五指毛桃轉(zhuǎn)錄組及黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵基因分析

陳榮珠　李珍　林美珍　王小平　賴鐘雄

摘 ?要：五指毛桃含有香豆素類、黃酮類等化學(xué)成分，具有抗炎、抑菌、抗病毒和腫瘤的藥用價(jià)值。但是，其轉(zhuǎn)錄組和功能基因組等分子水平的研究較少報(bào)道。本研究首次采用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)五指毛桃的根、莖和葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得104 335條unigenes，平均長(zhǎng)度為578 bp，有62 142條unigenes被注釋到Nr、GO、Swiss-Prot、KEGG和KOG等數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)五指毛桃與川桑的同源性最高。通過比較五指毛桃不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_Leaf分別有1363、624和1006個(gè)差異表達(dá)的基因在KEGG途徑顯著富集，主要富集在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物MAPK信號(hào)通路、黃酮類生物合成等代謝途徑。進(jìn)一步分析參與植物黃酮類生物合成途徑中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)有16個(gè)差異表達(dá)的基因參與該代謝途徑，主要在葉和莖中高表達(dá)，運(yùn)用RT-qPCR對(duì)黃酮類化合物生物合成途徑中9個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)定量結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，大部分基因都在五指毛桃莖和葉片中高表達(dá)，因此五指毛桃幼苗黃酮類化合物主要積累在葉片和莖中，這與民間主要以根莖作為藥用部位存在差異，主要原因可能是與五指毛桃生長(zhǎng)年齡有關(guān)。以上的研究結(jié)果為五指毛桃分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)，并為其活性成分的生物合成調(diào)控、栽培技術(shù)等提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：五指毛桃;RNA-seq;黃酮;生物合成;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S567.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Transcriptome Analysis of Ficus hirta Vahl and Expression Profiling of Key Genes Involved in Flavonoid Biosynthesis

CHEN Rongzhu1， LI Zhen1， LIN Meizhen1， WANG Xiaoping1*， LAI Zhongxiong2*

1. Department of Pharmacy， Zhangzhou Health Vocational College， Zhangzhou， Fujian 363000， China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Ficus hirta Vahl contains coumarins， flavonoids and other chemical components， which have anti-inflammatory， bacteriostatic， antiviral and tumor medicinal value. However， the molecular research such as transcriptome and functional genome have less studied. Transcriptome sequencing was performed for the first time on different tissues of F. hirta Vahl using the RNA-seq high-throughput sequencing technique， and the result showed that a total of 10 4335 unigenes were obtained and 62 142 unigenes were annotated to the database of Nr， GO， Swiss-Prot， KEGG and KOG et al. F. hirta Vahl had the highest homology with Morus notabilis， according to the homologous sequence alignment. Comparative transcriptome analysis of different tissues of F. hirta Vahl showed that a total of 1363， 624 and 1006 genes were differentially expressed in the pairwise comparisons of Leaf_vs_Root， Root_vs_Stem and Stem_vs_Leaf， respectively. Among them， plant signal transduction， MAPK signal pathway-plant， and flavonoid biosynthesis related genes were significantly enriched， especially flavonoid biosynthesis pathway. Further analysis of differentially expressed genes involved in flavonoid biosynthesis showed that there were 16 differentially expressed genes involved in the pathway， which were mainly highly expressed in leaves and stems. The expression levels of key genes involved in flavonoid biosynthesis were verified by RT-qPCR， and the results were consistent with those of transcriptome sequencing. Therefore， flavonoids were mainly accumulated in the leaves and stems from young F. hirta Vahl. The above research results could lay a foundation for the research of molecular biology of F. hirta Vahl， and provide reference for the active component biosynthesis regulation and cultivation techniques.

Keywords： Ficus hirta Vahl; transcriptome high-throughput sequencing; flavonoid; biosynthesis; RT-qPCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.008

