轉(zhuǎn)化生長因子-β受體在男性雄激素性脫發(fā)患者頭皮毛囊中的表達(dá)意義

董佳輝，萬苗堅，計 斌

雄激素性脫發(fā)（androgenetic alopecia，AGA）是一種比較常見的脫發(fā)性疾病。目前已經(jīng)認(rèn)識到，AGA 是在遺傳背景上由雄激素觸發(fā)和介導(dǎo)的進(jìn)行性脫發(fā)性疾病，其發(fā)病的時間、進(jìn)程和嚴(yán)重程度又受其他因素的影響，如睡眠、情緒等[1]。AGA 發(fā)病的分子機制尚未完全闡明，且現(xiàn)有的治療方法效果不十分滿意。研究表明，AGA 的發(fā)病還可能與一系列信號通路異常有關(guān)。其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）/β2 可能是AGA 中雄激素與受體作用后的下游分子之一，抑制毛囊外毛根鞘細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化和凋亡，參與AGA 的發(fā)病[2]。而TGF-β 必須與細(xì)胞膜上高親和性TGF-β 受體（TGF-β receptor，TGF-βR）結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3]。因此，為了明確AGA 發(fā)病機制，有必要了解AGA 患者毛囊中TGF-βR 表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 15 例男性AGA 為廣州粵秀整形機構(gòu)樂鬃毛發(fā)移植中心接受毛發(fā)移植的患者，Hamilton分型為Ⅳ～Ⅴa 型，年齡23 ～46 歲，平均（34.6±7.8）歲，近3 個月未系統(tǒng)使用抗雄激素藥物和局部使用任何育發(fā)類產(chǎn)品或藥物治療，頭皮正常完整，無細(xì)菌、真菌等感染性疾病及皮炎濕疹等炎癥性皮膚病。對實驗內(nèi)容知曉并簽署知情同意書。健康志愿者5 例均為男性，作為對照組，年齡（33.0±6.2）歲，為頭皮外科手術(shù)患者，無AGA 現(xiàn)癥及家族史，毛發(fā)生長正常。

1.1.2 取材部位選擇及方法 AGA 患者頭皮分枕部非脫發(fā)區(qū)、脫發(fā)過渡區(qū)、脫發(fā)區(qū)三個區(qū)域，每個區(qū)域用同一鉆孔刀（slot pouch ?3 mm，Micro-Tools Europe，Germany）各取3 塊頭皮組織，每塊體積3 mm×3 mm×5 mm。對照組取原手術(shù)區(qū)在額頂部位的含毛囊頭皮組織，分成每塊體積3 mm×3 mm×5 mm。

1.1.3 實驗分組 實驗分組為①對照組、②AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組、③AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組、④AGA 脫發(fā)區(qū)組。

1.1.4 主要試劑及儀器 兔抗人TGF-βRⅠ多克隆抗體（Abcam 公司）；小鼠抗人TGFRⅡ單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；SP 二抗（上海長島公司）；Olympus 81i光學(xué)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制作 新鮮組織取材后立即用10%甲醛固定。將固定的標(biāo)本組織分離成只含1 ～2 根毛發(fā)的小組織，再進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，包埋時盡量使毛囊縱軸與蠟塊面平行，切片時盡量以毛囊縱軸為方向，以3 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片。

1.2.2 免疫組化染色 每個毛囊的切片分別進(jìn)行TGFβRⅠ和TGF-RⅡ免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯10 min，共2 次；100%，95%，85%，80%乙醇各5 min，1 次；蒸餾水沖洗5 min，共3 次；3% H2O2室溫下10 min，1 次；蒸餾水沖洗5 min，1 次；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，自然冷卻至室溫后，PBS沖洗5 min，共3 次；10%正常山羊血清室溫封閉10 min，傾去，勿洗；分別滴加TGF-βRⅠ多克隆抗體（1:50稀釋，用PBS 稀釋）和TGF-βRⅡ單克隆抗體（1:50稀釋，用PBS 稀釋），以PBS 代替一抗做陰性對照，放入濕盒內(nèi)4℃過夜（＞14 h）；室溫復(fù)溫30 min，PBS 沖洗5 min，共3 次；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min；PBS 沖洗5 min，共3 次；滴加顯色底物DAB，鏡下觀察，適時終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染15 ～30 s，流水沖洗5 ～10 min；常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.3 結(jié)果判定和記錄 均以生長期毛囊為觀察對象。TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ免疫組化陽性著色表現(xiàn)為胞膜和胞質(zhì)染成褐色。光學(xué)顯微鏡下觀察見細(xì)胞中出現(xiàn)淺黃至棕褐色顆粒視為陽性細(xì)胞，凡細(xì)胞顯色強度與背景無明顯差別者則為陰性細(xì)胞。每組至少觀察30 個毛囊，分別記錄毛囊中TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ染色強度（陰性為-，淺褐色為+，黃褐色為2+，棕褐色為3+）、分布和陽性毛囊數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0。采用多組有序多分類資料的秩和檢驗和χ2檢驗。設(shè)定雙側(cè)P＜0.05 為統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 TGF-βRⅠ在毛囊中的表達(dá)

