熱處理對漢麻乳穩(wěn)定性的影響及蛋白結構表征

朱秀清，王子玥，李美瑩，王 源，李志敏，楊宏哲，張 娜，孫冰玉

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

漢麻，屬于大麻科[1]，作為一種食物資源有著很長的歷史。漢麻籽含有30%（質量分數(shù)，下同）的優(yōu)質油脂和25%的優(yōu)質蛋白，不溶性纖維含量約占10%～15%[2]。麻仁球蛋白和白蛋白是漢麻籽中的兩種主要蛋白質，這兩種貯藏蛋白容易消化，并且含有多種必需氨基酸[3]。同時漢麻籽富含VE、礦物質、抗氧化物質和纖維素[4]，是一種營養(yǎng)豐富的理想食物來源。近幾十年，隨著低四氫大麻酚含量（0.3%）的工業(yè)大麻的出現(xiàn)，漢麻食品逐漸受到們的歡迎，漢麻食品的商業(yè)化程度也不斷提高，韓國等國家的部分企業(yè)已經(jīng)開始研發(fā)生產漢麻籽油、漢麻乳、漢麻面包等食品產品，利用漢麻提純蛋白粉、抗氧化肽以及其他高附加值產品。漢麻乳飲料在國外受到熱烈的追捧，有較高的營養(yǎng)價值、較低的過敏性，是可能替代豆奶、堅果奶的新興飲料，將具有廣闊的發(fā)展空間。

熱處理是食品加工中的主要手段[5]，在實際應用中熱處理是蛋白飲料生產加工的重要工序。目前國內外關于漢麻乳的研究報道還相對較少，陳聰穎等[6]對漢麻乳飲料的浸泡工藝和磨漿工藝進行了研究；周超進[7]對控制漢麻蛋白飲料穩(wěn)定性的添加劑配方及其貯藏穩(wěn)定性進行了研究。Wang Qingling等[8]利用高壓均質和pH值偏移相結合的方法維持漢麻乳的物理及氧化穩(wěn)定性。而現(xiàn)階段關于熱處理過程中漢麻乳穩(wěn)定性及其蛋白變化研究還鮮有報道。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，漢麻乳在70 ℃左右就開始發(fā)生聚集，表明漢麻蛋白質易發(fā)生熱聚集，漢麻乳的熱加工工藝是生產中亟需解決的瓶頸問題；且漢麻乳加工熱處理過程中漢麻乳聚集現(xiàn)象與蛋白變化有極大的相關性，表現(xiàn)出漢麻乳不適于高溫長時間加熱，同時還發(fā)現(xiàn)高溫瞬時殺菌基本沒有改變前期漢麻乳熱處理的穩(wěn)定狀態(tài)。

本實驗以漢麻乳為研究對象，選取常壓加熱漢麻乳聚集現(xiàn)象發(fā)生前后溫度范圍（55～95 ℃）進行熱處理，采用氮溶解指數(shù)數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）、離心沉淀率、乳化性質特性、乳液表面電位和粒徑等指標監(jiān)測漢麻乳熱處理過程中穩(wěn)定性的變化，通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）表征熱處理過程中漢麻乳蛋白二級結構相對含量的變化。針對前期熱處理過程中漢麻乳穩(wěn)定性與蛋白結構的關系展開討論，闡釋漢麻乳熱處理過程中穩(wěn)定性與蛋白結構變化的關系，為漢麻乳前期熱加工處理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫殼漢麻籽產自中國云南；大豆油購自九三糧油工業(yè)集團有限公司。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）天津市福晨化學試劑廠；考馬斯亮藍G-250 北京索萊寶科技有限公司；硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸等化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV759S型紫外-可見分光光度計 上海市譜光儀器有限公司；TG16-WS離心機 湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-25型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機 德國CHRIST公司；Spectrum Two FTIR儀 美國PerkinElmer公司；Zetasizer Nano激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 漢麻乳的制備及熱處理

