超聲輔助濁點(diǎn)萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中天然VK同系物

李凱龍，陳同強(qiáng)，徐文泱，李 濤，王亮亮，王 芳，孫桂芳

（食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111）

VK主要包括2-甲基-3-植基-1,4-萘醌又名葉綠醌（phylloquinone，PK）、甲基萘醌（menaquinone-n，MK-n）和甲萘醌（menadione，MD）[1-2]，PK和MK是VK的天然形式，而MD是一種用作藥物的化學(xué)合成衍生物，但也有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)飲食攝入后，腸道細(xì)菌可以將PK分解為MD的現(xiàn)象[3]。VK不僅與凝血功能有關(guān)，而且與骨代謝有關(guān)，還被用于治療惡性腫瘤、支氣管哮喘等疾病，近年研究發(fā)現(xiàn)，VK缺乏的共同危險(xiǎn)因素還包括膳食攝入量不足、吸收不良綜合征（尤其是膽汁淤積性肝疾病）、抗生素治療和腎功能不全等[4]。食物中最常見(jiàn)的VK是PK，它可由所有植物和綠藻產(chǎn)生，蔬菜的綠色強(qiáng)度一般也與PK含量有關(guān)[5]。雖然PK普遍存在于各種食物中，但PK的主要食物來(lái)源還是綠葉蔬菜和植物油。MK合成由腸道菌群中的細(xì)菌完成，其作用是細(xì)菌呼吸運(yùn)輸鏈中的電子載體[1]，所以MK主要存在于肉類(lèi)、乳制品和發(fā)酵食品，如奶酪中，以四烯甲萘醌（menatetrenone 4，MK-4）、七烯甲萘醌（menatetrenone 7，MK-7）最具代表性[5]。

目前，食品中VK的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[6]、液相色譜-串聯(lián)紫外檢測(cè)法[5,7-8]或熒光檢測(cè)法（需要衍生化步驟）[9-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法，離子源分為大氣電壓離子源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）[12-14]和電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）[15-18]，離子模式均為正離子模式。VK分析測(cè)定的食物基質(zhì)主要為果蔬[5,12,14,16-17,19-20]、植物油[21-22]、奶制品和嬰幼兒配方奶粉[13,15,23-25]。因VK不穩(wěn)定，所以提取VK的前處理需避免影響穩(wěn)定性的因素，如紫外線、堿性和酸性介質(zhì)等。對(duì)于富含脂質(zhì)基質(zhì)的食品如牛奶等，還需增加水解步驟，確保脂質(zhì)盡可能被皂化[13,25]或酶解消化去除[15]。食品中VK常見(jiàn)的萃取方法是利用正己烷從樣品基質(zhì)中分離維生素，再通過(guò)固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[5,26-27]、基質(zhì)固相分散萃?。╩atrix solid phase dispersion，MSPD）[12]或加速溶劑萃取法[19]對(duì)提取物的VK進(jìn)行純化。樣品處理量大，穩(wěn)定性受到影響。

近年來(lái)出現(xiàn)的樣品處理微型化技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)被測(cè)物質(zhì)在最小環(huán)境影響下的高濃縮，研究表明分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[14]、固相微萃取[28]和濁點(diǎn)萃取（cloud point extraction，CPE）法[29]技術(shù)對(duì)維生素的預(yù)濃縮具有很好的效果，與傳統(tǒng)常規(guī)萃取方法中用到有毒表面活性劑和易燃有機(jī)試劑相比，CPE法的預(yù)濃縮過(guò)程廣泛應(yīng)用非離子表面活性劑，是一種高效的綠色微萃取方法。考慮到CPE在預(yù)濃縮步驟中的優(yōu)越性，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蔬菜中天然VK同系物的CPE提取方法，并以超聲輔助提取，通過(guò)LC-ESI-MS/MS對(duì)蔬菜中的PK和MK-4進(jìn)行定性、定量分析，旨在為食品中VK的檢測(cè)、應(yīng)用和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種蔬菜：卷心萵苣（生菜）、上海青、菊苣、羽衣甘藍(lán)、菠菜、水芹菜、白蘿卜（根莖）和胡蘿卜（根莖）均為市購(gòu)。

