紅曲菌發(fā)酵對(duì)低鹽半干鯇魚(yú)的提味增鮮作用

吳 康，謝靜暉，王倩倩，齊 明，吳建中,*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院汽車(chē)工程學(xué)院，廣東 佛山 528137）

鯇魚(yú)別名草魚(yú)，飼料來(lái)源廣、生長(zhǎng)迅速，肉質(zhì)嫩而不膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一[1-2]。商品鯇魚(yú)通常1～5 kg，肉厚刺少，除以鮮活魚(yú)銷(xiāo)售外，還適合加工成咸魚(yú)，但傳統(tǒng)咸魚(yú)鹽分高、肉質(zhì)硬，不符合現(xiàn)代消費(fèi)需求。近年來(lái)市場(chǎng)出現(xiàn)的低鹽半干魚(yú)的鹽分和水分適中，是傳統(tǒng)咸魚(yú)的換代產(chǎn)品，將鯇魚(yú)加工成低鹽半干魚(yú)具有廣闊的市場(chǎng)前景[3]。但低鹽半干魚(yú)由于用鹽量低，干燥時(shí)間短，缺少了傳統(tǒng)腌制工藝中的自然接種和自然發(fā)酵，其口感接近于新鮮魚(yú)，缺失了傳統(tǒng)咸魚(yú)的醇厚口感。

通過(guò)人工微生物接種可以改善半干魚(yú)和咸魚(yú)等魚(yú)產(chǎn)品的口感與品質(zhì)。著名的徽菜“臭鱖魚(yú)”就是典型的發(fā)酵魚(yú)；周長(zhǎng)艷等[4]在傳統(tǒng)腌制魚(yú)上接種乳酸菌，結(jié)果表明：發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品咸度、揮發(fā)性鹽基氮以及過(guò)氧化值都明顯降低，保留了傳統(tǒng)臘魚(yú)的口感與香臘味；高繼慶等[5]利用木糖葡萄球菌發(fā)酵海鱸魚(yú)，結(jié)果表明，魚(yú)肉硬度、咀嚼性、膠黏性明顯增加，小分子肽和氨基酸含量明顯上升；明庭紅等[6]利用植物乳桿菌發(fā)酵草魚(yú)，結(jié)果表明：草魚(yú)肉中的主要腥味物壬醛和2,4-癸二烯醛等逐漸減少，香味物質(zhì)D-檸檬烯和1-辛烯-3-醇等明顯升高。本課題組將紅曲菌發(fā)酵技術(shù)引入低鹽半干魚(yú)工藝，制作出的產(chǎn)品色香味俱佳，不僅具有傳統(tǒng)咸魚(yú)的“臘香味”，而且滋味明顯比普通半干魚(yú)更加鮮美。

鮮味是食品五大基本味覺(jué)之一，也是深受人們喜愛(ài)的美味之一[7]，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵魚(yú)的研究大多集中在制備工藝和籠統(tǒng)的風(fēng)味方面，而關(guān)于發(fā)酵魚(yú)中鮮味物質(zhì)含量和組成的研究較少報(bào)道。鑒于紅曲菌發(fā)酵對(duì)半干鯇魚(yú)具有明顯的提味增鮮作用，為揭示其中原因，分別制備紅曲菌發(fā)酵型半干魚(yú)及其對(duì)照品，分別對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，測(cè)定其水可溶性氮（water soluble nitrogen，WSN）、三氯乙酸可溶性氮（tricholoracetate acid soluble nitrogen，TCA-SN）、游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）、肌苷酸（guanosine 5′-monophosphate，5′-IMP）和鳥(niǎo)苷酸（inosine 5′-monophosphate，5′-GMP）的含量，計(jì)算出滋味活性值（taste activity value，TAV）和味精當(dāng)量（equivalent umami concentration，EUC），通過(guò)分析紅曲菌發(fā)酵對(duì)半干鯇魚(yú)鮮味成分的影響，找出其規(guī)律，旨在為進(jìn)一步優(yōu)化半干魚(yú)滋味打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙泉湖牌鮮泉鯇魚(yú)購(gòu)買(mǎi)于華潤(rùn)萬(wàn)家超市；GIM3.439紫紅曲菌購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心。17 種氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；AMP標(biāo)準(zhǔn)品、GMP標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司；YXQ-手提式壓力蒸汽滅菌鍋上海華線(xiàn)醫(yī)用核子儀器有限公司；無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。LC-20A高效液相色譜 日本島津公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；熱泵干燥設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及其制備

