聚甘油單月桂酸酯-油酸微乳體系的構建及其性能

趙敬松，王雨生,2，李天昊，趙文晴，陳海華,*

（1.青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農業(yè)大學學報編輯部，山東 青島 266109）

與乳狀液相同，微乳液是由油相、水相、表面活性劑組成的，但本質上微乳液與乳狀液完全不同。微乳液是自發(fā)形成的各向同性、外觀透明或半透明的熱力學穩(wěn)定體系，具有更小的粒徑（1～100 nm），穩(wěn)定性更高。微乳液對水不溶性、油不溶性物質均有較強的增溶能力，因此可作為食品組分的載體，例如，可用于增加功能成分、色素等的溶解度。但食品體系的復雜性和安全性對食品級微乳液提出了更高的要求，而現有的微乳體系大都存在著安全性問題，或者不夠高效，這很大程度上限制了微乳液在食品中的應用[1]。因此，亟需一種安全高效的微乳體系，以拓展微乳液在食品中的應用。

聚甘油單月桂酸酯是聚甘油與月桂酸形成的單酯，無色無味，對產品感官無不良影響，攝入人體后可被分解代謝，具有高度安全性，被聯(lián)合國糧農組織（Food and Agriculture Organization，FAO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦使用[2]，目前廣泛應用在食品工業(yè)中[3]。然而作為一種安全高效的非離子型表面活性劑，聚甘油單月桂酸酯在微乳體系中的應用研究尚鮮見報道，其微乳制品的特性和穩(wěn)定性也有待研究。

姜黃素是一種從植物中提取的含有二酮結構的色素，具有抗腫瘤[4]、調節(jié)免疫[5]、抗動脈粥樣硬化[6]等多種生物活性，并具有一定的防腐作用[7]，在食品工業(yè)中常用作著色劑。但姜黃素的水溶性差，生物利用率極低[8]，生物活性容易受溶液的極性、表面活性劑的影響[9]，這限制了姜黃素的應用。因此，提高姜黃素的溶解度和穩(wěn)定性一直是近年來的研究熱點。

本實驗以構建安全高效的微乳體系、有效增溶姜黃素為目標，構建一種食品級可無限稀釋的聚甘油單月桂酸酯-油酸微乳體系，探究表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）、水相pH值和NaCl濃度對微乳體系相行為的影響，分析微乳體系的結構，并對微乳液載姜黃素的性能進行研究，旨在提高姜黃素的溶解度，同時保持姜黃素的生物活性，拓展微乳液在食品中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油單月桂酸酯（glycerol monolaurate，GML）、三聚甘油單月桂酸酯（triglycerol monolaurate，TGM）、六聚甘油單月桂酸酯（hexapolyglycerol laurate，HGM）、十聚甘油單月桂酸酯（decaglycerol laurate，DGM）山東濱州金盛新材料科技有限責任公司；姜黃素（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；聚乙二醇（聚合度400） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；DDS-11C電導率儀 上海雷磁新涇儀器有限公司；ZEN3690激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；HT7700透射電子顯微鏡 日立儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微乳液的制備

根據文獻[10]的方法稍作修改。先將油相、表面活性劑和助表面活性劑按照一定比例混合均勻，然后在磁力攪拌器勻速攪拌下向體系中滴加去離子水，至體系澄清透明形成微乳液。

1.3.2 擬三元相圖的繪制

按照表面活性劑與油相的質量比（surfactant to oily phase weight ratio，SOR）為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10配制混合體系，按照1.3.1節(jié)方法制備微乳液，記錄體系由澄清變渾濁或由渾濁變澄清的臨界點，并計算臨界點時油相、表面活性劑和助表面活性劑相、水相三相各自所占比例，繪制擬三元相圖，其中陰影區(qū)域為微乳相區(qū)，空白區(qū)域為非微乳相區(qū)，其分界線即為澄清和渾濁的臨界點。

