)，剝除腦膜和血管。用槍頭輕輕吹打，使腦組織呈離散狀態(tài)，收集細(xì)胞懸液至大離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打混勻。接種于20 g/L poly-D包被的150 cm2培養(yǎng)瓶中，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，期間每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿瓶底，呈現(xiàn)明顯分層時，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，以210 r/min震蕩16～18 h后，棄掉上清，用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗細(xì)胞3次，加2.5 g/L胰蛋白酶消化1～3 min，用含血清的完全培養(yǎng)液終止消化。將貼于培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞輕柔吹下，收集于大離心管中，以1 000 r/min離心5 min后，加入完全培養(yǎng)液后吹打混勻。將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，在光鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行分組和加藥處理。將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(A組)、LPS組(B組)、ICT+LPS組(C組)以及JB-1+ICT+LPS組(D組)。對照組細(xì)胞給予體積分?jǐn)?shù)0.01的DMSO處理；LPS組細(xì)胞則給予1 mg/L的LPS處理6 h；ICT+LPS組細(xì)胞給予LPS前先給予ICT(10 μmol/L)預(yù)保護(hù)1 h；JB-1+ICT+LPS組細(xì)胞先給予1 mg/L的JB-1作用1 h，繼而給予ICT(10 μmol/L)處理1 h，最后加入LPS共同作用6 h。

1.3 實時熒光定量PCR方法檢測TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)

應(yīng)用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求配制兩步反應(yīng)體系，經(jīng)過42 ℃變性2 min，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，然后升溫至85 ℃，作用5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，于4 ℃冷卻，將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測目的基因TNF-α、iNOS及內(nèi)參照基因GAPDH表達(dá)，按照熒光定量PCR說明書配制PCR反應(yīng)體系，采用兩步法經(jīng)過40個循環(huán)完成擴(kuò)增，采用2-△△CT法計算基因相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

與對照組比較，LPS組原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的TNF-α和iNOS基因表達(dá)明顯上調(diào)(F=81.98、118.60，q=20.41、25.22，P<0.01)；ICT預(yù)保護(hù)能明顯降低由LPS誘導(dǎo)的TNF-α和iNOS基因表達(dá)的上調(diào)(q=7.34、13.31，P<0.01)，此作用可以被IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷(q=4.65、7.52，P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α和iNOS基因表達(dá)比較

3 討 論

越來越多的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的漸進(jìn)激活以及隨之而來的促炎因子的過度產(chǎn)生，是神經(jīng)炎癥過程中的主要因素[20]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的膠質(zhì)亞型[21-22]，可與神經(jīng)元等多種類型細(xì)胞相互作用[23]。在許多AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，常常在淀粉樣斑塊和(或)神經(jīng)元纖維纏結(jié)這兩個病理學(xué)特征出現(xiàn)之前，觀察到激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞在皮質(zhì)、海馬等受影響的腦區(qū)積聚[24-25]。并且體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣斑塊周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[26]，炎癥遞質(zhì)在β-淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)周圍高表達(dá)[27]。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，或許可以減緩AD的病理進(jìn)程。

傳統(tǒng)中藥淫羊藿的成骨作用以及調(diào)節(jié)性功能、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用曾被廣泛報道，但是近年來人們認(rèn)識到了其具有神經(jīng)保護(hù)作用[28-29]。ICT是來源于淫羊藿的一種黃酮類化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理活性[30]。已有研究結(jié)果顯示，在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥和腹膜炎模型中，ICT可以顯著減少iNOS、白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎性因子的產(chǎn)生[11]，而在神經(jīng)系統(tǒng)中ICT可以抑制LPS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠的海馬神經(jīng)炎癥[31]。為了探討ICT的抗炎神經(jīng)保護(hù)作用，本研究利用LPS誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，觀察ICT對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞TNF-α和iNOS基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，LPS可明顯上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子TNF-α和iNOS的基因表達(dá)，應(yīng)用ICT預(yù)保護(hù)可明顯抑制兩種炎性因子的基因表達(dá)。

IGF-1R主要表達(dá)于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，是IGF-1的直接作用靶點，并且在皮質(zhì)、海馬有較高水平的表達(dá)[32]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，激活I(lǐng)GF-1R信號通路可以抑制神經(jīng)毒素對多巴胺能神經(jīng)元的損傷[33]。為進(jìn)一步探討IGF-1R信號通路是否參與了ICT抗皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，本研究觀察了IGF-1R特異性阻斷劑JB-1對ICT的阻斷效應(yīng)，結(jié)果顯示JB-1預(yù)處理部分阻斷了ICT的抗炎保護(hù)作用。提示ICT的抗炎機(jī)制可能與IGF-1R信號途徑的激活有關(guān)，其他的信號途徑可能也參與了ICT的抗炎作用。

綜上所述，ICT能夠抑制LPS誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和iNOS的基因表達(dá)，其抗炎機(jī)制可能與IGF-1R信號通路的激活有關(guān)。本研究結(jié)果為ICT對抗神經(jīng)炎癥提供了實驗依據(jù)。