吳 霞， 張玉蓉， 朱曉寧， 汪 靜

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 四川 瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科， 四川 瀘州 646000)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitisv，NASH)是一種以肝細胞損傷、炎癥細胞浸潤和肝細胞氣球樣變性為特征的炎癥性肝病[1]。肝臟主要是由肝實質(zhì)細胞和肝非實質(zhì)細胞組成，其中非實質(zhì)細胞占40%，主要包括肝竇內(nèi)皮細胞、肝Kupffer細胞、肝星狀細胞、膽管細胞和多種免疫細胞。在飲食誘導(dǎo)的NASH模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝Kupffer細胞數(shù)量顯著增加，Xiong等人[2]利用單細胞RNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)NASH肝臟中的細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，Kupffer細胞在其中起到重要作用。Kupffer細胞是肝細胞受到損傷時的第一反應(yīng)細胞，其可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趨化因子和單核細胞的募集[3]，進而激活肝細胞炎癥信號通路，觸發(fā)肝損傷[4]，所以抑制kupffer細胞的炎癥反應(yīng)有助于NASH的治療。目前肝臟研究中，肝病理切片應(yīng)用較廣，但是其無法動態(tài)觀察細胞變化，所以細胞研究成為機制研究的主角。目前很多研究在肝細胞中加入肝非實質(zhì)細胞進行共培養(yǎng)以觀察細胞之間的相互作用關(guān)系[5]，所以對肝實質(zhì)細胞與非實質(zhì)細胞的分離與純化研究對于體外肝臟細胞模型研究具有重要的意義。本研究的目的在于分離并提純NASH大鼠原代肝細胞以及原代肝Kupffer細胞進行共培養(yǎng)，建立NASH大鼠體外細胞模型，為之后的NASH相關(guān)藥物研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量( 180±20) g，實驗動物由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證，SCXK(川)2018-17)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后(實驗動物使用許可證，SYXK(川)2018-065)，隨機分為NASH組和對照組，每組各20只，NASH組大鼠采用高脂飼料(88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+ 2%膽固醇，由成都達碩實驗動物公司提供)飼養(yǎng)，對照組大鼠采用普通飼料(由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)飼養(yǎng)，造模開始8周末，隨機從兩組中抽取2只大鼠，觀察肝組織病理變化，根據(jù)肝組織病理結(jié)果判斷是否造模成功，NASH評分系統(tǒng)見下表1。

1.2 試劑

ALT，AST試劑盒(南京建城生物工程研究所，C 009-2，C 010-2)、油紅O染色試劑盒(Solarbio，G 1261-2)，TNF-α(Abcam，ab6671)、MCP-1(Abcam，ab25124)和IL-1β(Abcam,ab9722)抗體，Percoll(Solarbio，P8370-100ml)，DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO，C11995500BT)，胎牛血清(PAN)，青鏈霉素溶液(100X)(beyotime，C0222)，氫化可的松(Solarbio，G8450-5g)，EDTA.2Na(Solarbio，E8030-100g)，4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(solarbio，H8090-25g)，膠原酶Ⅳ(Solarbio，C8160-100mg)，RIPA裂解液(bioteke，PP1901)。

1.3 實驗溶液的配制

Krebs Ringer Buffer(KRB)：NaCl 、NaHCO3、KCl、HEPES、D-Glucose，調(diào)pH至7.2～7.4，4℃保存。Buffer I： KRB中加入EDTA，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4， 0.22 μm過濾保存。Buffer II： 30 mg IV型膠原酶加入100 ml KRB配成0.03%的IV型膠原酶灌注液，再加入1.2 mmol/L CaCl2激活膠原酶。percoll 細胞分散液：100%分散液： 10×PBS： percoll(瑞典GE Healthcare)原液=1∶9；50%分散液： 100%分散液利用1×PBS等比稀釋；25%分散液： 50%分散液利用1×PBS等比稀釋；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液、500 U/L 胰島素、氫化可的松，DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.4 原代肝細胞以及原代Kupffer細胞分離方法

動物準(zhǔn)備以及膠原酶原位灌注方法均參考彭孟云等實驗方法[6]。

原代肝細胞分離： 經(jīng)過消化得到的細胞懸液，通過70 μm組織過濾篩將細胞懸液過濾到50 ml離心管中，700 r/min離心3 min，分離上清與沉淀，上清用于kupffer細胞分離，細胞沉淀加入10 ml完全培養(yǎng)基，取15 ml離心管兩支，分別按照細胞懸液：50%percoll細胞分散液=3∶4加入離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，重懸并合并細胞懸液， 1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入培養(yǎng)基，臺盼藍鑒定細胞活性，計數(shù)后按照2×105的細胞密度于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，6 h后首次換液。