微乳液的可稀釋能力，即最小可稀釋比（dilution ratio，DR）可從擬三元相圖直接獲取[11-12]。圖1中，過水相所在三角形頂點向對邊引直線，直線上的點對應表面活性劑與油相之比，同一直線上SOR相等。該直線即為固定SOR的稀釋線。擬三元相圖就是沿不同SOR稀釋線進行稀釋的實驗結果。當稀釋線所經區(qū)域均為微乳相區(qū)時（圖1中SOR=24∶1稀釋線），說明在該SOR下無論如何改變水相占比，體系均為微乳，即可無限稀釋。最小可稀釋比是指當體系可無限度稀釋時，所對應最小的SOR，因此，較小的DR表明形成可無限稀釋體系所需表面活性劑比例較小。無DR即微乳體系不可無限稀釋，記為DR=N/A。

圖1 微乳液擬三元相圖Fig. 1 Pseudo-ternary phase diagram of microemulsion

1.3.3 微乳液的最佳配方及影響因素

1.3.3.1 表面活性劑種類及復配比例

固定制備溫度為25 ℃，選擇不同的表面活性劑，以乙醇作為助表面活性劑，表面活性劑與助表面活性劑質量比Km=1，制備微乳液并繪制擬三元相圖。

1.3.3.2 助表面活性劑種類

固定制備溫度為25 ℃，表面活性劑為HGM和DGM的復配物（質量比為2∶1），助表面活性劑分別為乙醇、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇，Km=1，制備微乳液并繪制擬三元相圖。

1.3.3.3Km值

固定制備溫度為25 ℃，表面活性劑為HGM和DGM的復配物（質量比為2∶1），以乙醇作為助表面活性劑，Km分別為2/1、1/1、1/2、1/3，制備微乳液并繪制擬三元相圖。

1.3.3.4 水相pH值

固定制備溫度為25 ℃，表面活性劑為HGM和DGM的復配物（質量比為2∶1），以乙醇作為助表面活性劑，Km=1，水相pH值分別為3、5、7、9、11，制備微乳液并繪制擬三元相圖。

1.3.3.5 水相NaCl濃度

固定制備溫度為25 ℃，表面活性劑為HGM和DGM的復配物（質量比為2∶1），以乙醇作為助表面活性劑，Km=1，水相NaCl濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L，制備微乳液并繪制擬三元相圖。

1.3.4 微乳液粒徑的測定

將制備好的微乳液樣品加入清潔的樣品池中，25 ℃恒溫保持2 min，使用激光粒度分析儀測定微乳體系粒徑。

1.3.5 微乳體系結構表征

采用電導率法[13]測定微乳結構。將表面活性劑、助表面活性劑和油相充分混合，并向其中逐滴滴加去離子水，記錄體系電導率。

1.3.6 微乳液的微觀形貌觀察

將制備好的微乳液樣品滴加在銅網上，凍干后置于透射電鏡觀察。

1.3.7 載姜黃素微乳液性能表征

1.3.7.1 姜黃素在微乳液中的溶解度

準確稱取姜黃素標準樣品6 mg，溶于100 mL 95%乙醇溶液中。分別取250、500、1 000、1 500、2 000 μL上述溶液用95%乙醇溶液定容至15 mL，配制成質量濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.006、0.008 mg/mL的標準溶液，于425 nm波長處測定吸光度（Y），得到姜黃素質量濃度（X/（mg/mL））標準曲線Y=134.54X＋0.003 1，R2=0.999 8。取適量姜黃素微乳液稀釋于300 倍體積的95%乙醇溶液中，測定其吸光度，并根據質量濃度標準曲線計算姜黃素溶解度。

1.3.7.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基清除能力

參照Wang Bini等[14]方法并稍做修改，測定姜黃素乙醇溶液、姜黃素微乳液對DPPH自由基的清除能力。用無水乙醇溶解DPPH并制備成0.1 mmol/L的儲備液。取1 mL樣品液，加入至2 mL DPPH儲備液，渦旋均勻后，于室溫下避光反應30 min，以無水乙醇為空白，在517 nm波長處測定吸光度為Ai。將1 mL樣品液加入至2 mL無水乙醇中，測定吸光度為Aj。將1 mL無水乙醇加入至2 mL DPPH儲備液中，測定吸光度為Ac，則待測液的DPPH自由基清除率如下：