五指毛桃為?？崎艑僦参锎秩~榕（Ficus hirta Vahl），其掌狀葉形如五根手指，果實(shí)狀如毛桃，因此被稱為五指毛桃，又因其根皮具有牛奶的清香，所以又有“五指牛奶”的美稱，有文獻(xiàn)報(bào)道同屬植物極簡(jiǎn)榕（Ficus simplissima Lour.）的干燥根也作為五指毛桃，是嶺南地區(qū)習(xí)用中草藥[1]。五指毛桃為地道的民族用藥，廣東、廣西、福建、湖南、云南等?。▍^(qū)）14個(gè)少數(shù)民族均有用藥記載，目前產(chǎn)區(qū)主要為廣西、廣東等地，以野生供應(yīng)市場(chǎng)需求，其用藥部位為根莖。中醫(yī)認(rèn)為，五指毛桃性平、味甘、辛，對(duì)脾虛浮腫、肺癆咳嗽、食少無力、風(fēng)濕痹痛、盜汗、產(chǎn)后無乳等癥有很好的療效[2]。目前已從五指毛桃中鑒定出多種化學(xué)成分，如香豆素類、黃酮類、甾醇類等[3-5]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用[6-7]，同時(shí)還能提高機(jī)體的免疫能力[8-9];通過對(duì)其揮發(fā)油類化合物進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)十六酸、油酸、亞油酸等為其主要含有的揮發(fā)油類成分[10]。黃酮類化合物是一種重要的天然有機(jī)化合物，具有抗氧化、抗癌癥、抗腫瘤以及提高機(jī)體免疫機(jī)能等方面的功效，其為五指毛桃活性物質(zhì)中數(shù)量最多的一類，如芹菜素、橙皮苷、甲氧基黃酮[11-12]、牡荊苷[13]、柚皮素[3]、槲皮素、金合歡素[4]等，具有較高的研究和藥用價(jià)值。

隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，不僅在模式植物及重要的農(nóng)作物上具有普遍的運(yùn)用，近幾年也在藥用植物上得到了廣泛的運(yùn)用[14]。該技術(shù)可在缺少參考基因組情況下全面分析某一物種的轉(zhuǎn)錄水平，從而確定轉(zhuǎn)錄本及其核酸序列，為理解物種的生物學(xué)及生物化學(xué)等方面提供技術(shù)手段[15]。目前，國內(nèi)外在西洋參[16]、甘草[17]、丹參[18]、金線蓮[19]、半枝蓮[20]、穿心蓮[21]等藥用植物開展轉(zhuǎn)錄組研究，從中挖掘和分離出了大量與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因。目前，關(guān)于五指毛桃的研究主要集中在生物學(xué)特征、活性成分的測(cè)定、藥理作用及栽培種植等方面，然而，五指毛桃的轉(zhuǎn)錄組和功能基因組等分子水平上的研究較少報(bào)道。本研究利用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序平臺(tái)對(duì)五指毛桃的根、莖和葉進(jìn)行了大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，闡述了五指毛桃不同組織部位的生物學(xué)過程和代謝調(diào)節(jié)相關(guān)途徑及基因表達(dá)的變化，重點(diǎn)分析了黃酮類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)特性，以期為五指毛桃活性成分的生物合成與調(diào)控等分子機(jī)制的研究及次生代謝工程的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

野外采集五指毛桃種子，植株特征為：灌木，嫩枝中空，小枝、葉、果實(shí)均被金黃色長(zhǎng)硬毛，有乳汁。葉片通常掌狀分裂;瘦果橢圓形。植株經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院李珍講師鑒定為粗葉榕（Ficus hirta Vahl）。種子委托廣西新眾農(nóng)業(yè)有限公司育苗，得到2月齡五指毛桃小苗。將植株的根、莖、葉分開采集后迅速置于液氮中凍存，然后保存于?80 ℃冰箱用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取 ?采用Trizol（Invitrogen， CA， USA）試劑盒進(jìn)行樣品總RNA的提取，并用DNase I（Takara Bio， Japan）消化基因組中的DNA。總RNA的濃度和質(zhì)量分別用安捷倫2100型（Agilent Technologies， USA）生物分析儀測(cè)定，并用瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估總RNA的完整性。選取質(zhì)量、濃度和完整性符合要求的總RNA用于后續(xù)cDNA文庫的構(gòu)建。