紅曲菌種子液：1）斜面培養(yǎng)：取活化后的紅曲菌菌種，接入121 ℃高壓滅菌后的PDA試管斜面，30 ℃培養(yǎng)7～10 d；2）擴(kuò)大培養(yǎng)：將米粉6 g、大豆蛋白2.5 g、硫酸鎂0.1 g、磷酸二氫鉀0.05 g、蒸餾水100 mL混勻，高壓滅菌后得到紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)基，然后吸取5 mL無(wú)菌水注入斜面中，振搖15 min，將紅褐色的孢子洗入滅菌后的紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d，得到深紅色均勻的紅曲菌種子液。

紅曲菌發(fā)酵劑：按照米-水比例10∶9在大米中加入蒸餾水，蒸熟后，放置超凈工作臺(tái)中冷卻至室溫得大米培養(yǎng)基，取無(wú)菌水、紅曲菌種子液、大米培養(yǎng)基按3∶4∶20比例接入大米培養(yǎng)基，并攪拌均勻，30 ℃培養(yǎng)2 d得到深紅色的紅曲米，打漿得紅曲菌發(fā)酵劑。

普通半干魚(yú)制備：將鯇魚(yú)去鱗、頭、尾、鰭和內(nèi)臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h，然后轉(zhuǎn)移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚(yú)體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%左右，真空包裝后即為普通半干魚(yú)組成品。

紅曲菌發(fā)酵魚(yú)制備：將鯇魚(yú)去鱗、頭、尾、鰭和內(nèi)臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滾揉涂布的方式接種紅曲菌發(fā)酵劑，接種量為9%，然后在30 ℃發(fā)酵18 h，最后轉(zhuǎn)移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚(yú)體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%左右，真空包裝后即為紅曲菌發(fā)酵組成品。

添加滅活發(fā)酵劑半干魚(yú)制備：將鯇魚(yú)去鱗、頭、尾、鰭和內(nèi)臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滾揉涂布的的方式添加經(jīng)高溫滅活的紅曲菌發(fā)酵劑，添加量為9%，然后轉(zhuǎn)移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚(yú)體水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%左右，真空包裝后即為添加滅活發(fā)酵劑組成品。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

將干燥結(jié)束后的魚(yú)塊蒸煮15 min，每次挑選10 名暨南大學(xué)食品系教師及學(xué)生，分別對(duì)成品進(jìn)行感官評(píng)定，采用評(píng)分檢驗(yàn)法進(jìn)行打分，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依照表1[8]。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-salt semi-dried fish

1.3.3 TCA-SN的測(cè)定

參考Visessanguan等[9]的方法。取魚(yú)肉3 g，加入27 mL 10% TCA溶液，均質(zhì)2 min后冰浴1 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min并取上清液。通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定TCA-SN含量。

1.3.4 WSN的測(cè)定

參照Sun Weizheng[10]的方法。稱(chēng)取3 g樣品，加入15 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 6.0，50 mmol/L），研磨2 min，4 ℃放置2 h，冷凍離心（10 000 r/min，15 min），快速過(guò)濾后取10 mL上清液進(jìn)行消化，其他步驟同凱氏定氮法。

