白菜BcSOTs的序列特征及在害蟲脅迫下的表達模式分析

蔡九琦　郭二彪　余芳潔　施沁鈺　郁有健

摘 ?要：對白菜硫苷合成相關BcSOTs的序列結構及在害蟲取食脅迫下的表達模式進行綜合分析，解析其序列結構特征及在抵御害蟲脅迫過程中表達模式的異同，為利用基因工程技術調控植物體內硫苷組分和含量及培育高品質白菜品種提供理論依據(jù)。在白菜基因組數(shù)據(jù)庫中獲得硫苷合成相關的13個BcSOTs的DNA、CDS和氨基酸序列，利用GSDS、NPSA-prabi、Swiss-Pdb Viewer進行序列結構分析，利用PlantCARE對啟動子序列進行分析。以白菜‘綠野黑油筒為材料，利用熒光定量PCR的方法分析8葉期植株葉片中13個BcSOTs在甜菜夜蛾三齡幼蟲取食脅迫1、24、48、72 h后的表達模式。13個BcSOTs的核苷酸序列長度相似，除Bra015935的序列僅含有561個核苷酸且明顯短于其他12個基因以外，其余基因的序列長度為951～1107 bp;13個BcSOTs在蛋白二級結構上具有高度相似性，主要以α-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉角為主，其中11個（Bra008132、Bra015936、Bra015938、Bra003817、Bra027623、Bra003726、Bra003818、Bra027880、Bra031476、Bra027117、Bra025668）的二級結構中無規(guī)卷曲所占的比例最大，2個（Bra015935、Bra027118）α螺旋所占比例最高，除Bra015935、Bra003726外，其他成員所編碼蛋白的三級結構也都具有高度相似性;13個BcSOTs的啟動子序列中含有大量與逆境脅迫響應和生長發(fā)育相關的順式調控元件，Bra008132、Bra027117和Bra025668三個BcSOTs還分別含有與葉肉細胞分化響應、種子形態(tài)發(fā)育調控和細胞周期調控相關的一些元件;13個BcSOTs的表達量在白菜受到害蟲脅迫不同時間后均出現(xiàn)升高，其中3個BcSOTs（Bra015936、Bra027623、Bra003726）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其他10個BcSOTs隨著取食脅迫時間的延長表達模式變化的趨勢有所不同。白菜硫苷合成相關的13個BcSOTs在核苷酸和蛋白序列上具有高度保守性，在不同程度上參與了抵御害蟲脅迫的這一抗逆過程，Bra015936、Bra027623和Bra003726這3個成員在這一抗逆過程中可能起著更加重要的作用。研究結果將為進一步深入解析白菜硫苷合成關鍵SOT基因的生物學功能提供重要的數(shù)據(jù)支撐，進而為利用基因工程技術調控植物體內硫苷組分和含量以及高品質白菜育種奠定理論基礎。

關鍵詞：白菜;硫苷;磺基轉移酶;BcSOTs基因

中圖分類號：S31 ? ? ?文獻標識碼：A

Analysis of the Sequence Characteristics of BcSOTs and the Expression Pattern under Pests Stress in Brassica campestris

CAI Jiuqi1， GUO Erbiao2， YU Fangjie1， SHI Qinyu1， YU Youjian1*

1. College of Agriculture and Food Science， Zhejiang Agriculture and Forestry University / Zhejiang Provincial Key Laboratory of Agricultural Product Quality Improvement Technology / Biological Seed Research Center， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou， Zhejiang 311300， China; 2. College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030800， China