1.2.2 ?cDNA文庫的構(gòu)建和高通量測(cè)序 ?首先將帶有Oligo dT（Qiagen， China）磁珠與mRNA完全結(jié)合，純化mRNA，然后加入打斷劑（Frag/Rrime buffer），用移液槍反復(fù)吸打混勻后置于PCR儀中進(jìn)行mRNA片段化。以該片段為模板，用隨機(jī)六聚體引物和SuperScript III（Qiagen， China）逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，然后以第一鏈cDNA為模板，RNase H和DNA聚合酶I（Qiagen， China）進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。用QIAquick PCR提取試劑盒（Qiagen， China）將雙鏈cDNA純化及末端修復(fù)/dA尾添加，接著用T4連接酶進(jìn)行接頭連接，然后將連接產(chǎn)物純化、片段大小分選和文庫擴(kuò)增。用凝膠電泳、安捷倫2100型（Agilent Technologies， USA）生物分析儀和定量PCR儀（T100? Thermal Cycler， BIO-RAD）檢測(cè)所構(gòu)建的文庫質(zhì)量，最后，用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序平臺(tái)對(duì)合格的文庫進(jìn)行RNA-seq，以獲得原始數(shù)據(jù)（Raw reads），該高通量測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3 ?質(zhì)量控制與De novo組裝 ?將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進(jìn)行質(zhì)量控制，去除接頭序列、低質(zhì)堿基（Q值<20）、含量超過10%的N堿基的序列，獲得高質(zhì)量的Clean reads。使用Trinity程序?qū)lean數(shù)據(jù)De novo組裝成轉(zhuǎn)錄本，對(duì)拼接獲得的轉(zhuǎn)錄本去除冗余，取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本聚類最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，用于后續(xù)的分析。

1.2.4 ?Unigene功能注釋 ?將獲得的unigene用NCBI Blastx后比對(duì)到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Nr、KOG、Swiss-Prot、TrEMBL、CDD、PFAM和KEGG（E-value≤0.00001），獲得與序列相似度最高的蛋白質(zhì)進(jìn)行五指毛桃unigene的功能注釋。用topGO進(jìn)行GO注釋和分類[22]，并將unigene用NCBI Blastx后與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得與五指毛桃相近的物種以及同源序列的功能信息。

1.2.5 ?差異表達(dá)基因的篩選和GO和KEGG富集分析 ?利用RSEM（RNA-seq by Expectation Maximization）法計(jì)算基因的表達(dá)量，并用TPM

（Transcripts Per Million）方法對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。再采用DEseq進(jìn)行差異分析，并對(duì)統(tǒng)計(jì)得到P值進(jìn)行FDR矯正獲得q值，為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設(shè)為q<0.005且差異倍數(shù)|FoldChange|>2。分別使用topGO（http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html）和clusterProfiler（http：//www. bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clus?te?r-Profiler.html）進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析，且認(rèn)為P<0.05為顯著富集。

1.2.6 ?五指毛桃unigene SSR和SNP/InDel分析 ?使用MISA（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/ misa/）對(duì)五指毛桃根、莖和葉基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR檢測(cè)，找出SSR標(biāo)記之后，使用Primer3完成SSR引物設(shè)計(jì)，參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)。使用BCFtools（http：//www.htslib.org/doc/bcftools.html）進(jìn)行SNP/InDel calling，抽提各樣本中的SNP/InDel。并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量值大于20、覆蓋度大于8的過濾。

1.2.7 ?黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵基因的RT- qPCR驗(yàn)證 ?為了進(jìn)行黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵基因的RT-qPCR驗(yàn)證，從五指毛桃根、莖、葉的每個(gè)樣品中提取總RNA 500 ng，利用SYBR Ex Script?試劑盒（TaKaRa， China），用隨機(jī)引物和Oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR引物參照引物設(shè)計(jì)原則，利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），引物送北京六合華大科技有限公司合成。RT-qPCR操作方法按照試劑盒（TaKaRa， China）操作說明進(jìn)行，參照同屬植物桑樹的相關(guān)研究以ACT3為內(nèi)參基因[23]，通過羅氏Light Cyclers熒光定量PCR儀進(jìn)行，采用RT-qPCR檢測(cè)9個(gè)關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量，并用2?ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算，利用Graphpad Prism軟件作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析和De novo組裝

利用RNA-seq技術(shù)對(duì)五指毛桃的根、莖、葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共生成138 712 412個(gè)高質(zhì)量reads，Q20堿基百分比（測(cè)序錯(cuò)誤率小于1%）分布介于98.58%～98.63%之間，Q30堿基百分比分布（測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.1%）介于94.92%～95.05%之間，GC堿基含量介于47.89%～49.17%之間（表2）。質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明五指毛桃的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。使用Trinity將高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行De novo組裝成轉(zhuǎn)錄本，重新組裝成104 335條unigenes，平均長(zhǎng)度為578 bp，其中N50長(zhǎng)度為1025 bp，unigene序列長(zhǎng)度分布見圖1，這些獲得的轉(zhuǎn)錄本可作為五指毛桃參考的轉(zhuǎn)錄本。

