曹思原 陸金春 靖 俊 薛同敏 張光云 曾 嶸 姚 兵**

1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（江蘇南京210023）；

2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（江蘇南京210037）；

3. 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（江蘇南京210002）

近年來，男性不育患者增多，人們對(duì)輔助生殖技術(shù)的需求量有所增加[1]。 在輔助生殖技術(shù)中，從精液樣本中優(yōu)選出足夠數(shù)量的高質(zhì)量精子是輔助生殖技術(shù)成功的關(guān)鍵步驟之一。 目前，臨床上常規(guī)使用的精子優(yōu)選方法為上游法和密度梯度離心法， 它們均能提高優(yōu)選后的精子活力，并回收一定數(shù)量的精子。 然而，無論上游法還是密度梯度離心法， 其操作過程繁瑣且均涉及機(jī)械力操作，這可能會(huì)導(dǎo)致精子中的氧自由基水平升高，增加DNA 損傷，降低精子質(zhì)量[2]。 因此，臨床上迫切需要一種更有效的精子優(yōu)選方法。 上世紀(jì)九十年代初，微流控技術(shù)正式誕生， 它是建立在幾平方厘米芯片上的生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 將實(shí)驗(yàn)中各種零散操作整合在芯片中完成，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提升了實(shí)驗(yàn)靈敏度，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本[3]。此后，其在精子優(yōu)選中的應(yīng)用逐漸被廣泛研究[4]。 Nosrati 等[5]設(shè)計(jì)的微流控芯片優(yōu)選人類精子后，其精子DNA 完整性顯著提升，且優(yōu)選效率高。 Parrella等[6]設(shè)計(jì)的微流控芯片優(yōu)選人類精子后，其精子活力與正常形態(tài)精子百分率較密度梯度離心法顯著提高，DNA 損傷率較密度梯度離心法顯著降低。Nakao 等[7]設(shè)計(jì)的微流控芯片優(yōu)選小鼠精子后其精子活力、頂體完整性以及受精率均顯著升高。 然而，絕大部分微流控芯片設(shè)計(jì)、制作復(fù)雜，原料成本過高，不利于大批量生產(chǎn)應(yīng)用。 本研究自行設(shè)制一種靈巧簡(jiǎn)便、成本低廉的微流控芯片裝置優(yōu)選精子，并將優(yōu)選后的精子活力、濃度、DFI與上游法和密度梯度離心法進(jìn)行比較。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

精液樣本源自我院生殖醫(yī)學(xué)中心的男性不育患者， 患者禁欲2～7 d 后手淫取出精液置于無菌采集器中，于37℃恒溫水溫箱中液化1h。 本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲患者知情同意。

二、試劑與儀器

人輸卵管液培養(yǎng)液（HTF）、密度梯度離心液購于美國SAGE 公司， 精子核完整性檢測(cè)試劑盒購于南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司。

CASA 系統(tǒng)購于北京偉力公司，流式細(xì)胞儀購于美國BD 公司。

三、微流控芯片

由本團(tuán)隊(duì)陸金春博士自行設(shè)計(jì) （專利申請(qǐng)?zhí)枺?01910465724.6）， 以 聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯（polymethyl methacrylate，PMMA）為制作材料。 裝置內(nèi)部由環(huán)形薄壁分為內(nèi)外兩圈，外側(cè)圈中可加入精液樣本（不漫過薄壁最高處），內(nèi)側(cè)圈中加入HTF 直至漫出薄壁進(jìn)入外圈層，與精液形成分層，整個(gè)液面略高于薄壁，質(zhì)量好的精子具有貼壁游動(dòng)的特性， 可先貼薄壁外側(cè)游動(dòng)至HTF 上層，再貼薄壁內(nèi)層游入內(nèi)圈層中，從而達(dá)到濃縮和篩選優(yōu)質(zhì)精子的目的。

四、微流控芯片的安全性研究

每份精液各取300μL分別置于芯片內(nèi)圈中和無毒滅菌離心管中室溫放置， 每組在1h、2h、3h、4h 時(shí)各吸取5μl 精液，測(cè)其精子活力。

五、微流控芯片優(yōu)選精子不同時(shí)間的效果比較

取1ml 精液樣本加入芯片外圈中，靜置5min 后在芯片內(nèi)圈中緩緩加入480μLHTF，使其漫過內(nèi)圈最上方并與外圈中精液形成分層，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置， 分別在40min、60min、80min 時(shí)吸取內(nèi)圈中5μl 混勻的HTF，測(cè)其精子活力與濃度。

六、三種不同方法優(yōu)選精子的比較

分別用微流控芯片法、 上游法和密度梯度離心法優(yōu)選精子。

微流控芯片法：同“五、微流控芯片優(yōu)選精子不同時(shí)間的效果比較”， 最后回收的HTF 補(bǔ)足至500μl，并測(cè)其精子活力、濃度與DFI。

上游法：于無毒滅菌離心管中加入1mL精液，300×g離心5min，棄上清后加入500μl HTF 重懸沉淀，在上方緩緩加入1mL HTF 形成分層， 離心管45°傾斜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中上游1h， 回收最上方500μL HTF，測(cè)其精子活力、濃度與DFI。

密度梯度離心法： 于無毒滅菌離心管中依次加入80%、40%密度梯度離心液，將1ml 精液樣本緩緩加入離心液上層，300×g 離心20min，棄上清后加入2mL精子洗滌液重懸沉淀，200×g 離心5 min， 棄上清后加入500μL精子洗滌液重懸沉淀，測(cè)其精子活力、濃度與DFI。