1.3.5 FAA的測(cè)定

參考劉登勇等[11]的方法，并作適當(dāng)修改，在50 mL離心管中加入約4 g魚(yú)肉樣品和20 mL 50 mg/mL磺基水楊酸，均質(zhì)2 min。將均質(zhì)后的混合液4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液加純水定容到50 mL，將水相過(guò)0.22 μm膜，用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。樣品采用柱后茚三酮在135 ℃條件下衍生，記錄440 nm和570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。每種氨基酸的定量通過(guò)其與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積比較確定。通過(guò)比較氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間和峰面積定量樣品中氨基酸的種類(lèi)和數(shù)量。

1.3.6 5′-IMP、5′-GMP的測(cè)定

提?。簠⒖糑ong Li等[12]的方法，略有改動(dòng)。取魚(yú)肉5 g加入20 mL 10%的高氯酸溶液，研磨，然后10 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀用10 mL 5%的高氯酸溶液洗滌，離心取上清液，用10 mol /L和1 mol/L的KOH溶液調(diào)pH值至6.5，靜置30 min，取上清液加純水定容至50 mL。搖勻，過(guò)0.22 μm膜后測(cè)定。整個(gè)過(guò)程在0～4 ℃條件下操作。

色譜條件：高效液相色譜儀色譜柱：SUPELCO DiscoveryR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH 5.16）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢驗(yàn)波長(zhǎng)254 nm；分析時(shí)間17 min。

采用外標(biāo)法定量分析，配制GMP和IMP混標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L。以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.7 TAV的計(jì)算

TAV是樣品中滋味活性物質(zhì)含量與其呈味閾值的比值。通過(guò)FAA、呈味核苷酸和有機(jī)酸含量計(jì)算出相應(yīng)的TAV，找出對(duì)魚(yú)肉滋味有顯著貢獻(xiàn)的成分。當(dāng)TAV大于1時(shí)，認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)呈味有貢獻(xiàn)，而TAV小于1時(shí)認(rèn)為該物質(zhì)對(duì)呈味沒(méi)有貢獻(xiàn)，由此可以確定主要的呈味物質(zhì)[13]。

1.3.8 EUC的計(jì)算

EUC衡量呈現(xiàn)谷氨酸鈉鹽滋味活性的氨基酸類(lèi)（谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp））與5′-核苷酸整體對(duì)食品鮮味的貢獻(xiàn)[14]。如下式所示：

式中：ai為鮮味氨基酸（Glu或Asp）含量/（g/100 g）；bi為鮮味氨基酸相對(duì)于味精（monosodium glutamate，MSG）的相對(duì)鮮度系數(shù)（Glu為1；Asp為0.077）；aj為呈味核苷酸（5′-IMP、5′-GMP）含量/（g/100 g）；bj為呈味核苷酸相對(duì)于IMP的相對(duì)鮮度系數(shù)（5′-IMP為1；5′-GMP為2.3）；1 218是協(xié)同作用常數(shù)。

1.3.9 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[15]。

1.3.10 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值測(cè)定

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的微量擴(kuò)散法測(cè)定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)分析

表2 3 組半干魚(yú)產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)得分Table 2 Sensory evaluation scores of three groups of semi-dried fish products

將3 種半干魚(yú)產(chǎn)品隨機(jī)編碼后，按表1隨機(jī)進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果如表2所示。紅曲菌發(fā)酵組產(chǎn)品的滋味和氣味顯著優(yōu)于其他2 組（P＜0.05），但普通半干魚(yú)和添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品的氣味沒(méi)有顯著性差別。紅曲菌發(fā)酵組產(chǎn)品的色澤顯著優(yōu)于其他2 組（P＜0.05），但其質(zhì)構(gòu)與其他2 組沒(méi)有顯著性差別。從綜合評(píng)分上看，紅曲菌發(fā)酵組產(chǎn)品得分最高，普通半干魚(yú)組次之，添加滅活發(fā)酵劑組最低。這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生了大量多肽和FAA及其進(jìn)一步代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)賦予其獨(dú)特鮮味口感和特殊發(fā)酵風(fēng)味[17]。