2.2 ?五指毛桃unigene的注釋分析

將獲得的unigene用NCBI Blastx后比對(duì)到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫CDD、KOG、Nr、Swiss-Prot和KEGG等9個(gè)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)比對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫的序列同源性結(jié)果可知（表3），至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigene有62142條，占59.56%，其中與GO數(shù)據(jù)庫匹配的unigene數(shù)目最多為51552條，占總數(shù)的49.41%;其次為Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（49 172個(gè)），占47.13%;在所比對(duì)數(shù)據(jù)庫中都有注釋的unigene數(shù)目為2397條，占2.21%。為了研究五指毛桃轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的近似情況和同源序列的功能信息，將序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析unigene數(shù)據(jù)的物種分布，得到各序列之間的最佳匹配結(jié)果如圖2所示。不同物種在不同水平上與五指毛桃unigene序列存在相似，其中與川桑（Morus notabilis）表現(xiàn)出明顯的相似性，達(dá)到16.23%;其次是小麥（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）和棗（Ziziphus jujuba），相似性分別為2.67%和2.44%，與軟克里藻（Klebsormidium flaccidum）和膠球藻C-169（Coccomyxa subellipsoidea C-169）相似性分別為1.53%和0.93%。

對(duì)五指毛桃轉(zhuǎn)錄本的潛在功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分類，將所有轉(zhuǎn)錄本與KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如圖3所示，35661條轉(zhuǎn)錄本被分成26個(gè)KOG群，其中翻譯-核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生基因數(shù)目最多，為4840個(gè)，占4.64%;其次是翻譯后修飾-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換-分子伴侶為3669個(gè)，占3.52%;一般功能預(yù)測(cè)類有3633個(gè)，占3.48%;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有3428個(gè)，占3.29%。同時(shí)，有1262個(gè)（1.21%）轉(zhuǎn)錄本參與次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝。

基于GO分析，對(duì)所有unigene的潛在功能進(jìn)行分類，如圖4所示，共獲得404727條GO注釋信息，其中，在生物過程中，可將五指毛桃unigene分成26類，參與細(xì)胞過程的數(shù)量最多，為34056個(gè)，其次是代謝過程為30357個(gè);在分子功能方面，五指毛桃的unigene被分成19類，參與結(jié)合和剪切活性的個(gè)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他，分別為29343和27867個(gè);在細(xì)胞組分上，五指毛桃的unigene可被分成22類，參與細(xì)胞的數(shù)目最多，為38314個(gè)。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析五指毛桃unigene可能參與的生物化學(xué)途徑，結(jié)果如圖5所示。總共有7744條unigene被注釋到285個(gè)KEGG途徑中，又可細(xì)分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、基因信息處理、代謝、生物系統(tǒng)，其中運(yùn)輸和分解代謝（289個(gè)）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（501個(gè)）、翻譯（799個(gè)）、碳水化合物代謝（436個(gè)）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（187個(gè)）是每個(gè)分類中參與基因個(gè)數(shù)最多的。

2.3 ?五指毛桃根、莖、葉差異表達(dá)基因的分析

通過篩選，共獲得27382個(gè)差異表達(dá)的基因，占總基因數(shù)的26.24%。用DESeq法對(duì)五指毛桃根、莖、葉3個(gè)樣品進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)Leaf_vs_Root之間差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)最多為11755個(gè)，9550個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，2205個(gè)基因下調(diào)表達(dá);而Root_vs_Stem之間差異表達(dá)基因數(shù)目最少為5559個(gè)（圖6）。

將差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_ Leaf分別有1363、624和1006個(gè)差異表達(dá)的基因在KEGG途徑中顯著富集，其中Leaf_vs_Root相比富集差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)較多的是核糖體（135個(gè)）、碳代謝（81個(gè)）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（56個(gè)）;Root_vs_Stem相比，核糖體（73個(gè)）、碳代謝（36個(gè)）是富集差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)較多的通路;Stem_vs_Leaf相比，富集差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)較多的是碳代謝（60個(gè)）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（53個(gè)）、淀粉和蔗糖代謝（40個(gè)）。分析各組分間具有顯著差異的通路，發(fā)現(xiàn)Leaf_vs_Root、Root_vs_Stem、Stem_vs_Leaf分別有21、21和22條具有顯著富集的通路，其中植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、植物MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-plant）、黃酮類生物合成（flavonoid biosynthesis）為3組兩兩比較均共有顯著富集的通路，而黃酮類生物合成代謝通路中差異基因的改變最為明顯。