原代Kupffer細胞分離：上述步驟中得到的上清利用1 500 r/min離心5 min得到細胞沉淀，棄上清，加入8 ml完全培養(yǎng)基，重懸，準(zhǔn)備兩支15 ml離心管，第一層緩慢加入50%percoll分散液，第二層緩慢加入25%percoll分散液，第三層緩慢加入細胞懸液，2 500 r/min離心15 min，離心管中的液體一共分為四層，第一層為脂肪沉淀以及死亡的細胞，第二層為培養(yǎng)基，第三層為絮狀，位于50%percoll分散液和25%分散液之間，該層為豐富的kupffer細胞，第四層為紅細胞以及肝細胞，小心吸取第三層細胞懸液，于1 500 r/min離心5 min，棄上清，得到原代kupffer細胞，細胞計數(shù)后按照1×105細胞密度于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，2 h后首次換液。

1.5 原代肝細胞以及原代Kupffer細胞鑒定

原代肝細胞以及原代Kupffer細胞分別利用免疫熒光CK-18以及CD68進行鑒定：棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，10%多聚甲醛固定15 min，0.5%TritonX-100室溫通透20 min，10%山羊血清封閉30 min。一抗(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，熒光二抗(1∶500稀釋)孵育1 h，DAPI孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

吞墨實驗進一步鑒定Kupffer細胞的吞噬能力：Kupffer細胞培養(yǎng)24 h后，利用PBS輕柔洗兩次，于含1%濃度碳素墨水培養(yǎng)基中孵育6 h，PBS洗3～5次，顯微鏡下觀察。

1.6 建立細胞共培養(yǎng)體系

細胞培養(yǎng)48 h后，細胞活力>90%時以原代肝細胞∶原代Kupffer細胞=6∶1比例進行兩種細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)48 h后可收集細胞及上清液。

1.7 原代肝細胞脂質(zhì)沉積及肝功能的鑒定

倒去培養(yǎng)液后利用PBS清洗1～2次，10%中性甲醛固定30 min，油紅染色10 min，60%異丙醇脫色，蘇木素染核2～5 min，顯微鏡觀察。異丙醇脫色利用酶標(biāo)儀對油紅O染色進行定量分析。原代肝細胞AST、ALT測定利用ALT，AST試劑盒(南京建城生物工程研究所，C 009-2，C 010-2)，根據(jù)試劑盒使用說明書進行測定。

1.8 Western blot檢測原代Kupffer細胞炎癥因子表達情況

細胞于冰上裂解30 min, SDS-PAGE法分離裂解物，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，抗體(1∶1 000)孵育后，再與抗兔抗體或抗鼠抗體(1∶5 000)共同孵育，增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶，ImageJ軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NASH大鼠模型的建立

根據(jù)HE染色結(jié)果，對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊，細胞內(nèi)未見脂肪空泡，NASH組肝組織結(jié)構(gòu)欠完整，細胞排列不整齊，細胞明顯腫脹，細胞內(nèi)可見大小不等的空泡(圖1)，經(jīng)過NASH評分脂肪變+小葉內(nèi)炎癥+氣球樣變≥4 分，NASH造模成功。

2.2 NASH大鼠原代肝細胞、kupffer細胞的分離和提純

本次實驗采用膠原酶原位灌注分離NASH大鼠原代肝細胞和原代Kupffer細胞，該方法可以一次獲得原代肝細胞以及原代Kupffer細胞，同時獲得原代肝細胞數(shù)量約為1～2×107-8cells/ml，原代Kupffer細胞數(shù)量約為1～2×105-6cells/ml，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到肝細胞為不規(guī)則鋪路石樣連接(圖2D)，利用CK-18免疫熒光進行鑒定，CK-18呈現(xiàn)陽性表達，均勻分布于原代肝細胞細胞質(zhì)內(nèi)，幾乎未見其他肝非實質(zhì)細胞表達(圖2E)；Kupffer細胞在光學(xué)顯微鏡下觀察可見細胞呈圓形和不規(guī)則形，呈貼壁生長(圖2A)，吞墨實驗可見Kupffer細胞吞噬墨汁后呈現(xiàn)黑色(圖2C)，CD68免疫熒光鑒定為Kupffer細胞(圖2B)。

2.3 NASH大鼠原代細胞脂質(zhì)沉積以及細胞炎癥鑒定

原代肝細胞培養(yǎng)48 h后利用油紅O染色檢測細胞脂質(zhì)沉積情況，發(fā)現(xiàn)NASH大鼠原代肝細胞脂質(zhì)沉積情況明顯多于對照組(圖3)，同時利用ALT/AST試劑盒檢測原代肝細胞，與對照組相比，NASH組肝細胞ALT、AST明顯升高，細胞存在明顯的損傷(P<0.05，表2)，另外Kupffer細胞相關(guān)炎癥因子TNF-α、MCP-1以及IL-1β明顯高于對照組(P< 0.05，表3,圖4)。

Fig. 2 Primary Kupffer cells (A)(×100), primary Kupffer cells CD68 Immunofluorescence staining (B)(×200), Kupffer cell swallowing experiment (C)(×100), primary hepatocytes (D)(×100), primaryhepatocytes CK-18 immunofluorescence staining (E)(×200)

Fig. 3 Normal primary hepatocytes and NASH primary hepatocytes observed by oil red O staining(×200)

Tab. 2 The contents of AST and ALT in primary hepatocytes(U/L， n=5)

Tab. 3 Protein expressions of TNF-α，IL-1β，and MCP-1 in kupffer cells ( n=3)