正常對照組和AGA 患者各組標(biāo)本生長期毛囊均有TGF-βRⅠ的表達(dá)，表達(dá)于整個外毛根鞘，以淺褐色～黃褐色為主，毛囊內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見明顯表達(dá)（圖1，圖2）。各組毛囊TGF-βRⅠ的表達(dá)見表1。各組毛囊中TGF-βRⅠ表達(dá)無顯著性差異（H=0.648，P＞0.05）。

2.2 TGF-βRⅡ在毛囊中的表達(dá)

圖1 各組毛囊中TGF-βRⅠ的表達(dá)（SP法染色×200）

圖2 各組毛囊真皮乳頭TGF-βRⅠ的表達(dá)（SP法染色×200）

表1 各組毛囊中TGF-βRⅠ的表達(dá) （個）

表2 各組毛囊中TGF-βRⅡ的表達(dá) （個）

在正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組毛囊中均未見TGF-βRⅡ表達(dá)；AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組有34.4%（11/32）的毛囊其外毛根鞘可見有輕度TGF-βRⅡ表達(dá)，以淺褐色為主；AGA 脫發(fā)區(qū)組有51.6%（16/31）的毛囊其外毛根鞘可見有輕度TGF-βRⅡ表達(dá)，以淺褐色為主；各組毛囊的內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見TGF-βRⅡ表達(dá)（圖3，4）。TGF-βRⅡ在各組毛囊中的表達(dá)情況見表2。

合并表2 中+和2+數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行二分類資料比較的χ2檢驗，比較各組毛囊中TGF-βRⅡ表達(dá)陽性毛囊率。正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組與AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組及脫發(fā)區(qū)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P過渡區(qū)=2.538×10-4＜0.05；P脫發(fā)區(qū)=1.482×10-6＜0.05），AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組和脫發(fā)區(qū)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.911，P＞0.05）。