2.2 TCA-SN、WSN的比較分析

圖13 組半干魚(yú)產(chǎn)品中TCA-SN、WSN的含量Fig. 1 Contents of TCA soluble nitrogen and WSN in three groups of semi-dried fish products

由圖1可知，添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品中的TCA-SN從普通半干魚(yú)組的（3.474±0.306）mg/g顯著提高到（4.085±0.015）mg/g（P＜0.05）。另一方面，紅曲菌發(fā)酵組TCA-SN含量明顯高于添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品（P＜0.05），表明產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)了大量蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象，小肽類(lèi)物質(zhì)含量明顯增加。

WSN與TCA-SN含量呈現(xiàn)同樣規(guī)律，紅曲菌發(fā)酵組WSN含量最高，其次是添加滅活發(fā)酵劑組，最后是普通半干魚(yú)組，綜上所述，紅曲菌發(fā)酵劑中含有一定量的小肽、FAA等含氮物質(zhì)；在普通半干魚(yú)上接種紅曲菌發(fā)酵劑，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間發(fā)酵后，產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)被大量降解，導(dǎo)致小分子肽和FAA的含量明顯增加[18-19]。

2.3 FAA的比較分析

由表3可知，除Arg外，添加滅活發(fā)酵劑組中各種FAA含量均顯著高于普通半干魚(yú)組，鮮味氨基酸和總游離氨基酸也顯著增加（P＜0.05），表明紅曲菌發(fā)酵劑中含有一定量的FAA。另一方面，紅曲菌發(fā)酵組與添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品相比，總游離氨基酸含量從（489.50±7.66）mg/100 g顯著增加到（779.69±10.02）mg/100 g（P＜0.05），除Ser、His、Arg外，其他FAA含量均增加，尤其是Asp、Glu、Met、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe，其含量增加超過(guò)3 倍，其中Asp和Glu為典型的鮮味氨基酸，賦予發(fā)酵魚(yú)獨(dú)特鮮味[20]，同時(shí)，芳香氨基酸（Phe）、支鏈氨基酸（Leu、Ile、Val）和Met是許多重要風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)[21]。

表3 3 組半干魚(yú)產(chǎn)品FAA含量Table 3 Contents of free amino acids in three groups of semi-dried fish products mg/100 g

2.4 呈味核苷酸的比較分析

表4 3 組半干魚(yú)產(chǎn)品中核苷酸質(zhì)量濃度Table 4 Contents of nucleotides in three groups of semi-dried fish products mg/mL

半干魚(yú)產(chǎn)品的獨(dú)特滋味不僅與游離呈味氨基酸有關(guān)，還與呈味核苷酸密切相關(guān)，一般認(rèn)為，GMP和IMP具有突出的鮮味，是食品工業(yè)中常用的鮮味劑[22]。由表4可知，添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品中5′-GMP、5′-IMP含量顯著高于普通半干魚(yú)組（P＜0.05），尤其是GMP含量增加了5 倍以上。此外，紅曲菌發(fā)酵組與添加滅活發(fā)酵劑組魚(yú)產(chǎn)品相比，5′-GMP、5′-IMP含量顯著增加（P＜0.05），表明紅曲菌發(fā)酵過(guò)程能有效促進(jìn)三磷酸腺苷的降解，有助于提升肉質(zhì)的鮮味。

2.5 滋味物質(zhì)的呈味作用和鮮味強(qiáng)度評(píng)價(jià)

滋味物質(zhì)的呈味作用不僅取決于呈味物質(zhì)的濃度，還與呈味物質(zhì)的閾值有關(guān)[23]。由表5可知，與普通半干魚(yú)組及添加滅活發(fā)酵劑組相比，紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)中5′-GMP、Glu的TAV值均大于1，導(dǎo)致發(fā)酵魚(yú)的鮮味更加突出，與Lys、His一起構(gòu)成了紅曲菌發(fā)酵魚(yú)的主要滋味貢獻(xiàn)物質(zhì)，其中His能夠使發(fā)酵魚(yú)的口感更加醇厚。