1.4 數據處理

每個樣品平行測定3 次，取平均值。利用SPSS V22.0進行顯著性分析。采用Origin 8.0軟件繪制擬三元相圖，采用AutoCAD 2014計算DR及微乳區(qū)域面積占比S。

2 結果與分析

2.1 微乳體系的構建

2.1.1 表面活性劑的篩選

聚甘油單月桂酸酯分子中含有大量的羥基，聚合度不同的分子，其親水鏈的長度、羥基數量不同，直接影響親水親油平衡值（hydrophilic-lipophilic balance，HLB）和微乳形成能力[15]。

由圖2可知，隨著聚甘油單月桂酸酯聚合度的增大，微乳區(qū)域面積占比S先增大后減小，以HGM作為表面活性劑時，制備的微乳體系S最大，達到30.05%，而以GML為表面活性劑時，S最小。這表明聚甘油單月桂酸酯的聚合度對微乳液的形成有影響。這是因為當聚合度較低時，聚甘油單月桂酸酯分子鏈上的羥基較少，與水相之間可形成氫鍵的數量較少，載水量較低，另外分子鏈較短，親油性較弱[16]，形成微乳的能力較差，表現為S較小。聚合度的升高又會引起HLB的升高，而過高的HLB將導致表面活性劑分子難以在水相與油相之間相互穿插形成膠束，從而降低微乳液的形成能力，表現為S減小[17]。

由圖2還可以看出，采用GML和TGM制備的微乳液沒有DR，即采用這兩種表面活性劑時，表面活性劑和油相在任何配比下都無法形成可無限稀釋體系[18]。與DGM相比，采用HGM制備的微乳液，DR較小，說明乳化相同含量的油相并形成可無限稀釋體系，所需表面活性劑較少。本實驗選擇能夠形成可無限稀釋微乳體系的HGM、DGM進行復配形成表面活性劑。

配伍性較好的表面活性劑存在協(xié)同增效作用，復配后可以提高乳化效率，降低表面活性劑分子空間位阻，增加油水界面的柔性，提高微乳液的穩(wěn)定性[19]。如圖3所示，HGM與DGM以不同比例復配，隨著體系中HGM含量的增多，S先增大后減小。當HGM和DGM質量比為2∶1時，S最大為30.08%，與單一HGM作為表面活性劑時的S一致。另外，DR=9，顯著低于單一HGM和單一DGM的DR。這表明HGM與DGM間存在協(xié)同增效作用，復配后可以有效提高乳化能力，容易形成可無限稀釋微乳體系。因此，本實驗將HGM和DGM以質量比為2∶1的復配物作為表面活性劑。

圖2 不同聚合度的聚甘油單月桂酸酯制備微乳液的擬三元相圖Fig. 2 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with polyglycerol monosaurates with different degrees of polymerization

圖3 HGM與DGM不同復配比例制備微乳液的擬三元相圖Fig. 3 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with different mixing ratios between HGM and DGM

2.1.2 助表面活性劑的篩選

在微乳液的制備中，除表面活性劑外，通常還需要添加助表面活性劑進一步降低體系的表面張力。助表面活性劑可嵌入至表面活性劑分子間，從而降低表面活性劑分子間的相互作用力和界面彎曲能，增強界面膜的流動性，利于微乳液的形成[20]。此外，助表面活性劑還可以充當助溶劑，對外來物質起增溶作用[21]。