黃酮類生物合成通路是直接與次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物具有直接關(guān)系，分析后共獲得與該代謝通路中相關(guān)基因個(gè)數(shù)為16個(gè)基因顯著性差異表達(dá)，涉及到10種酶，分別為二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase， DFR）、查爾酮合成酶（chalcone synthase， CHS）、反式肉桂酸4-單加氧酶（trans-cinnamate 4-monoox?ygenase， C4H）、查爾酮/查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase、Chalcone-flavanone isomerase， CHI）、莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimate hydroxycinnamoyltransferase， HST）、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA O-methyltrans?ferase， CCOMT）、黃酮類3-單加氧酶（flavonoid 3-monooxygenase， F3H）、百花色素雙加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase， LDOX）、乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acetyltransferase， AAT）、細(xì)胞色素P450（cytochrome P450 family protein， CYP），各類酶對(duì)應(yīng)基因在五指毛桃根、莖、葉中的TPM值及相關(guān)詳細(xì)信息見表4。通過對(duì)這些參與黃酮類生物合成途徑中相關(guān)基因在五指毛桃根、莖、葉的TPM值的分析可知，8個(gè)基因在葉片中有最高的TPM值，7個(gè)基因在莖中有最高的TPM值，只有1個(gè)基因在根中有最高的TPM值。

2.4 ?五指毛桃根、莖、葉基因轉(zhuǎn)錄本的SSR和SNP/InDel分析

通過五指毛桃根、莖、葉的基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR分析，結(jié)果表明共有26 520條unigene有SSR位點(diǎn)分布。單堿基重復(fù)和雙堿基重復(fù)是SSR的主要類型（圖7），分別占50.29%和31.46%，A/T和AT/AG分別為單核苷酸和二核苷酸的主要重復(fù)類型。

通過五指毛桃根、莖、葉的基因轉(zhuǎn)錄本SNP/InDel分析發(fā)現(xiàn)，其根、莖葉基因轉(zhuǎn)錄本SNP分別為47 051、60 922和70 272個(gè)，發(fā)生InDel事件分別為8665、10 046和10 123個(gè)，其中SNP的主要類型為C->T/G->A/A->G轉(zhuǎn)換（圖7）。

2.5 ?五指毛桃黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵基因RT-qPCR分析

對(duì)黃酮類化合物生物合成中9個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-qPCR，以根為參照樣品，莖和葉中各基因的相對(duì)表達(dá)量見圖8。這9個(gè)關(guān)鍵基因在根、莖

和葉中的相對(duì)表達(dá)量與RNA-seq數(shù)據(jù)中TPM值的變化趨勢(shì)基本一致，其中DFR、CHS、CHI、F3'H和AAT在五指毛桃的葉中有最高的相對(duì)表達(dá)量，C4H、HST和LDOX在莖中有最高的相對(duì)表達(dá)量，而CCOMT在根中有最高的相對(duì)表達(dá)量。

3 ?討論

本研究首次利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)五指毛桃的根、莖和葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得104335條unigenes，這些unigenes平均長(zhǎng)度為578 bp，N50平均長(zhǎng)度為1025 bp，Q20、Q30堿基百分比均大于94%，在GO、Siss-Prot、TrEMBL、Nr等4個(gè)數(shù)據(jù)庫中均有大量unigenes被注釋，說明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，為五指毛桃有效成分生物合成及育種等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

黃酮類化合物是植物體內(nèi)一類重要的次生代謝產(chǎn)物，大多與糖類結(jié)合形成糖苷。黃酮類具有多種多樣的生物學(xué)功能，能調(diào)節(jié)果實(shí)風(fēng)味、改變花果色澤等，還可作為一種重要的抗逆性物質(zhì)，能夠提高植物抗性[24-26]。同時(shí)，黃酮類化合物對(duì)人體健康還具有重要的生理功能，其可清除人體自由基，在抑菌、降血脂、消炎、抗病毒、抗癌等方面具有重要的作用[27-28]。藥用植物黃酮類化合物含量與其種植環(huán)境和種植時(shí)間均具有密切的關(guān)系，對(duì)金線蓮根、莖、葉中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)葉的總黃酮含量占全草的總黃酮含量80%以上，而莖和根約各占不到10%，對(duì)組織培養(yǎng)、種植1個(gè)月和種植4個(gè)月的金線蓮新鮮葉片的黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分含量隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并對(duì)黃酮類生物合成通路中的6個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量在種植4個(gè)月的金線蓮葉片中最高[19];不同光質(zhì)對(duì)植物中黃酮類化合物含量也有影響，藍(lán)光能夠促進(jìn)大豆芽苗菜、青錢柳葉（Cyclocarya paliurus）中黃酮的合成[29-30]。