取成熟去殼漢麻籽，按料液比1∶5（m/V）進行磨漿，100 目過濾除渣，水浴加熱，在一定溫度（55、65、75、85、95 ℃）下保持10 min，迅速水浴冷卻至室溫（25 ℃），備用。未處理樣品指25 ℃室溫下處理未經(jīng)加熱的漢麻乳樣品。

1.3.2 物理穩(wěn)定性的測定

用離心沉淀率來表征漢麻乳的物理穩(wěn)定性[9]，具體測定參照姜梅[10]的方法并稍作改動。將制備好的漢麻乳樣品4 ℃下保存24 h，取30 mL樣品于50 mL離心管中，4 000 r/min離心25 min，稱其沉淀質量，離心沉淀率按式（1）進行計算。

1.3.3 氮溶解指數(shù)的測定

NSI的測定參照郝建敏[11]的方法，并稍作改動。將樣品用蒸餾水稀釋10 倍，混合均勻后，將稀釋液在4 000 r/min下離心15 min，用凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量，上清液中蛋白質含量與樣品中總蛋白質含量之比為NSI。

1.3.4 乳化特性的測定

樣品的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）參照Pearce等[12]的方法測定，并進行改進。取5 mL大豆油與15 mL漢麻乳混合，用高剪切乳化機在12 800 r/min下乳化2 min后倒入50 mL燒杯中，分別在0、30 min從燒杯底部取樣20 μL與5 mL 0.1%的SDS溶液均勻混合，在500 nm波長處測定吸光度。EAI和ESI分別按照公式（2）、（3）計算。

式中：D為稀釋倍數(shù)（250）；ρ為漢麻乳蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中油相體積分數(shù)（0.25），A0和A30分別為0 min和30 min時的吸光度；Δt表示時間差（30 min）。

1.3.5 Zeta電位的測定

Zeta電位用激光粒度分析儀測定，具體參照Shun-Tang等[13]的方法，用0.05 mol/L稀鹽酸溶液將漢麻乳樣品的pH值調整為6.80±0.05，稀釋100 倍后，測定相應的Zeta電位。溶劑參數(shù)設定：折光系數(shù)為1.33，介電常數(shù)為78.55，黏度為1.008 7 mPa·s。

1.3.6 粒徑測定

用激光粒度分析儀測定漢麻乳蛋白的粒徑分布[14]。用去離子水將樣品稀釋100 倍，分散相的折射率為1.471，分散劑折射率為1.330。

1.3.7 FTIR圖譜的測定

漢麻乳在-40 ℃條件下冷凍干燥，準確稱量0.002 g凍干樣，加入一定量的KBr至0.2 g，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片[15]。用FTIR儀進行全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為32。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有實驗重復3 次，采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果取平均值，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 熱處理對漢麻乳穩(wěn)定性影響

2.1.1 熱處理對漢麻乳離心沉淀率的影響

漢麻乳的離心沉淀率可以直接體現(xiàn)出其在熱處理過程中的聚集程度。由圖1可知，隨著熱處理溫度的升高，漢麻乳的離心沉淀率逐漸增大，即熱處理溫度越高，漢麻乳粒子聚集程度越高，形成更多的熱聚集體。熱處理溫度從55 ℃加熱到65 ℃，漢麻乳離心沉淀率由16.58%略微上升，但當熱處理溫度達到75 ℃時，熱處理漢麻乳離心沉淀率從65 ℃時的18.52%升高到30.06%（P＜0.05），熱處理溫度進一步升高至95 ℃，離心沉淀率達到最大（34%）。邢霽云等[16]在對豆乳的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著熱燙溫度的提高，豆乳的離心沉淀率呈增加趨勢，與本研究中漢麻乳離心沉淀率隨熱處理溫度的變化規(guī)律相符合。漢麻乳的熱聚集很可能是由于漢麻乳中蛋白分子發(fā)生熱聚集，65 ℃熱處理組漢麻乳中蛋白變性程度較小，進一步加熱到75 ℃，漢麻乳體系內大部分蛋白發(fā)生了變性，形成了數(shù)量較多或結構較大的熱聚集體?？梢姡S熱處理溫度發(fā)生變化，漢麻乳發(fā)生了不同程度的熱聚集。