Fig. 4 The levels of cytoinflammatory factors TNF-α, IL-1β and MCP-1 in kupffer cells detected by Western blot

2.4 原代肝細胞與原代Kupffer細胞共培養(yǎng)狀態(tài)

原代肝細胞與原代Kupffer細胞按照6∶1的比例進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，光學(xué)顯微鏡下可以觀察到原代肝細胞互相鏈接成小島狀，細胞分裂出新的肝細胞，同時原代Kupffer細胞與肝細胞縫隙中生長(圖5)，兩種細胞共培養(yǎng)生長狀態(tài)良好，共培養(yǎng)體系建立成功。

Fig. 5 co-culture of the primary hepatocytes and Kupffer cells(×100)

3 討論

細胞培養(yǎng)以其培養(yǎng)簡單、易操作、費用低、可以大量應(yīng)用等優(yōu)點在生物學(xué)與組織學(xué)中得到廣泛的應(yīng)用，但由于脫離了機體內(nèi)環(huán)境，細胞功能受到一系列理化因素的影響，與人體內(nèi)環(huán)境存在一定的差距[7]。而細胞共培養(yǎng)則能夠彌補單層細胞培養(yǎng)的缺陷，可以更好觀察細胞與細胞、細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用，以維持細胞功能，更加接近人體內(nèi)外生理和病理模型[8,9,10]。曹勇軍等[11]認為細胞共培養(yǎng)能夠很好地模擬機體內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)關(guān)系，為細胞信號交流提供條件。而在體外細胞模型中，將肝臟非實質(zhì)細胞與肝細胞進行共培養(yǎng)，對于藥物開發(fā)以及代謝性疾病的研究具有重要的作用。

在本次研究中，證實一種從NASH模型SD大鼠中分離原代肝細胞以及原代Kupffer細胞并進行體外共培養(yǎng)的方法，該方法簡便、易操作，獲得的細胞純度高，存活率好，可用于后續(xù)NASH相關(guān)細胞機制研究。大鼠肝內(nèi)原代細胞的分離方法眾多，包括膠原酶消化法、梯度密度離心法、磁珠分選法、差速離心法、貼壁法等[12,13,14]，而目前眾多實驗研究均采用膠原酶消化法與梯度密度離心法相結(jié)合的方法進行細胞分離[15]，如孟香紅等[16]利用該方法成功分離并培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細胞。膠原酶原位灌注消化肝臟能夠明顯降低酶的使用濃度，節(jié)約成本。而percoll梯度密度分離提取肝細胞以及肝Kupffer細胞的技術(shù)已經(jīng)得到大量的研究證實，利用細胞大小的不同，采用percoll密度離心法分離肝內(nèi)細胞效率高、純度好。另外，肝內(nèi)不同細胞貼壁時間的不同，可以進一步對細胞進行提純，如Kupffer細胞因自身粘附性強，能在2 h內(nèi)貼附于玻璃或者塑料的表面[17,18]，通過換液和PBS沖洗可以進一步提純細胞。目前針對大鼠原代細胞的分離與培養(yǎng)已經(jīng)有眾多的文獻報道，但是對于NASH模型大鼠原代細胞的分離以及共培養(yǎng)細胞技術(shù)報道較少[19]。NASH是臨床上較為常見的一種疾病，其中肝Kupffer細胞在細胞損傷以及炎癥方面具有重要的作用[20]。本研究利用高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠建立NASH大鼠模型，從NASH大鼠中分離并提純原代肝細胞以及原代Kupffer細胞，我們發(fā)現(xiàn)，NASH模型大鼠分離獲得的原代Kupffer細胞與正常大鼠相比可分泌大量的TNF-α、IL-1β以及MCP-1炎癥因子。同時原代肝細胞中可見大量脂質(zhì)沉積以及AST、ALT的升高，可見在損傷細胞模型中，炎癥因子的升高水平與肝細胞的損傷程度是呈密切關(guān)系。本次研究采用比例直接接觸共培養(yǎng)的方法對原代肝細胞和原代Kupffer細胞進行共培養(yǎng)，這種方法能夠接觸式培養(yǎng)保留細胞連接信息，使得培養(yǎng)的細胞更加接近體內(nèi)自然狀態(tài)。本研究分別對原代肝細胞與Kupffer細胞的共培養(yǎng)比例進行探究，分別采用1∶1，2∶1，3∶1，5∶1，6∶1等比例，由于原代Kupffer細胞的分裂和增殖速度明顯高于原代肝細胞，所以本次研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)比例為6∶1時，細胞生長狀態(tài)最好，細胞活性高，能夠達到后續(xù)實驗要求的存活時間。利用原代肝細胞與原代Kupffer細胞進行共培養(yǎng)可以進一步在細胞水平上研究NASH的發(fā)生發(fā)展機制以及后續(xù)的藥物研究。本次研究仍然存在一定的局限性，如本研究只探討了肝細胞與Kupffer混合培養(yǎng)，但是并未進一步觀察傳代后肝細胞的脂肪變性是否會消失等，有待在接下來的實驗中進一步觀察研究。