表5 3 組半干魚(yú)產(chǎn)品中滋味物質(zhì)的含量 、滋味特征、閾值和TAVTable 5 Thresholds and TAVs of taste compounds in three groups of semi-dried fish products

圖2 半干魚(yú)產(chǎn)品的EUCFig. 2 EUCs of three groups of semi-dried fish products

EUC是基于FAA與呈味核苷酸之間協(xié)同作用對(duì)鮮味進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，這種分析方法被廣泛應(yīng)用于食品鮮味特征的研究[27]。如圖2所示，紅曲菌發(fā)酵組產(chǎn)品中EUC值最高，為7.34 g/100 g，其次為添加滅活發(fā)酵劑組產(chǎn)品中EUC值為1.51 g/100 g，普通半干魚(yú)組EUC值最低，為0.20 g/100 g。紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)中EUC值是添加滅活發(fā)酵劑組的4.38 倍，因此紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)的鮮味程度的得到極大提高。

2.6 紅曲菌發(fā)酵對(duì)樣品總菌數(shù)的影響

由圖3可知，3 組樣品的總菌數(shù)從高到低的順序是：紅曲菌發(fā)酵組、普通半干魚(yú)組和添加滅活發(fā)酵劑組。紅曲菌發(fā)酵組顯著高于普通半干魚(yú)組（P＜0.05），其中原因是經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，紅曲菌的數(shù)量增加。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)添加滅活發(fā)酵劑組的總菌數(shù)低于普通半干魚(yú)的總菌數(shù)（P＜0.05），推測(cè)紅曲菌發(fā)酵劑雖然經(jīng)過(guò)滅活，仍然具有一定抑菌作用[28]，抑制了半干魚(yú)中微生物的生長(zhǎng)。

圖3 半干魚(yú)產(chǎn)品的總菌數(shù)Fig. 3 otal bacterial counts of three groups of semi-dried fish products

2.7 紅曲菌發(fā)酵對(duì)樣品TVB-N值的影響

圖4 半干魚(yú)產(chǎn)品的揮發(fā)性鹽基氮Fig. 4 TVB-N values of three groups of semi-dried fish products

TVB-N值是評(píng)估魚(yú)肉制品新鮮度和衛(wèi)生性的重指標(biāo)[29]。由圖4可知，雖然在30 ℃發(fā)酵了18 h，紅曲菌發(fā)酵組TVB-N值僅稍高于普通半干魚(yú)組和添加滅活發(fā)酵組（P＜0.05），此時(shí)紅曲菌發(fā)酵組TVB-N值仍遠(yuǎn)低于25 mg/100 g的安全標(biāo)準(zhǔn)（GB 1036—2015《動(dòng)物性水產(chǎn)制品》）[30]。

3 結(jié) 論

紅曲菌發(fā)酵后的半干魚(yú)產(chǎn)品滋味更加鮮美醇厚，色澤紅潤(rùn)誘人；紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)樣品中WSN、TCA-SN含量顯著增加；總FAA，特別是Glu和Asp等鮮味氨基酸的含量明顯增加，5′-GMP和5′-IMP等呈鮮核苷酸含量也明顯提高。紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)樣品中5′-GMP與Glu的TAV均大于1，表明該兩成分對(duì)產(chǎn)品鮮味味貢獻(xiàn)程度大。紅曲菌發(fā)酵半干魚(yú)樣品的EUC達(dá)到7.34 g/100 g，是添加滅活發(fā)酵劑組魚(yú)樣品的4.38 倍，表明紅曲菌發(fā)酵后的低鹽半干鯇魚(yú)鮮味得到明顯增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)紅曲菌適度發(fā)酵的半干鯇魚(yú)，其TVB-N值能夠控制在安全范圍，但鮮味氨基酸和核苷酸含量顯著增加，滋味更加鮮美。