伊金月，張智博，姚 遠(yuǎn)，邢懷玉，李慶偉，張 寧,，徐紅丹,*，孫慧峰*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，伴隨著學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能的逐漸衰退[1]。AD 其病理特征是神經(jīng)元凋亡，老年斑（SPs）沉積以及在大腦皮層和海馬的局限區(qū)域形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。淀粉樣蛋白β（Amyloid beta，Aβ）是SPs 的主要組成部分，Aβ 的聚集和沉積導(dǎo)致腦內(nèi)大量神經(jīng)元死亡。木犀草素是一種植物雌激素，主要存在于補(bǔ)腎中藥骨碎補(bǔ)中，具有雌激素樣作用。有研究表明，木犀草素能減輕淀粉樣β 蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[2]，并誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞突起生長，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御能力[3]。木犀草素具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其促神經(jīng)發(fā)生作用的詳細(xì)分子機(jī)制仍然有限。PI3K/Akt 細(xì)胞信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、存活和抗氧化方面起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)PI3K/Akt 通路被激活時，Akt 磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子，起到抗氧化作用，這被認(rèn)為是細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PI3K 阻斷劑LY294002 進(jìn)行干預(yù)，觀察木犀草素處理后PC12 細(xì)胞的氧化損傷以及PI3K/Akt途徑關(guān)鍵分子及蛋白的變化，探討木犀草素的保護(hù)功能是否和PI3K/Akt 途徑相關(guān)，進(jìn)一步闡明木犀草素抗Aβ 損傷PC12 細(xì)胞的作用機(jī)制，從而為AD 的臨床治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；木犀草素（成都曼思特生物科技有限公司）；Aβ25-35（北京Bioss 生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS）、高糖培養(yǎng)液（DMEM）、雙抗、胰蛋白酶（Hyclone 公司）；四甲基噻唑藍(lán)（MTT ）、DMSO（Sigma 公司）；SOD 測試盒、MDA 測試盒（南京建成生物工程研究所）；ROS 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；IX-71-21PH 型Olympus 倒置顯微鏡（日本Olympus 株式會社）；MK3 型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存 液氮中取出細(xì)胞置于37℃水浴鍋中迅速搖晃，1 min內(nèi)溶化，溶化后移至15 mL 離心管中，加3 ～ 5 mL DMEM 完全培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min、5 min 離心，加3 ～ 7 mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸，吸取1 mL 重懸液置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入3 ～ 6 mL 的DMEM 完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h換液一次，待細(xì)胞長至80%以上，采用0.25%胰酶消化細(xì)胞按照1 ∶4 或者更大的比例進(jìn)行傳代。還可以在良好條件下將細(xì)胞消化至80%，將細(xì)胞重懸于8%DMSO，10%胎牛血清和82%DMEM 完全培養(yǎng)基中，并將懸浮液轉(zhuǎn)移至冷凍管，每管1 mL。將其置于程序冷卻箱中并逐漸冷卻，在-80 ℃下過夜，最后在液氮罐（-196 ℃）中長時間儲存。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組（Aβ25-35組）、木犀草素＋Aβ25-35組。其中空白組給予不含藥物的DMEM 完全培養(yǎng)液200 μL；模型組與木犀草素＋Aβ25-35組同步加入20 μmol/L Aβ25-35；木犀草素＋Aβ25-35組分別加入含10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6μmol/L 各 濃 度 的木犀草素的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT 法檢測細(xì)胞活力。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 根據(jù)篩選的濃度、細(xì)胞增值率的結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4 組：（1）空白組：DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后更換一次DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；（2）模型組（Aβ25-35組）：DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h 后給予Aβ25-35溶液，使其終濃度為20 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；（3）木 犀 草 素＋Aβ25-35組：DMEM 培 養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換成終濃度為10-4μmol/L 的木犀草素溶液培養(yǎng)2 h，給予Aβ25-35溶液，使其終濃度為20 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；（4）木犀草素＋Aβ25-35＋LY294002 組：DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換成終濃度2 × 102μmol/L 的LY294002 培養(yǎng)1 h，更換成終濃度10-4μmol/L 的木犀草素溶液培養(yǎng)2 h，給予Aβ25-35溶液，使其終濃度為20 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 Western blot 法 充分裂解PC12 細(xì)胞，采用BCA 法檢測總蛋白濃度，等量上樣進(jìn)行10% SDSPAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%封閉液封閉2 h，加一抗孵育4 ℃過夜，加二抗孵育2 h，洗膜之后加ECL 化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測分析。每個樣本3 次平行試驗(yàn)，得到蛋白條帶的積分光密度( IOD) ，利用Lane ID 凝膠軟件分析數(shù)據(jù)。用IOD 目的條帶/IOD 內(nèi)參條帶比值來表示檢測目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 ROS 的測定 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，以4×105/孔的量將細(xì)胞懸液種植至6 孔板，2 mL/孔，細(xì)胞按不同分組情況培養(yǎng)后，移除培養(yǎng)液，加入10 μmol/L的DCFH-DA 1 mL/孔，將6 孔板放在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置20 min，每5 min 將孔板中的各孔混一次，使細(xì)胞充分接觸探針，用無血清培養(yǎng)液洗滌三次，收集細(xì)胞，加入1 mL 無血清培養(yǎng)液，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 MDA 的測定 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，以4×105/孔的量將細(xì)胞懸液種植至6 孔板，2 mL/孔，細(xì)胞按不同分組情況培養(yǎng)后收集至15 mL 離心管中，將RIPA 裂解液（含1% PMSF）添加到各離心管中，靜置3 min 后將所有液體移至1.5 mL 離心管中，靜置30 min 然后離心（4 ℃，12 000 r/min，5 min），離心后取上清，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。按照丙二醛測試盒說明書步驟，應(yīng)用半自動生化分析儀，在波長532 nm 處，測定各組OD 值。