圖3 各組毛囊中TGF-βRⅡ的表達(dá)（SP法染色×200）

圖4 各組毛囊真皮乳頭TGF-βRⅡ的表達(dá)（SP 法染色×200）

3 討論

AGA 患者受累毛囊表現(xiàn)為毛囊由生長期提前進(jìn)入退行期，毛囊生長期逐漸地進(jìn)行性縮短，毛囊再生不完全，逐漸微型化，毛發(fā)則逐漸變短、變細(xì)，毫毛化，至最終形成禿發(fā)[4]。因此，明確誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入退行期和抑制毛囊再生的分子機制對了解和防治AGA 至關(guān)重要。實驗證實，多種細(xì)胞因子參與了毛囊退行期的調(diào)控，如Fas，TGF-β，腫瘤壞死因子（TNF）-α，成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）-5，胰島素樣生長因子（IGF）-1，神經(jīng)營養(yǎng)素等[5,6]。TGF-β 是參與人類毛囊退行期調(diào)控的重要因子之一，在人類毛囊周期循環(huán)中起著重要的作用，調(diào)控著毛囊細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，從而維持和改變著毛囊的形態(tài)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，雄激素可刺激AGA 患者脫發(fā)區(qū)毛囊真皮乳頭細(xì)胞分泌更多TGF-β1/β2，并使其活性增加，它們均是毛囊退行期強誘導(dǎo)劑，抑制毛囊外毛根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其分化和凋亡，使毛囊生長期縮短，毛囊提前出現(xiàn)退行期改變[2,8,9]。TGF-β 被認(rèn)為可能是雄激素在AGA 發(fā)病中的下游分子機制之一。TGF-β必須與細(xì)胞膜表面的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ一起結(jié)合才能發(fā)揮其作用，這兩種受體是信號傳導(dǎo)所必需的，且是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的首要環(huán)節(jié)，只與一種受體結(jié)合是無效的[3]。目前關(guān)于AGA 患者毛囊中TGF-βRⅠ和RⅡ的表達(dá)情況，鮮見文獻(xiàn)報道。所以對AGA 患者毛囊TGF-βR 表達(dá)的研究是非常必要的，可進(jìn)一步從TGF-βR 角度探討TGF-β 信號通路的在AGA 發(fā)病中的可能作用。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-βRⅠ表達(dá)于各組毛囊整個外毛根鞘，而內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭未見表達(dá)，各組間TGF-βRⅠ表達(dá)是無差異的。這與文獻(xiàn)報道的正常人生長期毛囊中TGF-βRⅠ表達(dá)的結(jié)果一致[10]。提示，TGF-βRⅠ在AGA 毛囊中的表達(dá)沒有異常，TGFβRⅠ的表達(dá)不是AGA 發(fā)病的因素，在AGA 發(fā)病中可能處于從屬的地位。在正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組毛囊均未見有TGF-βRⅡ的表達(dá)；AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組毛囊中，有34.4%（11/32）的毛囊其外毛根鞘可見有TGF-βRⅡ表達(dá)；AGA 脫發(fā)區(qū)組毛囊中，有51.6%（16/31）的毛囊其外毛根鞘可見有TGF-βRⅡ表達(dá)；各組毛囊的內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見有TGF-βRⅡ表達(dá)。結(jié)果表明，在男性AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)有毛囊同時表達(dá)TGF-βRⅠ和RⅡ。因此，從TGF-βR 角度來看，提示這些毛囊中可能存在TGF-β 信號通路活化的跡象。結(jié)合既往研究，雄激素可刺激AGA 患者脫發(fā)區(qū)毛囊真皮乳頭細(xì)胞分泌更多TGF-β1/β2，并使其活性增加[2,8,9]，進(jìn)一步提示AGA患者受累毛囊存在TGF-β 信號通路活化的跡象。

至于AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)生長期毛囊出現(xiàn)TGF-βRⅡ的異常表達(dá)的原因，還不清楚。AGA是在遺傳背景上發(fā)生的脫發(fā)性疾病，脫發(fā)的部位主要發(fā)生在前額—頂部，而兩鬢和枕部不受影響，脫發(fā)部位的特殊性與脫發(fā)區(qū)毛囊和頭皮的雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和二氫睪酮（DHT）水平特異性升高有關(guān)[11]。AGA 毛囊TGF-βRⅡ異常表達(dá)與AGA 脫發(fā)部位的特殊性存在一定的一致性，也與AGA 患者頭皮毛囊雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和DHT 部位特異性增高一致。因此，推測AGA 脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)毛囊TGF-βRⅡ異常表達(dá)可能與遺傳有一定的關(guān)系。TGF-βRⅡ在男性AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)生長期毛囊存在異常表達(dá)，參與了這些部位毛囊的病變過程，而在枕部非脫發(fā)區(qū)毛囊未見有TGF-βRⅡ，說明該部位生長期毛囊不存在TGF-β 信號通路活化，同時該部位毛囊中雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和DHT 水平也低，雄激素也不能刺激該部位毛囊真皮乳頭細(xì)胞產(chǎn)生過多的抑制性細(xì)胞因子TGF-β1/β2，這就進(jìn)一步解釋了為何毛囊從枕部移植到前額-頂部脫發(fā)區(qū)能成活且不再發(fā)生AGA 樣的毛囊組織病理改變的原因。

各組毛囊真皮乳頭細(xì)胞均未表達(dá)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ，提示該部位可能不受TGF-β 信號通路的影響，這可能是AGA 受累毛囊真皮乳頭長期保留[12]的機制之一。

綜上，男性AGA 患者脫發(fā)過渡區(qū)和脫發(fā)區(qū)的部分生長期毛囊存在TGF-β 信號通路活化的跡象，其中TGF-βRⅠ表達(dá)可能不是男性AGA 發(fā)病主要的因素；TGF-βRⅡ的異常表達(dá)可能在男性AGA 發(fā)病中起重要的作用。它與TGF-βRⅠ一起活化TGF-β 信號通路，使生長期毛囊中細(xì)胞增殖活性下降，毛囊生長受到抑制，毛囊漸微型化至最終形成脫發(fā)。這為今后從TGF-βR 封閉的角度開發(fā)新的治療AGA 手段提供了重要的理論依據(jù)。特別是TGF-βRⅡ，或從TGF-β1/β2 拮抗劑角度兩個方面，來阻斷TGF-β 信號通路在AGA 中的異?；罨?，從而為治療AGA 開辟新的途徑。