PK、MK-4標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；非離子表面活性劑聚乙二醇4-叔辛基苯基醚（Triton X-45）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-114）、1-己基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C6MIm]NTf2）、1-甲基-3-辛基雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C8MIm]NTf2）和1-十二烷基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C12MIm]NTf2） 德國(guó)Merck公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙醇、乙腈（均為色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水Milli-Q系統(tǒng)純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantis LC-MS/MS聯(lián)用儀（配有ESI） 美國(guó)Thermo公司；A11均質(zhì)儀 德國(guó)IKA公司；UP200H手持式超聲波處理器 德國(guó)Hielscher公司；EBA20/20S離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；M3-L205C家用微波爐 中國(guó)美的集團(tuán)；Milli-Q超純水器 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作溶液的配制

分別精密稱(chēng)取2 種化合物各10.0 mg，用乙醇溶解并定容至50.00 mL。此標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL，貯存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃避光保存。作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用乙醇稀釋并定容，其中PK和MK的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，-20 ℃避光保存。用乙醇適當(dāng)稀釋1.0 μg/mL PK和MK的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制不同質(zhì)量濃度的校準(zhǔn)標(biāo)樣，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨溶液；流動(dòng)相B：含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；洗脫程序：0～4.0 min，30%～90% A，70%～10% B；4.0～6.0 min，90% A，10% B；6.0～8.0 min，90%～30% A，10%～70% B；8.0～10 min，30% A，70% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；噴霧電壓3.0 kV；離子傳輸管溫度325 ℃；霧化器溫度350 ℃；鞘氣（N2）壓力40 psi；輔助氣（N2）壓力10 arb；碰撞氣（Ar）流速2.5 L/h；循環(huán)時(shí)間0.5 s；Q1分辨率0.7，Q3分辨率0.7。在正離子監(jiān)測(cè)模式下，分別對(duì)碰撞能量和選擇離子等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取碰撞后所得豐度較高的2 個(gè)子離子作為特征離子。

1.3.4 樣品前處理

新鮮蔬菜樣品用蒸餾水洗滌數(shù)次并自然風(fēng)干去除多余的水分。為防止VK的降解，需將樣品保存在4 ℃弱光條件下，樣品在到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后48 h內(nèi)進(jìn)行分析。將所有樣品手動(dòng)切成長(zhǎng)寬約0.5 cm的小塊，使用電動(dòng)均質(zhì)器均質(zhì)化。超聲輔助提取分離蔬菜樣品中的維生素，稱(chēng)取1.5 g樣品至裝有0.15 g氯化鈉的15 mL玻璃離心管中，加入2 mL乙腈?；靹蚝笥贸曁筋^直接進(jìn)行超聲處理，探頭以52.5%振幅、0.75 s脈沖處理1 min，6 000 r/min離心5 min。取1 mL乙腈上清液，加入5 mL含0.4 mg/mL氯化鈉的10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 7），加入50 μL的0.15 g/mL的Triton X-45，手動(dòng)混勻30 s。將所得溶液置于水浴中，并在家用微波爐中以最大功率900 W加熱20 s，得到渾濁溶液，VK提取到通過(guò)樣品溶液分散的凝聚層細(xì)小液滴中；然后將試管浸入冰浴中5 min，以促進(jìn)富表面活性劑相的分離，表面活性劑相沉淀在錐形管底部（液滴體積約15 μL），使用微注射器收集，將回收的液滴置于進(jìn)樣小瓶中，加入30 μL甲醇進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮⑵渫ㄟ^(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器注入LC-MS/MS系統(tǒng)。試樣液經(jīng)LC-MS/MS分析，根據(jù)保留時(shí)間和離子對(duì)定性，外標(biāo)峰面積法定量。用乙醇配制50 ng/mL的PK和MK混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性質(zhì)控樣品，-20 ℃條件下可穩(wěn)定保存1 個(gè)月，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明白蘿卜中未檢測(cè)到PK和MK，因此采用白蘿卜作為空白基質(zhì)樣品用作陰性質(zhì)控樣品。采用4因素3水平設(shè)計(jì)對(duì)影響CPE萃取效率的不同變量進(jìn)行優(yōu)化，即表面活性劑體積、水相體積、氯化鈉質(zhì)量濃度和加熱時(shí)間（表1）。取超聲輔助提取后的1 mL乙腈提取液用于分析物的富集，并用5～9 mL范圍內(nèi)的不同水量進(jìn)行稀釋?zhuān)砻婊钚詣┨砑芋w積在50～150 μL之間，氯化鈉質(zhì)量濃度范圍在0.2～0.4 g/L之間，當(dāng)將表面活性劑-萃取相混合物加熱到相應(yīng)的濁點(diǎn)溫度以上（25～38 ℃之間，取決于質(zhì)量濃度）時(shí)，會(huì)形成云層狀渾濁溶液。使用水浴在10～20 min范圍內(nèi)研究不同加熱時(shí)間的影響。所有處理均應(yīng)將混合物以3 500 r/min離心3 min，然后在-20 ℃冰箱中冷凍5 min，以促進(jìn)相的分離。