圖1 熱處理對漢麻乳離心沉淀率的影響Fig.1 Effect of heat treatment on centrifugal precipitation rate of hemp seed milk

2.1.2 熱處理對漢麻乳NSI的影響

圖2 熱處理對漢麻乳NSI的影響Fig.2 Effect of heat treatment on NSI of hemp seed milk

NSI是可溶性蛋白占總蛋白的比例，表示蛋白質的溶解特性。從圖2中可以看出，55 ℃熱處理后漢麻乳的NSI最高，這表明溫和熱處理一定程度上會促進漢麻蛋白在水中的溶解。一方面，溫和熱處理使?jié)h麻蛋白結構略微展開，增加了親水基團暴露；另一方面，Sorgentini等[17]研究發(fā)現(xiàn)加熱溫度較低時，蛋白質易分解產生小分子可溶性物質，增加蛋白質溶解度，但加熱溫度較高時，蛋白質易發(fā)生變性或聚集，溶解度降低。超過55 ℃后，隨著熱處理溫度升高，漢麻乳的NSI由55 ℃時的58.55%逐漸減小到90 ℃時的39.81%，這可能是由于隨著加熱溫度的升高，漢麻乳體系中的蛋白質分子結構去折疊展開，其內部的疏水基團暴露出來，發(fā)生疏水性聚集，溶解度降低，此外，熱處理溫度進一步升高，漢麻乳中蛋白質發(fā)生變性，伸展開的蛋白質分子不斷發(fā)生碰撞，在各種作用力的共同影響下相互交聯(lián)形成不溶性聚集體，溶解度降低，NSI減小。與陳震東等[18]的研究結果一致。

2.1.3 熱處理對漢麻乳Zeta電位的影響

Zeta電位是溶液中帶電微粒雙電層中剪切面的電勢，通常用于對膠體穩(wěn)定性的評價。Zeta電位絕對值的高低表示分子表面所帶正或負電荷數(shù)量的多少，Zeta電位的絕對值越高，體系內蛋白質分子表面的電荷數(shù)量越多，存在較大的靜電斥力，以維持體系處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；反之，Zeta電位的絕對值較低時，體系狀態(tài)不穩(wěn)定，蛋白分子易發(fā)生聚集[19]。由圖3可知，隨著熱處理溫度的升高，漢麻乳的Zeta電位絕對值先增大后逐漸減小。熱處理溫度為65 ℃時，Zeta電位絕對值最大，為20.57 mV。熱處理溫度低于65 ℃時，隨溫度升高，漢麻乳Zeta電位絕對值逐漸增加，粒子間的靜電斥力增大，體系趨于穩(wěn)定；隨著熱處理溫度進一步升高，漢麻乳的Zeta電位絕對值逐漸減小，說明此時體系內Zeta電位絕對值減小，分子表面靜電荷密度減小，靜電相互作用增強，分子通過靜電相互作用吸引，形成新的更大體積的聚集體。李紅等[20]對不同熱處理的大豆乳狀液Zeta電位的研究結果與本研究相似，即55～95 ℃熱處理的大豆乳狀液Zeta電位絕對值隨著溫度升高逐漸降低，乳狀液穩(wěn)定性降低。

圖3 熱處理對漢麻乳Zeta電位的影響Fig.3 Effect of heat treatment on zeta potential of hemp seed milk

2.1.4 熱處理對漢麻乳平均粒徑的影響

圖4 熱處理對漢麻乳平均粒徑的影響Fig.4 Effect of heat treatment on average particle size of hemp seed milk

