中藥水煎液中乳酸菌發(fā)酵降低泡菜 亞硝酸鹽含量的研究

◎ 葛瑤潔，韓 露，馮尚坤，段文凱，廖建偉

（臺州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，浙江 臺州 318000）

泡菜脆嫩芳香、口感獨特，含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有健胃理氣、預(yù)防心腦血管疾病等功效，深受消費者喜愛。但腌制過程中，微生物產(chǎn)生的硝酸鹽還原酶將蔬菜中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。后者在體內(nèi)能將血紅蛋白Fe2+氧化，使其變?yōu)楦哞F血紅蛋白，攜氧能力降低，易引起急性中毒，嚴(yán)重時可致死亡[1]。另外，亞硝酸鹽會與胃中含氮化合物結(jié)合成有強(qiáng)致癌性的亞硝胺[2]。

截止目前，亞硝酸鹽控制方法的研究重點在發(fā)酵方法的選擇、輔料的添加和發(fā)酵過程條件控制上。如發(fā)酵方法方面，郝明玉、陳聰?shù)萚3-4]從傳統(tǒng)腌制泡菜中篩選得到乳酸菌，比較了直投式和自然發(fā)酵方法的優(yōu)劣。乳酸菌研究集中在篩選產(chǎn)酸和降解亞硝酸鹽能力較強(qiáng)的菌株上[5]。發(fā)酵過程，調(diào)節(jié)鹽的添加量、溫度和發(fā)酵液的PH值來降低亞硝酸鹽[6-8]。泡菜原輔料使用中，潮州菜慣用薄荷、羅勒和香菜調(diào)味，三者均有很好的亞硝酸鹽的清除和亞硝胺合成的阻斷能力[9]。另外隨著茶多酚、谷胱甘肽、維生素C添加量的增加，泡菜與泡菜液中亞硝酸鹽含量均逐漸減少[10-12]。

泡菜中添加中草藥是近年出現(xiàn)的一種新方法，相關(guān)研究還處于初級階段。如賈晶晶[13]等研究發(fā)現(xiàn)添加黃芩溶液會降低發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽含量。我國中草藥資源豐富，使用歷史悠久，本課題在復(fù)合中藥水煎液中，采用人工接種結(jié)合自然發(fā)酵方法腌制泡菜，通過正交試驗獲得最優(yōu)工藝，以期提高泡菜的安全、風(fēng)味和保健功能，助力本國泡菜特色化，標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而提高中式泡菜的國際地位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆、白菜、白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜、蒜、生姜、白砂糖、食鹽（無碘）：浙江省臺州市市椒江歐尚超市；當(dāng)歸、黨參、黃芪：岷縣和泰中藥材有限公司；乳酸菌：四川高福記生物科技有限公；亞硝酸鹽：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；對氨基苯磺酸：分析純，天津市化學(xué)試劑研究所；鹽酸萘乙二胺：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅：分析純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；乙酸：分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722sp可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；FA1004C電子天平，上海越平科學(xué)儀器（蘇州）制造有限公司；PYX-DH450B-S電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海天恒醫(yī)療器械有限公司；HH2恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司；800 mL自動排氣發(fā)酵罐，淄博治德輕工制品有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜試驗技術(shù)方法

泡菜試驗技術(shù)路線圖見圖1。

圖1 泡菜試驗技術(shù)路線圖

1.3.2 復(fù)合中藥水煎液的制備

稱取不同質(zhì)量（90 g、180 g、270 g、360 g和 450 g）的復(fù)合中藥材（切片后的當(dāng)歸，黨參，黃芪質(zhì)量比為5∶3∶2）于3 000 mL燒杯中，加水浸泡 0.5 h，燒杯蓋上玻璃皿蓋，前后分3次共煎120 min，分別為50 min、40 min和30 min。每次煎之前加水，水量為中藥重量的5倍。單次煎煮結(jié)束趁熱過濾，最后合并3次過濾液加熱濃縮至450 mL，于121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.3.3 發(fā)酵過程中不同蔬菜亞硝酸鹽含量的比較

蔬菜分別選擇豇豆、白菜、白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜去雜清洗干凈，切分后，晾干（所有接觸蔬菜的刀具、案板等都提前清洗干凈，保證無油）。同時泡菜罐清洗后（無油）晾干。稱取晾干的蔬菜各225 g，分別置于泡菜罐中。用涼白開配制鹽3%、糖2%的鹽水溶液，分別倒入泡菜罐，各泡菜添加4.5 g蒜和生姜，泡菜罐做好標(biāo)記，30 ℃密封腌制。每24 h檢測其中的亞硝酸鹽含量。