表1 CPE變量試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables studied in one-factor-at-a-time design for CPE

1.3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)樣品制備：稱(chēng)取1～1.5 g（精確至0.1 mg）均質(zhì)后的2 種蔬菜樣品（萵苣和蘿卜），一份作為基質(zhì)本底值測(cè)定，一份置于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加40、80 ng/g和120 ng/g 3 個(gè)水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，均扣除本底值后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。室溫放置1 h，待樣品完全吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按上述1.3.4節(jié)步驟進(jìn)行前處理，測(cè)定不同樣品加標(biāo)回收率。

1.3.6 檢出限、定量限和精密度實(shí)驗(yàn)

按照上述樣品提取條件，按照信噪比不小于3計(jì)算檢出限（limits of detection，LOD），以信噪比不小于10計(jì)算定量限（limits of quantification，LOQ）。根據(jù)重復(fù)性要求，在同一天和不同日期分別測(cè)定10 次PK和MK添加含量為100 ng/g白蘿卜樣品的重復(fù)性，測(cè)定不同樣品日內(nèi)與日間的精密度，以RSD計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜采集和數(shù)據(jù)處理采用Thermo Scientific TraceFinder TM和Xcalibur數(shù)據(jù)系統(tǒng)軟件（美國(guó)Thermo公司）軟件。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示，采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2 個(gè)處理數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，2 個(gè)以上處理數(shù)據(jù)采用兩因素方差分析（Two-way ANOVA）進(jìn)行比較，P≤0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò)在流動(dòng)注射模式下將1.0 μg/mL的2 種VK直接注入離子源中，根據(jù)2 種VK的化合物結(jié)構(gòu)，選擇在正離子模式下進(jìn)行優(yōu)化。采用一級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行母離子全掃描，分析得到[M＋H]＋離子峰；再采用二級(jí)質(zhì)譜，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，對(duì)目標(biāo)化合物的子離子進(jìn)行全掃描，每種VK選擇2 個(gè)信號(hào)穩(wěn)定且強(qiáng)度高的m/z為定性離子對(duì)，選擇其中信號(hào)強(qiáng)度高且受基質(zhì)干擾小的m/z為定量離子對(duì)，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 VK同系物的分子式和分析條件Table 2 Molecular formulae and mass spectrometric parameters of VK homologues

2.2 色譜條件的優(yōu)化

使用反相液相色譜，通過(guò)注入5.0 μL質(zhì)量濃度為100.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化色譜分離條件。分析流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的不同比例混合流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物的分離結(jié)果。色譜分離的最終選擇條件、分析化合物的保留時(shí)間以及MS/MS儀器參數(shù)如表2所示?；衔锏谋Ａ魰r(shí)間是通過(guò)在同一天范圍內(nèi)進(jìn)行10 次連續(xù)分析和在不同日期進(jìn)行10 次連續(xù)分析而綜合確定的。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 超聲提取步驟的優(yōu)化

脂溶性維生素分析的食品樣品的前處理通常涉及皂化過(guò)程、固液萃取和液液萃取過(guò)程，有時(shí)還需要酶促水解過(guò)程[30]。但因VK在皂化性條件下不穩(wěn)定，所以本方法不采用皂化處理，而采用乙腈作為提取劑提取食物中的VK也已有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，因此本方法采用乙腈進(jìn)行固液萃取。此外，考慮到光和熱對(duì)VK穩(wěn)定性的影響，選擇在室溫和光線較暗的條件下進(jìn)行樣品處理。使用生菜（添加0.5 μg/g的PK和MK），首先優(yōu)化樣品量（1.0～3.0 g）和提取液乙腈（1～3 mL）的用量比，結(jié)果表明使用2 mL乙腈萃取1.5 g樣品得到的回收率最高，所以該樣液比被選擇用于進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；通過(guò)在乙腈提取液中添加氯化鈉，可以增加維生素向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移，且可促進(jìn)相分離，因此比較0.1～0.5 g范圍內(nèi)的不同氯化鈉添加量的效果，結(jié)果表明添加0.15 g氯化鈉可獲得最佳結(jié)果，而再增加氯化鈉的量會(huì)降低方法靈敏度，所以選擇在乙腈提取液中添加0.15 g氯化鈉以提高萃取效率；最后比較使用水浴超聲和超聲探頭直接浸入樣品超聲的提取效果，結(jié)果表明使用超聲探頭獲得的回收率約為使用水浴超聲的4 倍，而延長(zhǎng)超聲探頭超聲時(shí)間并沒(méi)有提高提取效率，所以采用超聲探頭輔助萃取方法。