1.2.7 SOD 的測定 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，以4×105/孔的量將細(xì)胞懸液種植至6 孔板，2 mL/孔，細(xì)胞按不同分組情況培養(yǎng)后收集至15 mL 離心管中，將RIPA 裂解液（含1%PMSF）添加到各離心管中，靜置3 min 后將所有液體移至1.5 mL 離心管中，靜置30 min 然后離心（4 ℃，12 000 r/min，5 min），離心后取上清，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。按照總超氧化物歧化酶測試盒說明書步驟，應(yīng)用半自動生化分析儀，在波長550 nm 處，測定各組OD 值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 用 SPSS 18. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)。以P ＜0. 05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素對Aβ25-35 損傷的PC12 細(xì)胞活性的影響

結(jié)果見表1，與空白組相比，Aβ25-35組增殖率顯著降低（P ＜0.01）；與模型組比較， 除10 μmol/L劑量組外各劑量木犀草素組細(xì)胞增殖率顯著升高（P ＜0.01）；其中10-4μmol/L 木犀草素組的細(xì)胞增殖率與空白組無顯著差異。結(jié)果表明，10-4μmol/L 木犀草素對Aβ25-35損傷PC12 細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，故選用該藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 木犀草素對Aβ25-35 損傷PC12 細(xì)胞活性的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 1 Effect of luteolin on the activity of PC12 cells injured by Aβ25-35（±s，n ＝ 6）

表1 木犀草素對Aβ25-35 損傷PC12 細(xì)胞活性的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 1 Effect of luteolin on the activity of PC12 cells injured by Aβ25-35（±s，n ＝ 6）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與Aβ25-35 組比較，##P ＜0.01

組別 濃度/（μmol/L） 各組吸光度值（OD） 細(xì)胞增殖率/%空白組 - 0.608 ± 0.013 100.000 ± 0.000 Aβ25-35 組 20 0.484 ± 0.012** 79.601 ± 0.222**10 0.457 ± 0.003**## 75.180 ± 0.910**##1 0.490 ± 0.008** 80.598 ± 0.333**10-1 0.496 ± 0.010**## 81.580 ± 0.082**##10-2 0.525 ± 0.007**## 86.359 ± 0.568**##10-3 0.563 ± 0.004**## 92.618 ± 1.080**##10-4 0.605 ± 0.012## 99.509 ± 0.126##10-5 0.530 ± 0.004**## 87.748 ± 1.720**##10-6 0.514 ± 0.005**## 84.553 ± 0.805**##7.653 7.930 0.002 0.002木犀草素組＋Aβ25-35 組F P