由圖4可知，4 種助表面活性劑中，乙醇作為助表面活性劑時形成的微乳體系澄清透明，流動性好，S最大，DR=9，是唯一能形成可無限稀釋微乳體系的助表面活性劑。而丙二醇、丙三醇、聚乙二醇所形成的體系黏稠、流動性差，臨界點不易判斷，甚至會有分層現象，S明顯較小。朱加進等[22]研究發(fā)現，使用乙醇、丙二醇、丙三醇作為助表面活性劑制備磷蝦油微乳液時，丙三醇無法形成微乳液，乙醇和丙二醇可以形成，且使用乙醇時S最大。Chaiyana等[23]分別采用乙醇、己醇制備微乳液時發(fā)現，乙醇體系的S遠大于己醇。鄒華生等[24]通過分析擬三元相圖得出，分別采用乙醇、正丁醇、正戊醇、異丁醇制備環(huán)己烷微乳液時，所得到S依次減小，且采用正戊醇和異丁醇時體系黏度明顯上升。乙醇作為助表面活性劑制備微乳液時S較大，這可能是由于乙醇分子空間位阻較小，更容易嵌入表面活性劑分子間，使吸附在界面膜上的乳化粒子排列更加緊密[25]，從而降低了體系黏度，利于微乳液的形成[26]；而丙二醇、丙三醇、聚乙二醇的分子鏈較長，親油能力強，甚至可充當油相角色，難以分配到油水界面上，導致形成微乳液的能力下降[27]。因此，選取乙醇作為助表面活性劑。

2.1.3Km的篩選

圖4 不同助表面活性劑制備微乳液的擬三元相圖Fig. 4 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with different cosurfactants

圖5 不同Km條件制備微乳液的擬三元相圖Fig. 5 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with different Km values

如圖5所示，Km對微乳區(qū)域面積影響顯著，隨著Km的減小，S逐漸升高。這可能是由于降低Km會使更多的助表面活性劑滲透到表面活性劑界面膜中，這增加了界面膜的柔性，有利于微乳液的形成[28]，另外，助表面活性劑親水性強，增水量較大，會進一步增大S。隨著Km的減小，DR、d均先降低后升高，且Km=1/2時最低。這可能是由于Km較大時，助表面活性劑含量較低，增水量較小，界面膜難以彎曲，表現為較大的DR和d。而當Km過小時，過量的助表面活性劑使表面活性劑從油水界面向連續(xù)相遷移[29]，難以維持較低的油水界面張力，水分含量較高時界面容易失去平衡，導致DR和d明顯升高[30]。因此，選取Km=1/2制備微乳液。

2.1.4 水相pH值的影響

由圖6可知，隨著水相pH值升高，S先升高后降低，在pH 7時，S最大；DR和d則先降低后升高，pH 7時最低。這表明水相pH值小于或大于7都不利于微乳液的形成，形成的微乳液粒徑較大。陶紫等[31]研究發(fā)現，體系的pH值越偏離中性，其電導率越大，油-水界面膜越不穩(wěn)定，微乳液越容易失穩(wěn)。

圖6 不同pH值水相制備微乳液的擬三元相圖Fig. 6 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with aqueous phases at different pH values

圖7 不同NaCl濃度水相制備微乳液的擬三元相圖Fig. 7 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsions prepared with aqueous phases with different NaCl concentrations

2.1.5 NaCl濃度的影響

圖8 不同NaCl濃度水相制備微乳液的粒徑分布Fig. 8 Particle size distribution of microemulsions prepared with aqueous phase with different NaCl concentrations

如圖7所示，隨著水相中NaCl濃度的逐漸升高，S明顯減小，DR升高。這可能是由于電解質濃度升高逐漸增強了表面活性劑的親油性[32]，使體系的增水量逐漸降低，形成可無限稀釋微乳體系的難度逐漸加大。而較高的離子強度會使表面活性劑發(fā)生鹽析，導致體系中游離的表面活性劑減少，難以維持較低的表面張力，從而抑制了微乳的形成[1]。張佩華等[33]根據實驗推測得出類似結果：隨著加入的電解質的增多，表面活性劑親油性增強、親水性減弱，體系增溶能力下降。值得注意的是，隨著水相中NaCl濃度的升高，微乳粒徑先降低后升高，NaCl濃度為0.6 mol/L時，微乳粒徑最小，為30.93 nm。這可能是由于少量的電解質加入使膠束雙電層壓縮，促使體系液滴進一步細化[1]，粒徑減小。另外，電解質可以降低表面活性劑的臨界膠束濃度，使部分表面活性劑自身發(fā)生締合形成膠束，如圖8中1～10 nm處的峰即為膠束峰（10～100 nm處的峰為微乳液滴粒徑分布峰）。膠束的粒徑較小，膠束的出現降低了體系平均粒徑。當水相中NaCl濃度過高時，液滴雙電層被進一步壓縮，液滴間容易互相接近，產生聚結，導致粒徑增大。