CHS是黃酮類化合物合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶，在該酶的作用下形成查爾酮，查爾酮能夠通過進(jìn)一步衍生形成各類黃酮類化合物[31]，研究表明CHS的表達(dá)與否直接與植物黃酮類化合物含量多少有關(guān)[32]。CHI是黃酮類化合物代謝途徑中的第2個(gè)關(guān)鍵酶，該酶是植物中查爾酮轉(zhuǎn)化成黃烷酮必須的酶[33];劉長(zhǎng)英等[34]克隆獲得了桑樹（Morus alba L.）查耳酮異構(gòu)酶基因（MaCHI）全長(zhǎng)序列，采用RT-qPCR法分析MaCHI在不同組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片和果中的表達(dá)量較高，在根中表達(dá)量較低。F3H屬于細(xì)胞色素P450類，是黃酮類化合物代謝途徑上的關(guān)鍵酶，能調(diào)控黃酮類化合物合成途徑中的代謝流向，它催化生成二氫黃酮醇，而二氫黃酮醇是黃酮類化合物生物合成中生成黃酮、花色素和異黃酮等黃酮類化合物的重要中間產(chǎn)物[35]。二氫黃酮醇4-還原酶DFR是黃酮類生物合成途徑中的下游關(guān)鍵酶，它能催化黃烷酮醇形成無色花色素，是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶，無色花色素可作為花青素和縮合單寧的前體物質(zhì)[32]。LDOX是一種2-酮戊二酸依賴性酶，通過抑制LDOX基因發(fā)現(xiàn)石竹目中花青素含量較少[36]。通過RNA-seq數(shù)據(jù)和RT-qPCR結(jié)果可知，黃酮類化合物合成途徑中關(guān)鍵基因主要在五指毛桃葉和莖中高表達(dá)，因此，這幾個(gè)基因的表達(dá)情況與黃酮類化合物的含有具有直接的關(guān)系。

本研究以2月齡的五指毛桃根、莖、葉為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，3個(gè)樣品兩兩比較后發(fā)現(xiàn)存在大量差異表達(dá)的基因，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要涉及植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物MAPK信號(hào)通路、黃酮類生物合成這3條通路。對(duì)黃酮類生物合成通路中大部分關(guān)鍵酶基因的TPM值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因在葉片和莖中高表達(dá)，而僅有1個(gè)基因在根中高表達(dá)，同時(shí)，對(duì)其中9個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這9個(gè)基因在五指毛桃根、莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，大部分基因都在莖和葉中高表達(dá)，因此，我們推測(cè)幼苗五指毛桃的黃酮類化合物主要積累在莖和葉片中，這與民間習(xí)慣用藥部位根莖具有一定的差異，可能原因是本次轉(zhuǎn)錄組所用的材料為幼苗，而民間藥用一般為種植多年的植株。五指毛桃根、莖和葉中黃酮類等次生代謝產(chǎn)物隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)，由葉片往根莖運(yùn)輸，并在根中大量積累，該研究成果為擴(kuò)大用藥資源具有重要的意義。因此，黃酮類生物合成的關(guān)鍵基因在植物生長(zhǎng)過程中具有復(fù)雜的調(diào)控作用，其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有待于進(jìn)一步的研究。

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責(zé)任編輯：崔麗虹

收稿日期 ?2020-04-22;修回日期 ?2020-05-29

基金項(xiàng)目 ?漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院院本課題（No. ZWYZ201801）;漳州市科技局科技重大專項(xiàng)（No. ZZ2018ZD2019）;福建高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（閩教科[2017]52號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 ?陳榮珠（1986—），女，博士，講師，研究方向：植物生物技術(shù)。*通信作者（Corresponding author）：王小平（WANG Xiaoping），E-mail：84004279@qq.com;賴鐘雄（LAI Zhongxiong），E-mail：laizx01@163.com。