Abstract： This study comprehensively analyzed the sequence structure and expression patterns under insect eating stress of BcSOTs related to glucosinolate synthesis in Brassica campestris aimed to reveal the sequence structural characteristics and the similarities and differences in expression patterns during the resistance to pest stress and lay a theoretical foundation for the use of genetic engineering technology to regulate the glucosinolate composition and content in plants and to cultivate high quality varieties. The DNA， CDS and amino acid sequences of 13 BcSOTs related to the synthesis of glucosinolate were obtained from the genomic database of B. campestris. The sequence structure of the 13 BcSOTs was analyzed by GSDS， NPSA-prabi and Swiss-Pdb Viewer， and the promoter sequences were analyzed by PlantCARE. Using ‘lvyeheiyoutong as the material， the expression pattern of the 13 BcSOTs were analyzed by qRT-PCR in the leaves of the eighth-leaf stage plants after feeding by the third instar larvae of Spodoptera exigua at different time points （1， 24， 48， 72 h）. The nucleotide sequences of the 13 BcSOTs were similar in length， except that the sequence of Bra015935 contained only 561 nucleotides and was significantly shorter than that of the other 12 genes， and the sequence length of which was between 951 bp and 1107 bp. They were also highly similar in protein structure， which were mainly composed by alpha helix， random coil， extended strand and beta turn. Among them， Bra008132， Bra015936， Bra015938， Bra003817， Bra027623， Bra003726， Bra003818， Bra027880， Bra031476， Bra027117 and Bra025668 had the largest proportion of random coil， and alpha helixes had the highest proportion in Bra015935 and Bra027118. Except for Bra015935 and Bra003726， the tertiary structure of the proteins encoded by other members were also highly similar. The promoter sequences of the 13 BcSOTs contained a large number of cis-regulatory elements related to stress response and development. Three BcSOTs （Bra008132， Bra027117， and Bra025668） also contained cis-regulatory elements related to mesophyll cell differentiation， seed morphological development regulation， and cell cycle regulation. The expression level of the 13 BcSOTs increased after the plants were subjected to pest stress at different time points. The relative expression levels of 3 BcSOTs （Bra015936， Bra027623， Bra003726） had gradually increased with the increase of feeding time， and the expression patterns of the other 10 BcSOTs changed with the increase of insect stress. 13 BcSOTs related to glucosinolate synthesis in B. campestris were highly conserved in nucleotide and protein sequences. They all participated in the resistance process to pest to varying degrees in the leaves of B. campestris. Bra015936， Bra027623 and Bra003726 may play a more important role in this resistance process. The research results would provide important data for further analysis of the biological function of key SOT genes in the glucosinolate synthesis in B. campestris， and lay a theoretical foundation for the use of genetic engineering technology to regulate the content and composition of glucosinolates in plants and the breeding of high-quality varieties of B. campestris.

Keywords： Brassica campestris; glucosinolates; sulfotransferases; BcSOTs gene

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.007

白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）又名普通白菜、青菜、油菜，是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，含有豐富的營養(yǎng)物質，如各種礦物質、抗氧化物質和硫代葡萄糖苷等，是我國重要的傳統(tǒng)蔬菜[1-2]。植物在進化過程中為了適應各種生物和非生物脅迫，形成了各種應對脅迫的防御機制，產生了多種應對環(huán)境變化或脅迫的代謝產物[3]。硫代葡萄糖苷（glucosinolates， GS）簡稱硫苷，又稱芥子油苷，是十字花科植物中一類重要的次生代謝產物。硫苷的合成包括從氨基酸側鏈的延伸到醛肟的生成，再經過氧化、裂解和硫酸化等一系列復雜步驟，根據(jù)其側鏈氨基酸的來源不同，可分為三大類：脂肪族硫苷、芳香族硫苷及吲哚族硫苷，所有硫苷都具有由β-D-硫代葡萄糖基和磺酸肟形成的核心結構[4]。硫苷富含硫，其水解產物為蕓薹屬蔬菜的特殊風味做出重要貢獻[5];當十字花科植物組織受損時，芥子酶會水解硫苷產生各種具有不同生物活性的降解產物如異硫氰酸酯、腈類、硫氰酸鹽等，具有很多重要的生物活性[6]。蘿卜硫苷降解產生的蘿卜硫素，可有效誘導小鼠肝癌細胞II期解毒酶，同時顯著降低乳腺腫瘤的發(fā)生概率，減緩腫瘤的發(fā)生和擴散，具有很強的抗癌性[7];吲哚族硫苷降解產物的衍生物吲哚-3-甲醇可通過磷酸化p53蛋白的第15個絲氨酸使癌細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期和Fas死亡受體誘導細胞凋亡蛋白酶-8介導的細胞凋亡2條途徑產生較強的抗癌效應[8];此外，苯乙基異硫氰酸鹽目前被證明是肺癌癌細胞被激活的一種非常有效的抑制因子，并且已經被開發(fā)成了一種化學防癌劑[9]。因此，分析與白菜硫苷合成相關BcSOTs基因的序列結構及害蟲取食脅迫下的表達模式，對利用基因工程技術調控植物體內硫苷組分和含量以及培育高品質白菜具有重要意義?；腔D移酶（sulfotransferases， SOT）對于硫苷核心結構的形成具有重要作用，可催化共底物3?-磷酸腺苷-5?-磷酰硫酸上硫酸基團的轉移，從而將無硫硫苷轉化形成硫苷[10]。已有研究表明磺基轉移酶與抗病相關，在馬氏珠母貝中磺基轉移酶PmCHST9和PmCHST11編碼的蛋白通過磺酸化反應，合成硫酸軟骨素來調節(jié)馬氏珠母貝的免疫系統(tǒng)[11-12]。近幾年，在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，白葉枯病菌可以誘導磺基轉移酶的表達，并對所編碼蛋白的功能進行了一定的研究[13]。菜心在被小菜蛾取食脅迫后經轉錄測序發(fā)現(xiàn)，編碼磺基轉移酶的基因表達發(fā)生上調，說明編碼磺基轉移酶基因的表達受到昆蟲取食脅迫的誘導，可能參與了植物的抗蟲反應[14]。目前，在白菜中已經發(fā)現(xiàn)了13種硫苷合成相關的SOT蛋白，其中BcSOT16、BcSOT17和BcSOT18參與了無硫硫苷的硫化過程[15]。在競爭的情況下，AtSOT16更喜歡以由色氨酸和苯丙氨酸合成而來的dsGSs為催化底物，而由甲硫氨酸衍生而來的長鏈dsGSs是AtSOT17和AtSOT18的首選底物[16]。此外，通過對甘藍型油菜（Brassica napus L.）中的一些SOT蛋白進行研究，發(fā)現(xiàn)其催化功能具有底物特異性，且植株生理狀態(tài)會對它們的表達模式產生重要影響[17]。在白菜基因組進化過程中，與硫苷合成相關的SOT基因經過基因組三倍化后的大量復制、轉座和串聯(lián)重復等進化事件，最終產生和保留了13個成員，一些研究人員此前也對BcSOTs的序列、染色體定位和進化進行了初步的研究，但是對其序列結構和生物逆境脅迫下的表達模式尚無深入的分析和研究[15， 18]。針對白菜中硫苷合成相關的13個SOT基因，采用GSDS、NPSA-prabi、Swiss-Pdb Viewer、PlantCARE深入分析其基因序列、結構、啟動子元件，采用熒光定量解析BcSOTs在小白菜響應害蟲脅迫過程中的表達模式。研究結果能夠為深入解析白菜硫苷合成相關SOT基因的生物學功能提供重要的數(shù)據(jù)支撐，從而為利用基因工程技術調控植物體內硫苷組分和含量以及培育高品質小白菜品種奠定理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?植物材料和培養(yǎng)條件