蛋白質的粒徑可反映出蛋白質的聚集程度[21]。如圖4所示，加熱溫度越高，漢麻乳蛋白平均粒徑越大。加熱溫度從55 ℃升高至65 ℃時，漢麻乳蛋白粒徑由192.2 nm增加到200.4 nm（P＜0.05），75 ℃熱處理漢麻乳蛋白的平均粒徑達到229.43 nm，顯著高于65 ℃（P＜0.05），形成大的聚集體，與離心沉淀率的研究結果一致。這可能是由于進一步熱處理使維持蛋白體系的作用力遭到破壞，蛋白質部分變性，形成新的小聚集體，且由2.1.1節(jié)可知此時漢麻乳離心沉淀率明顯增大，熱聚集體含量大幅度增加。加熱溫度為95 ℃時，漢麻乳蛋白平均粒徑大幅度提高至304.60 nm，這可能因為高溫使?jié)h麻乳蛋白發(fā)生變性，二硫鍵斷裂后產生蛋白亞基又重新結合，在疏水作用、靜電引力、范德華力等作用下形成更大的網(wǎng)絡結構，產生粒徑較大的聚集體。漢麻籽蛋白主要由麻仁球蛋白和白蛋白組成，球蛋白相對含量約為65%，漢麻球蛋白的變化決定著漢麻乳體系的變化。齊寶坤等[22]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理后的球蛋白具有更大的平均粒徑，且隨溫度升高蛋白粒徑進一步增大，認為較高溫度的熱處理利于大尺寸聚集體的形成，與本研究所得結果相吻合。

2.1.5 熱處理對漢麻乳乳化特性的影響

圖5 熱處理對漢麻乳EAI及ESI的影響Fig.5 Effect of heat treatment on EAI and ESI of hemp seed milk

由圖5可知，經(jīng)過不同溫度熱處理的漢麻乳EAI呈先增大后減小的趨勢，且均高于未處理的漢麻乳。加熱溫度為65 ℃時，漢麻乳的EAI最高，為0.357 m2/g，可能是由于較低溫度的加熱過程中，隨著α-螺旋的解螺旋、β-轉角的打開，蛋白質結構逐漸展開，蛋白質的二級、三級結構舒展，使得鏈節(jié)變得十分柔順，高的柔順性有利于界面上分子有序重排[23]，從而使得蛋白親水親油性增強，更容易分散在乳化界面中，導致EAI提高。此時，漢麻乳乳化性較好，維持體系的液滴以小液滴為主，體系內分子粒徑較小。隨著加熱溫度進一步升高，EAI降低，這可能與蛋白變性重新組合形成大聚集體有關。熱處理后，漢麻乳的乳化穩(wěn)定性得到了改善，并且隨著加熱溫度的升高，ESI呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在65 ℃熱處理條件下ESI最高（43.74%）。55 ℃熱處理時，蛋白質略微伸展，變性程度較低，疏水性基團暴露程度較小，而熱處理溫度達到65 ℃時，疏水基團暴露更加充分，對維持乳化液體系穩(wěn)定起到了一定作用。熱處理溫度達到75 ℃以后，舒展開的蛋白質分子重新排列形成聚集體，不能維持乳化液體系的穩(wěn)定，出現(xiàn)聚集。

2.2 熱處理后漢麻乳蛋白的二級結構表征結果

圖6 不同熱處理條件下漢麻乳蛋白FTIR圖Fig.6 FTIR spectra of hemp seed milk protein under different heat treatment conditions

紅外光譜可有效分析蛋白質二級結構的構象信息[24]，如圖6所示，漢麻乳蛋白在酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）處具有較強的吸收峰，不同熱處理溫度下的漢麻乳蛋白在酰胺I帶的特征吸收峰存在差異。酰胺I帶譜峰與蛋白質二級結構之間存在著一定的對應關系，可據(jù)此對蛋白質二級結構進行定性定量分析[25]。采用PeakFit軟件對酰胺I帶進行分析，首先對酰胺I帶進行基線校正、去卷積處理，然后進行二階導數(shù)分峰擬合，酰胺I帶中：1 610～1 640 cm-1處為β-折疊特征峰、1 640～1 650 cm-1處為無規(guī)卷曲特征峰、1 650～1 660 cm-1處為α-螺旋特征峰、1 661～1 700 cm-1處為β-轉角特征峰[26]，根據(jù)峰面積計算蛋白質二級結構相對含量，結果見表1。