2.3.2 預(yù)濃縮過(guò)程優(yōu)化

2.3.2.1 萃取方法的優(yōu)化

圖1 萃取溶劑對(duì)萃取效率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvents on extraction efficiency

比較離子液體-分散液液微萃取法和CPE法對(duì)VK的預(yù)濃縮。為此，分別用100.0 μL離子液體和非離子表面活性劑、0.5 mL乙腈分散劑和10.0 mL含有100.0 ng/mL分析物的水相分析比較[C6MIm]NTf2、[C8MIm]NTf2、[C12MIm]NTf2、Triton X-114和Triton X-45的預(yù)濃縮效果。如圖1所示，3 種不同離子液體的離子液體-分散液液微萃取法的富集倍數(shù)都只有非離子表面活性劑CPE法的1/3，且CPE法使用的是非有毒試劑，所以本方法采用CPE法對(duì)VK進(jìn)行預(yù)濃縮處理，離子液體-分散液液微萃取法和CPE法的比較。

2.3.2.2 萃取溶劑的優(yōu)化

選擇Triton X-45、Triton X-114和Triton X-100為CPE的優(yōu)化萃取劑，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用100.0 μL的0.15 g/mL表面活性劑溶液，并將混合物在恒溫水浴中加熱并保持相應(yīng)的濁點(diǎn)溫度10 min，當(dāng)使用Triton X-100時(shí)，未獲得可收集的表面活性劑富集相，因此不選擇該萃取劑。如圖1所示，Triton X-45用作CPE的萃取劑時(shí)可獲得最高的萃取效率。

2.3.2.3 萃取變量的優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響CPE萃取效率的不同變量進(jìn)行優(yōu)化，如圖2所示，使用最低表面活性劑和水相體積可獲得最佳結(jié)果，使用50 μL的Triton X-45可最大程度地降低稀釋效果，同時(shí)在低表面活性劑濃度下，CPE的萃取效率也得到了保障，當(dāng)測(cè)定體積小于50 μL時(shí)，由于回收量太低導(dǎo)致收集富集相困難，所以選擇Triton X-45的體積為50 μL；當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)VK萃取效率最高；從實(shí)用性和時(shí)效性分析，用微波爐代替水浴加熱步驟可以縮短分析時(shí)間且更為方便[31]，因此通過(guò)在家用微波爐中將混合物加熱20 s（約50 ℃）以獲得濁點(diǎn)溫度；使用5 mL pH 3～9的0.01 mol/L緩沖溶液作為水相研究供體相pH值對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果表明VK的萃取效率在供體相pH值為7時(shí)達(dá)到最大值，pH值增加后稍有下降。值得注意的是，需要用30 μL甲醇稀釋回收得到的富集相（約15 μL），以降低進(jìn)樣溶液的黏度。綜上所述，可以通過(guò)快速、綠色且易于操作CPE萃取過(guò)程對(duì)VK進(jìn)行預(yù)濃縮。

圖2 萃取變量對(duì)CPE效率的影響Fig. 2 Effects of extraction parameters on the extraction efficiency of CPE

2.4 線性范圍、LOD和LOQ結(jié)果

應(yīng)用ANOVA方差分析，比較用乙醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和以空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線斜率，以檢查樣品基質(zhì)效應(yīng)的相關(guān)性。由于2 種維生素基質(zhì)斜率的差異顯著性P值均高于0.05，證實(shí)樣品沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)，可以使用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

對(duì)CPE結(jié)合LC-MS/MS方法的線性范圍、LOD、LOQ進(jìn)行研究。結(jié)果表明通過(guò)使用6 個(gè)質(zhì)量濃度水平的峰面積與分析物質(zhì)量濃度的最小二乘線性回歸分析得到PK和MK在1.0～500.0 ng/mL范圍內(nèi)的良好線性。在所有處理中，PK和MK校正曲線的線性相關(guān)系數(shù)均高于0.997 0，PK和MK的LOD和LOQ分別為1.0 ng/g和3.2 ng/g、0.8 ng/g和2.8 ng/g。