2.2 木犀草素對Aβ25-35 損傷PC12 細(xì)胞中ROS、MDA 及SOD 含量的影響

結(jié)果如表2 所示，與空白組相比，模型組ROS及MDA 的含量明顯升高，SOD 活性降低（P ＜0.01）；與模型組相比，木犀草素＋Aβ25-35組ROS 及MDA 的含量降低，SOD 活性升高（P ＜0.01）；與木犀草素＋Aβ25-35組相比，木犀草素 ＋ Aβ25-35＋ LY294002 組ROS 及MDA 的含量升高，SOD 活性降低（P ＜0.01）。

表2 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中ROS、MDA 及SOD 含量的影響（±s，n ＝ 3）Tab. 2 Effects of luteolin on the contents of ROS, MDA and SOD in PC12 cells injured by Aβ25-35（±s，n ＝ 3）

表2 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中ROS、MDA 及SOD 含量的影響（±s，n ＝ 3）Tab. 2 Effects of luteolin on the contents of ROS, MDA and SOD in PC12 cells injured by Aβ25-35（±s，n ＝ 3）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01；與木犀草素＋Aβ25-35 ＋ LY294002 組比較，++P ＜0.01

SOD/（U/mgprot）空白組 100.000 ± 2.511 2.468 ± 0.312 56.254 ± 5.008 Aβ25-35 組 152.684 ± 6.301** 4.776 ± 0.421** 37.787 ± 6.901**木犀草素＋Aβ25-35 組組別 Relative ROS content（% of control）MDA/（nmol/mgprot）120.367 ± 8.662## 2.801 ± 0.223## 49.669 ± 6.297##147.635 ± 7.634++ 4.569 ± 0.218++ 36.024 ± 5.448++40.559 45.507 7.914 0.000 0.000 0.009木犀草素＋Aβ25-35 ＋LY294002 組P F

2.3 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中p-Akt、p-Tau 蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如表3 和圖1 所示，與空白組相比，模型組p-Akt 的表達(dá)降低（P ＜0.01），p-Tau 含量升高（P ＜0.05）；與模型組相比，木犀草素＋ Aβ25-35組p-Akt 表達(dá)升高（P ＜0.01），p-Tau 的表達(dá)降低（P ＜0.05）；與木犀草素＋Aβ25-35組相比，木犀草素＋Aβ25-35＋ LY294002 組p-Akt 的表達(dá)降低（P ＜0.01），p-Tau 的含量升高（P ＜0.05）。

3 討論

AD 是全世界老年人群中最普遍的癡呆形式，導(dǎo)致AD 發(fā)病的因素很多，其中Aβ 的聚集是最為突出的因素，被認(rèn)為是AD 的典型特征[4]。有實(shí)驗(yàn)表明，雌激素替代療法在AD 患者中有顯著作用，但是雌激素也會產(chǎn)生不必要的副作用，如其對非神經(jīng)細(xì)胞乳腺細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞有增殖和致癌作用[5]。因此，雌激素作為AD 治療的使用是有限的，需要其它副作用較少的雌激素藥物來開發(fā)替代治療策略。植物雌激素是一類天然化合物，與雌激素具有結(jié)構(gòu)相似性，并具有雌激素的生理和物理特性。且植物雌激素可以與雌激素受體（ER）相互作用，介導(dǎo)雌激素反應(yīng)[6]。因此，植物雌激素在預(yù)防和治療AD 作用機(jī)制中具有重要意義。