2.2 微乳液的結構表征

2.2.1 SOR對微乳液粒徑的影響

圖9 不同SOR制備的微乳液粒徑Fig. 9 Particle size of microemulsions prepared with different SORs at critical point

從圖9可以看出，SOR大于2∶8時，粒徑均小于100 nm，體系澄清透明。隨著SOR的降低，微乳液的粒徑先略有減小后增大，SOR為4∶6時，粒徑最小，為26.69 nm。當SOR小于3∶7時，較少的表面活性劑難以維持較低的表面張力，導致微乳液粒徑增大，體系變得渾濁[34]。此外，實驗中發(fā)現，SOR=8∶2時，制備的微乳液黏度較高，這或許是該條件下制備的微乳液粒徑較大原因。

2.2.2 微乳液結構分析

圖10 微乳液電導率隨水分含量變化的曲線Fig. 10 Change in electrical conductivity of microemulsions with water content

由圖10可知，SOR=9∶1時，微乳液可無限稀釋，即為無限可稀釋微乳體系。隨著含水量的升高，微乳液的電導率變化分為3 個階段，第1階段為含水量較?。ǖ陀?5%）的階段，在該階段，隨著含水量的增加，電導率迅速上升，這說明微乳液為油包水型（W/O型），通過分散于油相中的水滴互相碰撞而導電。W/O型微乳液的含水量升高時，其中的水滴密度隨之升高，水滴來回碰撞機會增多，形成導電鏈，表現為電導率升高[35]。第2階段微乳液的含水量介于45%和60%間，在該階段，提高微乳液的含水量，電導率變化較慢，這說明微乳液已由W/O型轉變?yōu)殡p連續(xù)型，液滴間發(fā)生黏性碰撞，油相和水相相互交錯為網絡通道，均形成連續(xù)相，因此提高含水量對微乳液的電導率影響不大[36]。第3階段的含水量超過60%，在該階段，提高微乳液的含水量，電導率迅速下降，說明微乳液由雙連續(xù)型完全轉變?yōu)樗托停∣/W型），O/W型微乳液的含水量增加時，作為導電粒子的油滴被逐漸稀釋，電導率下降[37]。

李玉琴等[38]以油酸為油相，以吐溫80為表面活性劑，以無水乙醇為助助表面活性劑，在SOR為9∶1時，僅能形成W/O型和雙連續(xù)型微乳液，且不可無限稀釋。郭靜等[30]將大豆卵磷脂、Span80與無水乙醇按照質量比3∶1∶2混合為表面活性劑相，以甘油溶液為水相，在SOR為9∶1時，增水量超過30%時就會破乳。因此本實驗所制備的聚甘油單月桂酸酯-油酸微乳體系具有良好的增水能力及可稀釋性。

圖10中，SOR為4∶6的微乳液，其第1階段和第2階段（含水量分別為低于20%、介于20%和35%之間）的電導率的變化趨勢與SOR=9∶1的微乳液一致，但第3階段（含水量超過35%）電導率隨含水量的提高而迅速上升，這可能是過多的水分破壞了微乳液的界面膜，發(fā)生了破乳現象。這說明SOR=4∶6時，微乳液不能轉變?yōu)镺/W型。

2.2.3 微乳液的微觀形貌

圖11 微乳液的透射電鏡照片Fig. 11 Transmission electron microscope photos of microemulsion

從圖11可以看出，微乳液滴呈均勻球形，表面光滑，平均粒徑10～100 nm。這與2.1.5節(jié)所測的微乳液粒徑分布一致，表明體系已形成均一的O/W型微乳液。