1.3.4 乳酸菌接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

將新鮮的白菜清洗干凈，剝除壞葉，切去根部，切成2 cm×2 cm見方的塊狀，稱取晾干的蔬菜225 g， 生姜、大蒜各4.5 g，白砂糖9 g，置于發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐中發(fā)酵條件：倒入0.6 g·mL-1復(fù)合中藥水煎液 450 mL，食鹽5%。泡菜罐上做好標(biāo)記，密封于30 ℃腌制。各罐乳酸菌添加量依次是：0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰和0.5‰。

1.3.5 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質(zhì)量及處理技術(shù)見1.3.4，發(fā)酵罐中發(fā)酵條件：倒入0.6 g·mL-1復(fù)合中藥水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌。泡菜罐上做好標(biāo)記，密封于30 ℃腌制。各罐的食鹽濃度依次為：1%、3%、5%、7%和9%。

1.3.6 中藥復(fù)合水煎液濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質(zhì)量及處理技術(shù)見1.3.4，發(fā)酵罐中發(fā)酵條件：倒入復(fù)合中藥水煎液450 mL，食鹽5%、乳酸菌0.2‰。泡菜罐上做好標(biāo)記，密封于25 ℃腌制。各罐中藥復(fù)合水煎液濃度依次為：0.2 g·mL-1、 0.4 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1和1.0 g·mL-1。

1.3.7 發(fā)酵溫度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜和輔料質(zhì)量及處理技術(shù)見1.3.4，發(fā)酵罐中發(fā)酵條件：倒入0.6 g·mL-1復(fù)合中藥水煎液450 mL，添加0.2‰乳酸菌、5%食鹽。各泡菜罐上做好標(biāo)記，分別密封于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃腌制。

1.3.8 泡菜中亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽含量的檢測參見國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33—2016 第二法——分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中不同蔬菜亞硝酸鹽含量的比較結(jié)果

由圖2知，在自然發(fā)酵情況下，不同蔬菜均在第2 d達(dá)到亞硝酸鹽峰值，之后亞硝酸鹽含量慢慢下降至國家限量以下。其中尤以白菜的亞硝酸鹽含量為高，其峰值達(dá)到249.56 mg·kg-1，其他蔬菜亞硝酸鹽峰值均低于100 mg·kg-1，且同一時間，泡菜中亞硝酸鹽含量均低于白菜。為了便于觀察亞硝酸鹽含量的變化，選擇白菜進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 不同蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化圖

2.2 各因素對亞硝酸鹽峰值與終值的影響

2.2.1 乳酸菌接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

目前已有商業(yè)化的固體泡菜乳酸菌發(fā)酵劑，方便直投式發(fā)酵泡菜或者人工接種結(jié)合自然發(fā)酵。直投式發(fā)酵亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵，但是前者需要預(yù)先對蔬菜原料進(jìn)行滅菌處理，對實驗材料風(fēng)味有一定影響，且增加成本。董靜等[6]比較了人工接種結(jié)合自然發(fā)酵與純自然發(fā)酵的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)人工接種乳酸菌結(jié)合自然發(fā)酵，不僅不破壞蔬菜本身風(fēng)味，而且相比自然發(fā)酵，亞硝酸鹽峰值低，降低速度快，含量少。因此，本實驗采用人工接種結(jié)合自然發(fā)酵的方法。

由圖3知，白菜本身含有一定量的亞硝酸鹽，隨著發(fā)酵時間的延長，不同乳酸菌添加量下，亞硝酸鹽含量逐漸增加，且均在24 h到達(dá)亞硝酸鹽峰值。之后，亞硝酸鹽含量迅速降低，在72 h候后變化平緩。乳酸菌添加量越高，亞硝酸鹽的峰值越低，添加量為0.1‰時，峰值達(dá)到113.7 mg·kg-1，添加量增加到0.2‰時，峰值迅速降至26.4 mg·kg-1。同時隨著添加量的增加，6 d后的亞硝酸鹽含量逐漸減少。添加量為0.5‰時，盡管亞硝酸鹽終值非常低，但是乳酸菌添加量偏大，泡菜口感過酸。經(jīng)綜合考慮選擇0.2‰、0.3‰和0.4‰做后續(xù)的正交試驗。

2.2.2 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

在泡菜腌制初期，乳酸未大量生成，對各類雜菌的抑制作用比較弱，主要依靠食鹽來抑菌。由圖4知，不同食鹽濃度，各個泡菜的出峰時間差異比較大。1%和3%濃度是在24 h出峰，5%濃度72 h出峰，7%和9%濃度96 h出峰。這是因為食鹽濃度越高，雜菌受到的抑制作用越強(qiáng)，因此，亞硝酸鹽出峰時間較晚，但是同時也會一定程度上抑制乳酸菌的生長繁殖，導(dǎo)致峰值較高。因此可以看到6 d以后亞硝酸鹽含量隨著濃度的升高而增大?？紤]到7%和9%濃度的泡菜亞硝酸鹽含量均偏高，同時口感上過咸不利健康，取1%、3%、5%做進(jìn)一步的正交試驗。