2.5 方法重復(fù)性和精密度結(jié)果

根據(jù)重復(fù)性要求，在同一天和不同日期分別測(cè)定10 次加標(biāo)量為100 ng/g白蘿卜樣品中PK和MK的重復(fù)性，以RSD計(jì)算。日內(nèi)和日間RSD分別為8.8%和9.2%（PK），5.1%和6.3%（MK），表明該方法的精密度良好。

富集因子定義為在萃取相中的分析物濃度與初始樣品中分析物的濃度之比。在CPE萃取條件下，PK和MK的富集因子分別為50、45，表明優(yōu)化的CPE方法可以對(duì)PK和MK進(jìn)行有效預(yù)濃縮。表3比較本實(shí)驗(yàn)方法與文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定蔬菜樣品中VK的方法，值得注意的是CPE方法首次用于VK的預(yù)濃縮，在靈敏度相當(dāng)?shù)那闆r下，與以前使用的常規(guī)樣品處理（例如SPE或微型化前處理DLLME和MSPD）方法相比，CPE具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，且避免使用有毒有機(jī)溶劑。綜上所述，超聲輔助提取-CPE與LC-MS/MS結(jié)合可用于蔬菜中天然VK的含量分析，最大程度地減少樣品處理量和有機(jī)溶劑的使用。

表3 蔬菜中VK分析方法的比較Table 3 Comparison of the developed method with other methods proposed for vitamin K analysis in vegetables

2.6 回收率和樣品含量分析

通過(guò)2 個(gè)不同類(lèi)型樣品（卷心萵苣和白蘿卜）進(jìn)行低、中、高3 個(gè)添加水平的回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為40、80 ng/g和120 ng/g，結(jié)果見(jiàn)表4，3 個(gè)水平的回收率證明從加標(biāo)樣品（白蘿卜和卷心萵苣）中提取VK方法的可靠性，其回收率在94.5%～106.2%之間，RSD在3.3%～8.3%之間（n=6），對(duì)于樣品中的VK能提取完全，說(shuō)明該方法回收率完全能滿足分析要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 加標(biāo)樣品VK回收率Table 4 Recoveries of spiked samples

表5 蔬菜樣品中的VK含量Table 5 Vitamin K contents in the analyzed vegetables

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和綠色蔬菜樣品（B）PK和MK總離子色譜圖及其離子豐度圖Fig. 3 Total ion current chromatograms (TIC) and ion abundance obtained for PK and MK standard mixed solutions (A) and green vegetables samples (B)

通過(guò)超聲輔助提取-CPE聯(lián)合LC-MS/MS方法對(duì)8 種不同蔬菜的PK和MK進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明卷心萵苣、上海青、菊苣、羽衣甘藍(lán)、菠菜和水芹菜的PK含量為96.2～1 704.5 ng/g（表5），白蘿卜和胡蘿卜樣品中VK含量低于其相應(yīng)的LOD，所有蔬菜樣品均未檢測(cè)到MK，表明綠葉蔬菜是VK的良好來(lái)源，而根莖類(lèi)蔬菜中VK含量極低，這與PK主要存在于綠葉蔬菜和植物油中，而MK主要存在于肉類(lèi)、乳制品和發(fā)酵食品中的報(bào)道一致[1,5]。如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)溶液中的MK和PK保留時(shí)間分別為7.31 min和8.98 min，相對(duì)離子豐度比分別為0.123 6和0.247 0，而樣品中的MK和PK的保留時(shí)間和相對(duì)離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，符合定性要求，證明樣品中所測(cè)的分析物確為目標(biāo)物。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立超聲輔助提取-CPE聯(lián)合LC-MS/MS測(cè)定蔬菜中2 種天然VK同系物（PK和MK）的檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法同時(shí)測(cè)定8 種常見(jiàn)蔬菜中天然VK同系物的含量。結(jié)果表明：該方法操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、處理樣品量少、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，該方法可同時(shí)測(cè)定PK和MK的含量，且具有回收率高、精密度和靈敏度好等特點(diǎn)。方法對(duì)卷心萵苣、上海青、菊苣、羽衣甘藍(lán)、菠菜、水芹菜、白蘿卜和胡蘿卜8 種蔬菜樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明蔬菜中僅含有PK，其中白蘿卜和胡蘿卜未檢測(cè)到PK，菠菜中含量最為豐富，達(dá)1 704.5 ng/g。綜上所述，方法應(yīng)用于日常檢測(cè)中可降低檢測(cè)成本，對(duì)環(huán)境友好，能滿足果蔬中天然VK的分析要求，可為政府行政監(jiān)督提供檢測(cè)技術(shù)支持，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。