2.3 載姜黃素微乳液的特性評價

2.3.1 姜黃素溶解度

表1 姜黃素在不同溶劑中的溶解度Table 1 Solubility of curcumin in different solvents

由表1可知，姜黃素在油酸中的溶解度最低，僅為0.299 mg/mL，在質量分數均為15%的HGM和DGM表面活性劑水溶液中，姜黃素的溶解度有所升高，但仍很小，而在相同表面活性劑濃度的微乳液中，姜黃素溶解度明顯提高，可達到4.874 mg/mL，這說明微乳液具有比單一組分更高的溶解能力。曾慶晗等[39]以中鏈甘油三酯和卵磷脂制備了納米乳，姜黃素溶解度為3.669 mg/mL；匡建[40]以Gemini雙子表面活性劑制備的微乳液，在SOR=9∶1時，姜黃素的溶解度為4.709 mg/g，但Gemini雙子表面活性劑不允許應用在食品中。此外，烷基酚聚氧乙烯醚和聚氧乙烯氫化蓖麻油被廣泛報道用于制備微乳液增溶營養(yǎng)素[41-42]但均存在一定的安全性問題，在食品中的應用受到限制。另外，采用普通有機溶劑溶解姜黃素，在稀釋后易析出或沉淀，而采用可無限稀釋的水包油型微乳體系，由于姜黃素溶解在油相中，稀釋只會擴大連續(xù)相（水相）體積，并不改變油滴結構[12]，穩(wěn)定性更好。因此，本實驗所得到的聚甘油單月桂酸酯-油酸微乳體系安全性高、穩(wěn)定性好，能夠有效提高姜黃素溶解度。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

采用SOR=9∶1制備微乳液，調節(jié)含水量至65%，以此作為載體，測定不同姜黃素添加量微乳液的DPPH自由基清除能力。以姜黃素乙醇溶液作為對照。

圖12 姜黃素微乳液及姜黃素乙醇溶液的DPPH自由基清除能力Fig. 12 Scavenging effects of curcumin microemulsion and curcumin ethanol solution on DPPH radical

由圖12可知，姜黃素乙醇溶液的DPPH自由基清除率隨著姜黃素添加量的增加而上升。當姜黃素添加量超過0.15 mg/g時，繼續(xù)提高姜黃素添加量，DPPH自由基清除率不再變化。而姜黃素微乳液的DPPH自由基清除率變化趨勢與姜黃素乙醇溶液相似。姜黃素質量濃度相同時，姜黃素微乳液的DPPH自由基清除率接近于姜黃素乙醇溶液的，差異很小。這表明姜黃素微乳化并不影響姜黃素的生物活性，本實驗所制備微乳液可作為姜黃素的優(yōu)良載體。

3 結 論

本實驗使用聚甘油月桂酸酯和油酸，通過擬三元相圖法確定了一種安全性高、可稀釋的微乳體系配方，并探究水相pH值、NaCl濃度對微乳體系的影響，采用電導率法測定了體系的相轉變行為，最后分析了微乳體系載姜黃素性能。微乳液的配方為：HGM和DGM按質量比2∶1復配為表面活性劑，乙醇為助表面活性劑，Km=1/2。該微乳體系具有42.19%的最大微乳區(qū)面積，最小可稀釋比低至7.33，表面活性劑比例較低。當體系含水量超過60%時，可形成O/W型均一微乳液。激光粒度分析及透射電鏡照片顯示，微乳液滴呈均一球形，粒徑最小為26.69 nm，證實了微乳的形成。該微乳體系具有較高的載姜黃素能力，姜黃素溶解度達4.87 mg/mL，溶解在該微乳體系的姜黃素抗氧化活性與乙醇姜黃素溶液相當，保持了姜黃素的生物活性，有效解決了姜黃素水溶性差、稀釋性差問題。關于微乳體系對其他疏水物質的運載性能尚需進一步研究。