七、精子各參數(shù)測(cè)定

精子活力與濃度檢測(cè)：參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版，用CASA 系統(tǒng)檢測(cè)。

精子DFI 檢測(cè)： 參照精子核完整性檢測(cè)試劑盒說明書操作，用吖啶橙對(duì)精子進(jìn)行染色，染色后的精子懸液通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其DFI。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0 分析數(shù)據(jù)， 差異性比較前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，若每組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，用±s 表示計(jì)量資料，若有數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則用M（QR）表示計(jì)量資料。 除微流控芯片法與上游法、微流控芯片法與密度梯度離心法優(yōu)選前后各精子參數(shù)進(jìn)行組間比較時(shí)使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)外，其余均用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

結(jié) 果

一、微流控芯片的安全性研究

無毒滅菌離心管和微流控芯片中精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率在各個(gè)時(shí)間段均無顯著性差異（P＞0.05）（表1），提示微流控芯片對(duì)精子無毒害作用。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩組中精子活力比較[n=30，M（QR）]

二、微流控芯片優(yōu)選精子不同時(shí)間的效果比較

與優(yōu)選前相比， 微流控芯片優(yōu)選40min、60min 和80min 后的精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均顯著升高（P＜0.01），精子濃度則顯著降低（P＜0.01）；40min、60min 和80min 三組之間優(yōu)選后的精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率無顯著性差異（P＞0.05）；與40min 組相比，60min 組與80min 組優(yōu)選后的精子濃度均顯著升高（P＜0.05），60min 組與80min 組的精子濃度則無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。 提示60min 為微流控優(yōu)選精子的最佳時(shí)間。

表2 微流控芯片優(yōu)選不同時(shí)間后各精子參數(shù)的比較[n=10，M（QR）]

三、三種不同精子優(yōu)選方法的效果比較

三種方法優(yōu)選前各精子參數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。 較優(yōu)選前，三種方法優(yōu)選后的精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均顯著升高（P＜0.01），微流控芯片與上游法優(yōu)選后的精子濃度顯著降低（P＜0.01），密度梯度離心法優(yōu)選后的精子濃度沒有差異；與優(yōu)選前相比，微流控芯片優(yōu)選后的精子DFI 無顯著性差異（P＞0.05），上游法與密度梯度離心法優(yōu)選后的精子DFI 顯著升高（P＜0.01）；與上游法與密度梯度離心法相比，微流控芯片優(yōu)選后的精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均顯著升高（P＜0.01），而精子濃度與DFI 則顯著降低（P＜0.05）（表3）。

討 論

據(jù)WHO 報(bào)道，不孕不育發(fā)病率高達(dá)10%～15%，而男性因素則約占一半[8]。 隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，越來越多不孕不育家庭借此技術(shù)得到幸福。 然而，當(dāng)前輔助生殖成功率只有約三分之一[9]。 目前應(yīng)用于臨床的輔助生殖技術(shù)包括人工授精（artificial insemination，AI）、體外受精（in vitro fertilization，IVF）以及卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），無論哪種技術(shù)，都需要先對(duì)精子進(jìn)行優(yōu)選，提升優(yōu)選后的精子質(zhì)量將成為提升受精成功率的關(guān)鍵[10]。

表3 三種方法優(yōu)選前后各精子參數(shù)比較[n=20，M（QR）]

本研究中我們自制PMMA 微流控芯片對(duì)精子進(jìn)行優(yōu)選。 PMMA 俗稱有機(jī)玻璃，其光學(xué)特性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、耐腐蝕、易成型，經(jīng)常應(yīng)用于各種工藝品以及生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)芯片的制作[11,12]。 本研究所設(shè)計(jì)的微流控芯片采用有機(jī)玻璃為原料，通過安全性研究實(shí)驗(yàn)證明，與無毒滅菌離心管類似，其對(duì)精子無毒害，適合在微流控芯片生產(chǎn)中使用。

長(zhǎng)期以來， 精子活力與濃度都是臨床上評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。 微流控芯片優(yōu)選后的精子活動(dòng)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率均優(yōu)于上游法與密度梯度離心法，這可能是因?yàn)榕c這兩種方法相比，微流控芯片優(yōu)選精子過程中避免了樣本的多次轉(zhuǎn)移， 減少了操作過程中對(duì)精子造成的致命損傷。 但是，微流控芯片優(yōu)選后的精子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這兩種方法， 可能是因?yàn)橘N壁游動(dòng)對(duì)精子要求高， 這樣的結(jié)果不利于優(yōu)選精子后的宮腔內(nèi)人工授精（IUI）過程，尤其是少精子癥患者。

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展， 人們也逐漸開始從微觀水平分析精子質(zhì)量，精子DNA 完整性近年來成為關(guān)注熱點(diǎn)。 精子活力、濃度等僅是從高活力精子產(chǎn)生數(shù)量方面分析精子，并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其生育能力，一次成功的受精依賴于精子中高完整性的DNA 分子。 有研究表明，精子DNA 片段化高與受精率低相關(guān)[13]。 微流控芯片優(yōu)選后的精子DFI 低于上游法與密度梯度離心法，這可能是因?yàn)槲⒘骺匦酒趦?yōu)選過程中無需離心，避免了其對(duì)精子帶來的機(jī)械損傷與氧化應(yīng)激。

綜上所述，與傳統(tǒng)精液分選方法相比，本研究所設(shè)計(jì)的微流控芯片操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，能優(yōu)選出質(zhì)量更高的精子；盡管在某些方面仍需改善，但其在輔助生殖技術(shù)中尤其是在IVF/ICSI 技術(shù)中已顯示出良好的應(yīng)用前景。