表1 熱處理對漢麻乳蛋白二級結構相對含量的影響Table 1 Effect of heat treatment on the relative contents of secondary structures in hemp seed milk protein

由表1可知，隨著熱處理溫度的升高，漢麻乳蛋白α-螺旋結構的相對含量逐漸降低，由28.57%降低到23.70%，無規(guī)卷曲結構的相對含量逐漸增大，由21.13%增加至25.41%；β-折疊結構的相對含量先增大后降低，在75 ℃時相對含量最高；β-轉角的相對含量先降低后增大，在75 ℃時相對含量最低。熱處理過程中，漢麻乳蛋白分子相鄰肽鍵間的氫鍵遭到破壞，維持α-螺旋的氫鍵斷裂，發(fā)生解螺旋，α-螺旋結構的相對含量降低。Chakraborty等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)熱處理過程中蛋白質α-螺旋結構含量降低，β-折疊結構或β-轉角結構含量增加。孫佳悅等[28]在牛乳蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理后α-螺旋含量顯著降低（P＜0.05），無規(guī)卷曲含量顯著升高（P＜0.05），熱處理程度增強導致部分有序結構向無規(guī)卷曲結構轉化，蛋白質發(fā)生熱聚集現(xiàn)象，與本研究結果相吻合。一部分α-螺旋結構展開，蛋白質結構由有序趨向于無序，無規(guī)則卷曲結構的相對含量增加；另一部分α-螺旋結構在分子間相互作用下轉換為β-折疊結構，β-折疊結構通常存在于蛋白質內部折疊區(qū)域[29]，在網(wǎng)絡結構的形成中有重要作用。隨著加熱溫度的進一步升高，漢麻乳蛋白發(fā)生變性，形成熱聚集體，由于在熱聚集體分子間β-折疊結構易轉變?yōu)棣?轉角結構[30]，β-折疊結構的相對含量降低，β-轉角結構相對含量增大。從漢麻乳蛋白二級結構相對含量的變化可以看出，在熱處理過程中，漢麻乳蛋白先發(fā)生解螺旋、結構舒展，隨著熱處理溫度進一步升高，在與乳液中脂質及糖類分子共同作用下，熱變性的漢麻乳蛋白重新排列、相互交聯(lián)，形成熱聚集體。漢麻乳熱聚集體的產生主要是漢麻乳中蛋白的熱聚集，熱處理過程中蛋白質結構的變化使其粒徑、Zeta電位發(fā)生變化，導致漢麻乳離心沉淀率、溶解性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性的變化。

3 結 論

熱處理過程中，溫度對于漢麻乳的穩(wěn)定性、蛋白結構有一定影響。在熱處理溫度較低時漢麻乳蛋白結構伸展，進一步加熱漢麻乳蛋白發(fā)生聚合，在脂肪、多糖等大分子的共同作用下形成結構緊密的大聚集體。加熱過程中漢麻蛋白結構的變化導致了漢麻乳體系性質的改變。隨熱處理溫度的升高，漢麻蛋白α-螺旋結構的相對含量逐漸降低，無規(guī)卷曲結構的相對含量增加，蛋白質結構先伸展后聚集，漢麻乳蛋白平均粒徑逐漸增大，漢麻乳離心沉淀率不斷增加、NSI逐漸減小，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，在65 ℃時，漢麻乳乳化穩(wěn)定性最強，體系Zeta電位絕對值最大。研究結果表明熱處理條件對漢麻乳穩(wěn)定性的影響是由于漢麻蛋白結構發(fā)生了變化，加工中選取適宜的熱處理條件具有非常重要的意義，本研究結果可為漢麻乳熱處理加工提供理論參考。