圖3 不同乳酸菌添加量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響圖

圖4 食鹽濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響圖

2.2.3 中藥復(fù)合水煎液濃度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響

中藥黃芪、當(dāng)歸、黨參具有補(bǔ)氣益血的效用，同時經(jīng)研究證實，能抑制泡菜中有害雜菌的生長又對有益乳酸菌起到一定的促進(jìn)作用[14]。由圖5知，黃芪、當(dāng)歸、黨參的復(fù)合中藥水煎液0.2 g·mL-1和0.4 g·mL-1濃度48 h出峰，0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1以及1.0 g·mL-1均在24 h出峰。亞硝酸鹽峰值隨中藥濃度的增加而整體下降，但是1.0 g·mL-1濃度峰值卻較0.8 g·mL濃度的 高，這可能是因為高濃度的中藥水煎液不利于乳酸菌的生長。取出峰時間相對較前，峰值較低的0.6 g·mL-1、 0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1做進(jìn)一步的正交試驗。

2.2.4 不同發(fā)酵溫度對硝酸鹽含量的影響

由圖6知，溫度對亞硝酸鹽出峰時間及峰值均有較大影響。發(fā)酵溫度為20 ℃和25 ℃時，均在第3 d出峰，而30 ℃、35 ℃和40 ℃均在24 h即出峰，即溫度越高，出峰時間越早。同時總體來看40 ℃以下，溫度越高，峰值越小，第6 d終值也越小。溫度從35 ℃變?yōu)?0 ℃，峰值不降低反而增大，這可能是因為溫度較高以后，開始部分抑制了乳酸菌的生長繁殖，導(dǎo)致其他雜菌生長繁殖加快，硝酸鹽較多被還原為亞硝酸鹽。

圖5 不同濃度中藥復(fù)合水煎液對亞硝酸鹽含量的影響圖

圖6 不同發(fā)酵溫度下泡菜中亞硝酸鹽含量的變化圖

在溫度的研究上存在一些爭議，徐海菊等[15]發(fā)現(xiàn)高溫比低溫的亞硝酸鹽峰值低，亞硝酸鹽峰提前，這與本研究一致，但是周強(qiáng)[16]等人研究結(jié)果則顯示，溫度高，亞硝酸鹽含量高，出峰時間不變。這可能是原輔材料種類、微生物本底數(shù)、體系pH以及發(fā)酵過程中微生物的繁殖速度的影響所致。綜合考慮到峰值、終值以及能耗，選擇25 ℃、30 ℃和35 ℃作為后續(xù)正交試驗水平。

2.2.5 白菜泡菜最佳工藝條件優(yōu)化

根據(jù)各個單因素的實驗結(jié)果，每個因素取三水平進(jìn)行正交實驗，因素水平見表1。以正交設(shè)計表安排實驗，以6 d后的亞硝酸鹽含量為指標(biāo)。由表2知，極差A(yù)＞B＞D＞C，即影響亞硝酸鹽含量的順序依次是乳酸菌添加量、食鹽濃度、溫度、中藥復(fù)合水煎液濃度。極差分析結(jié)果顯示，以6 d后亞硝酸鹽含量為指標(biāo)，最佳制備工藝條件為A2B2C1D2。即當(dāng)乳酸菌添加量0.3‰，食鹽濃度為3%，復(fù)合中藥水煎液濃度為0.6 g·mL-1，溫度為30 ℃時，亞硝酸鹽含量最低。按照這一最佳條件進(jìn)行驗證試驗，6 d后亞硝酸鹽含量為0.713 mg·kg-1。從本課題研究來看，通過調(diào)整乳酸菌添加量、食鹽濃度、發(fā)酵溫度和復(fù)合中藥水煎液濃度可有效消減泡菜中亞硝酸鹽，且短期內(nèi)就可以降至遠(yuǎn)低于國家安全標(biāo)準(zhǔn)上限的范圍。

表1 L9（34）優(yōu)化白菜泡菜工藝的因素水平表

表2 正交實驗結(jié)果表

3 結(jié)論

結(jié)果表明，各個因素對亞硝酸鹽含量的影響大小依次是乳酸菌添加量＞食鹽濃度＞溫度＞中藥復(fù)合水煎液濃度。當(dāng)乳酸菌添加量0.3‰、食鹽濃度3%，復(fù)合中藥水煎液濃度為0.6 g·mL-1、溫度30 ℃時，6 d后亞硝酸鹽含量最低。在這樣的條件下，泡菜安全性最高，同時口感爽脆，營養(yǎng)豐富。