試驗所用白菜品種為‘綠野黑油筒，購自寧波市江東綠野蔬菜種子有限公司，甜菜夜蛾三齡幼蟲由浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院植物保護學科劉亞慧課題組提供。將白菜置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為14 h/10 h（光照/黑暗），培養(yǎng)溫度為28 ℃/26 ℃（白天/黑夜），光照強度為200 ?mol/（m2·s）。害蟲取食脅迫下葉片中硫苷代謝相關BcSOTs的表達分析所用材料的取樣方法為：選取長勢一致的八葉期植株進行接蟲處理，先將甜菜夜蛾三齡幼蟲饑餓處理4 h，選取第5、6片真葉進行接蟲，每片葉接蟲1頭，用網袋將葉片套住，利用棉花塞住袋口防止蟲逃逸，整個接蟲過程防止植株損傷，對照株做同樣的套袋處理，培養(yǎng)條件相同;分別在接蟲后1、24、48、72 h進行取樣，每個時間點隨機選取3株植株取食后的葉片作為1次生物學重復，用酒精棉將接蟲后的葉片擦拭干凈，去除主脈后剪碎，液氮中速凍，于–80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?白菜硫苷合成相關BcSOTs序列特征分析

根據(jù)Wang等[15]的研究結果，從白菜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/BRDA）中獲得白菜硫苷合成相關的13個BcSOTs的DNA、CDS和氨基酸序列，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku. edu.cn/index.php）分析內含子和外顯子的結構與相位，采用NPSA-MLRC（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat. pl？page=/NPSA/npsa_mlrc. html）、Swiss-PdbViewer（https：//swissmodel.expasy. org/）預測蛋白二級結構和三級結構。

1.3 ?白菜硫苷合成相關BcSOTs啟動子序列分析

根據(jù)13個白菜硫苷合成相關BcSOTs的編碼序列，從白菜數(shù)據(jù)庫BRAD中獲得各BcSOTs編碼序列的起始密碼子（ATG）上游2 kb的核苷酸序列作為啟動子序列，利用PlantCare軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其所含有的順式作用元件進行預測和分析。