研究表明，PI3K/Akt 信號通路在阿爾茨海默病病理中起抗氧化作用，可在刺激ER 時被激活[7]。活化的PI3K 促進(jìn)PI3K 下游激酶Akt 的活化，Akt通過刺激氧化代謝，促進(jìn)線粒體耗氧并促進(jìn)ROS積累。細(xì)胞內(nèi)MDA 和SOD 是評價細(xì)胞或組織氧化應(yīng)激水平的重要生物標(biāo)志物。MDA 是ROS 誘導(dǎo)的膜脂過氧化產(chǎn)物，可導(dǎo)致膜損傷和破壞，而SOD 被認(rèn)為是哺乳動物細(xì)胞的關(guān)鍵抗氧化酶[8]。因此，本研究檢測了MDA、SOD 的含量。結(jié)果表明，木犀草素能顯著降低Aβ 刺激的PC12 細(xì)胞中MDA 的含量，而增加SOD 的含量。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果還表明，木犀草素能明顯降低Aβ 刺激的PC12 細(xì)胞ROS 水平。提示AD 的發(fā)生與ROS、MDA 和SOD 的濃度有關(guān)，木犀草素通過降低MDA和ROS 的濃度，或通過增加SOD 發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。以上結(jié)果表明，木犀草素能明顯減輕PC12細(xì)胞的氧化損傷。PI3K/Akt 通路在中樞和外周神經(jīng)元中都起到抗氧化作用，這被認(rèn)為是Aβ 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K 信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。在本研究中，木犀草素上調(diào)了p-Akt 的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，木犀草素可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 通路從而對Aβ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用。已知Tau 蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡是阿爾茨海默病認(rèn)知能力下降的主要原因。通過激活PI3K/Akt 途徑，可降低在AD 腦中Tau 的過度磷酸化[9]。在本研究中，我們觀察到Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞Tau高磷酸化在木犀草素處理后顯著被抑制。結(jié)果表明，木犀草素可能通過抑制Tau 高磷酸化對Aβ 誘導(dǎo)的氧化損傷起到保護(hù)作用。本研究評估了木犀草素對Aβ誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，PI3K/Akt 信號通路參與了氧化應(yīng)激的過程，在抑制通路之后，變化結(jié)果傾向于保護(hù)過程是從此通路發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步蛋白檢測p-Akt、p-Tau 蛋白表達(dá)，從p-Akt的變化及組間對比證實(shí)之前的推論，Tau 蛋白結(jié)果表現(xiàn)出防止其磷酸化，從而達(dá)到保護(hù)作用。

表3 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中p-Akt、p-Tau 蛋白表達(dá)的影響（±s，n ＝ 3）Tab. 3 Effect of luteolin on the expression of p-Akt and p-Tau protein in Aβ25-35 -induced PC12 cell injury（±s，n ＝ 3）

表3 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中p-Akt、p-Tau 蛋白表達(dá)的影響（±s，n ＝ 3）Tab. 3 Effect of luteolin on the expression of p-Akt and p-Tau protein in Aβ25-35 -induced PC12 cell injury（±s，n ＝ 3）

注：與空白組比較，**P ＜0.01，*P ＜0.05；與模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05；與木犀草素+ Aβ25-35 + LY294002 組比較，++P ＜0.01，+P ＜0.05

組別 p-Akt/β-actin p-Tau/β-actin空白組 1.065 ± 0.014 0.303 ± 0.087 Aβ25-35 組 0.482 ± 0.069** 0.665 ± 0.202*木犀草素＋Aβ25-35 組 0.834 ± 0.053## 0.406 ± 0.105#0.525 ± 0.081++ 0.596 ± 0.077+63.243 5.135 0.000 0.029木犀草素＋Aβ25-35 ＋LY294002 組F P

圖1 木犀草素對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷中p-Akt、p-Tau 蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of luteolin on the expression of p-Akt and p-tau protein in Aβ25-35 -induced PC12 cell injury

4 結(jié)論

木犀草素可能通過激活PI3K/Akt 信號通路抑制氧化應(yīng)激及Tau 蛋白的磷酸化發(fā)揮對Aβ25-35損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用。但作為體外實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能具有一定局限性，木犀草素在動物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用有待進(jìn)一步評估。本實(shí)驗(yàn)從分子角度出發(fā)，為木犀草素在AD 中的潛在應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，同時為進(jìn)一步研究木犀草素的神經(jīng)保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。