1.4 ?白菜硫苷合成相關BcSOTs的表達分析

采用Trizol法提取各材料總RNA，參照反轉錄試劑盒（SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit， TaKaRa）的說明書進行RNA反轉錄。以反轉錄獲得的cDNA為模板，根據(jù)基因CDS序列的非保守區(qū)，利用Primer Premier 5軟件設計基因特異的qRT- PCR引物（表1），以白菜BrUBC10基因作為內參基因，采用定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq， TaKaRa）在CFX96 Real Time System（Bio-Rad， France）儀器上進行qRT-PCR分析。擴增體系為：10 μL 2×SYBR Premix Ex-TaqTM，3 μL cDNA（10 ng/μL），上下游引物各0.3 μL，補足ddH2O至15 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s;60 ℃復性34 s;共40個循環(huán)。按照2–ΔΔCT 的方法進行定量數(shù)據(jù)的處理[19]，瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物。

2 ?結果與分析

2.1 ?白菜硫苷合成相關SOT基因序列特征分析

基因結構分析表明（圖1），13個白菜硫苷合成相關SOT基因都具有非常相似的基因結構，除了Bra003726在89 bp處有一個122 bp長度的內含子和Bra003817在472 bp處有一段75 bp的內含子外，其余11個基因都沒有內含子。Bra015935的序列僅含有561個核苷酸，明顯短于其他12個基因的序列長度，其余基因的序列長度為951～1107 bp。

由表2可知，13個白菜硫苷合成相關SOT的二級結構主要以α-螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉角為主，而且各組成部分所占的比例也具有一定相似性，其中11個基因（Bra008132 、Bra015936、Bra015938、Bra003817、Bra027623、Bra003726、Bra003818、Bra027880、Bra031476、Bra027117、Bra025668）二級結構組成中以無規(guī)卷曲占比最高，2個基因（Bra015935、Bra027118）的二級結構組成中以α-螺旋占比最高;除Bra015935、Bra003726外，其他成員所編碼蛋白的三級結構都具有高度相似性（圖2）。

2.2 ?白菜硫苷合成相關SOT基因啟動子順式作用元件分析

利用在線數(shù)據(jù)分析工具PlantCARE對13個硫苷合成相關SOT基因的啟動子序列進行分析，結果表明在這13個基因的上游2 kb序列中，與生長發(fā)育調控響應相關的順式作用元件主要涉及分生組織的發(fā)育、胚乳發(fā)育、生理周期調控和蛋白質代謝等方面;與逆境脅迫響應相關的順式作用元件種類較多，包含高低溫脅迫、干旱脅迫、厭氧誘導和機械損傷脅迫等;存在生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯等多種植物激素響應相關的順式作用元件。進一步對這些順式作用元件的種類與數(shù)量進行分析表明，在13個硫苷合成相關SOT基因的啟動子序列中，與逆境脅迫響應相關的順式作用元件要明顯多于與生長發(fā)育調控響應相關的順式作用元件。此外，Bra008132、Bra027117和Bra025668三個BcSOTs還分別含有與葉肉細胞分化響應、種子形態(tài)發(fā)育調控和細胞周期調控相關的一些元件（表3，表4）。

2.3 ?害蟲脅迫后白菜硫苷合成相關SOT基因的表達分析

為明確白菜硫苷合成相關的SOT基因在白菜抵御害蟲脅迫過程中的功能，本研究進一步利用qRT-PCR技術對甜菜夜蛾取食不同時間（1、24、48、72 h）后葉片中BcSOTs的相對表達量進行了分析，結果表明在受到取食脅迫后BcSOTs出現(xiàn)明顯的差異表達，但是隨著取食脅迫時間的延長，它們表達水平變化的趨勢有所不同（圖3），主要可以分為5類，其中：

A類：3個BcSOTs（Bra015936、Bra027623、Bra003726）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢;B類：4個BcSOTs（Bra015935、Bra015938、Bra027118、Bra025668）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;C類：1個BcSOT（Bra003817）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;D類：2個BcSOTs（Bra031476、Bra027117）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢;E類：2個BcSOTs（Bra008132、Bra027880）的相對表達量隨著取食時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。

此外，在害蟲取食脅迫時間延長后，除了Bra027118、Bra015938和Bra027880在甜菜夜蛾取食72 h后的相對表達量低于對照外，其他基因的相對表達量都高于對照。

3 ?討論

白菜在進化過程中，與硫苷合成相關的SOT基因產生了大量的復制和串聯(lián)重復等事件，共含有多達13個BcSOTs[15]。本研究對白菜硫苷合成相關SOT進行序列結構分析發(fā)現(xiàn)，除了Bra003817和Bra003726含有內含子外，其余的SOT基因都沒有內含子，Dantas-Santos等[20]和Hashiguchi等[21]也發(fā)現(xiàn)擬南芥和海藻中與硫苷合成相關的SOT基因中沒有內含子，因此一般情況下與硫苷合成相關的SOT基因可能不含有內含子，而Bra003817和Bra003726含有內含子可能與白菜進化有關，更有利于白菜對抗病蟲的傷害。二級結構與三級結構分析表明白菜硫苷合成相關的SOT蛋白在結構上相似性較高，只有Bra015935二級結構中的無規(guī)卷曲明顯少于其他成員。Bra015935和Bra003726的三級結構也與其他成員有很大不同，說明Bra015935和Bra003726

可能在白菜發(fā)育過程中的硫苷代謝中具有與其他成員不同的生物學功能。值得注意的是Bra015935的序列顯著短于其他成員，且蛋白三級結構也有很大差異，因此該基因是否還具有磺基轉移酶的完整功能、在進化過程中是否產生了新功能化或亞功能化，這些都需要進一步對其生物學功能進行深入研究。

Castillo-davis等[22]研究表明大部分蛋白在親緣關系較遠的物種間仍然存在明顯的保守性，因此其調控序列可能在高等多細胞生物的形態(tài)多樣性的形成中起到非常重要的作用。分析功能基因啟動子序列中順式調控元件的組成及差異，對于研究功能基因在植物受害蟲脅迫后所扮演的角色具有重要意義。本研究對白菜硫苷合成相關SOT基因的啟動子序列分析表明，絕大多數(shù)SOT基因的啟動子序列中與脅迫相關的順式作用元件均多于與發(fā)育相關的順式作用元件，說明其可能在白菜不同發(fā)育時期中更多地參與硫苷介導的一些抵御逆境脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。此外，Bra008132啟動子序列中還包含了與葉肉細胞分化相關的元件，因此可能在葉片受到脅迫時會表現(xiàn)出不同于其他基因的響應模式;Bra027117還包含與種子形態(tài)發(fā)育相關的調控元件，該基因的表達異?？赡軙绊懛N子的形態(tài)與正常發(fā)育過程;Bra025668還包含與細胞周期相關的元件，可能會受到參與細胞周期調控的一系列蛋白的調控。

甜菜夜蛾屬鱗翅目夜蛾科，是一種雜食性害蟲，以幼蟲取食葉片或鉆蛀大白菜菜心等方式危害白菜類蔬菜作物的栽培與生產，是十字花科蔬菜作物的重要害蟲之一[23]。研究表明，擬南芥在被甜菜夜蛾取食后，能夠引起其自身吲哚族硫苷和脂肪族硫苷含量的上升[24]。本研究對8葉期的白菜進行甜菜夜蛾接蟲處理，對處理后葉片中硫苷合成相關SOT基因的表達模式分析表明，盡管取食脅迫不同時間后的表達量升高的程度有所不同，但表達模式均出現(xiàn)顯著升高的趨勢，說明BcSOTs在抵御甜菜夜蛾幼蟲的取食脅迫中起到了重要作用。Bra008132、Bra003817、Bra027880等7個BcSOTs在害蟲取食脅迫1 h后表達含量明顯高于對照，說明它們的表達受到了白菜響應甜菜夜蛾取食脅迫的調控因子的應激調控，在很短的時間內表達模式出現(xiàn)顯著升高以盡快提高相應硫苷的合成速率來抵御該生物脅迫。Bra031476、Bra025668和Bra003726分別只在取食脅迫24、48、72 h后呈顯著性表達來抵御生物脅迫，說明白菜硫苷合成相關SOT基因的表達具有時序性和一定的專一性，這可能是由于白菜特有的生理及防御機制決定的，也可能與茉莉酸、水楊酸等抵御環(huán)境生物脅迫相關植物激素的不同調控機制有關。

BcSOTs在核苷酸和蛋白序列上具有高度保守性，qRT-PCR分析結果表明BcSOTs在不同程度上參與了白菜抵御害蟲脅迫的這一抗逆過程，Bra015936、Bra027623和Bra003726這3個成員在這一抗逆過程中起著相對更加重要的作用。研究結果將為進一步深入解析白菜硫苷合成關鍵SOT基因的生物學功能提供重要的數(shù)據(jù)支撐，進而為利用基因工程技術調控植物體內硫苷組分和含量以及高品質白菜育種奠定理論基礎。

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責任編輯：謝龍蓮

收稿日期 ?2020-05-19;修回日期 ?2020-06-18

基金項目 ?國家自然科學基金面上項目（No. 31572115）;浙江省自然科學基金重點項目（No. LZ14C150001）;浙江農林大學大學生科研訓練項目（No. 113-2013200098）。

作者簡介 ?蔡九琦（1999—），男，本科生，研究方向：植物品質調控與分子生物學。*通信作者（Corresponding author）：郁有健（YU Youjian），E-mail：yjyu@zafu.edu.cn。