馬錢苷元抗大鼠實驗性心律失常的作用與機制預(yù)測

馮 群，李 欣，姚景春，肖 敏，趙 濤，張貴民*

（1.魯南制藥集團股份有限公司 新藥安評中心，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.山東新時代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400）

心律失常（arrhythmia）是心血管疾病中重要的一組疾病，可單獨發(fā)病或與其它心血管病伴隨發(fā)生，具有較高的發(fā)病率和潛在的死亡危險[1]。心律失常通常是由于竇房結(jié)激動異?；蚣赢a(chǎn)生于竇房結(jié)以外，激動的傳導緩慢、阻滯或經(jīng)異常通道傳導，即心臟活動的起源和（或）傳導障礙導致心臟搏動的頻率和（或）節(jié)律異常[2]。其預(yù)后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢、是否導致嚴重血流動力障礙有關(guān)，可突然發(fā)作而致猝死，亦可持續(xù)累及心臟而致其衰竭。心律失常大多通過心電圖確診[3]。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物已近50 余種，至今還沒有統(tǒng)一的分類標準。大多數(shù)學者同意根據(jù)藥物對心臟的不同作用原理將抗心律失常藥物分為四類：鈉通道阻滯藥、β 腎上腺素受體阻斷藥、延長動作電位時程藥、鈣通道阻滯劑，以指導臨床合理用藥。長期服用抗心律失常藥均有不同程度的副作用，嚴重的可引起室性心律失常或心臟傳導阻滯而致命。目前抗心律失常的西醫(yī)藥物治療研究已經(jīng)進入瓶頸期，而某些國產(chǎn)中成藥在治療此疾病方面具有獨特優(yōu)勢[4]。

作為山茱萸果實中的成分之一，馬錢苷元也可以通過馬錢苷的降解而得。山茱萸及其有效成分可通過脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎性因子和免疫調(diào)節(jié)等路徑發(fā)揮神經(jīng)保護、強心、肝臟和腎臟保護等藥理作用[5-7]?，F(xiàn)代藥理學研究已經(jīng)證明了山茱萸提取物及馬錢苷抗心律失常作用的有效性[8]，但馬錢苷元的抗心律失常作用仍不明確。本實驗建立2 種不同的心律失常大鼠模型，考察馬錢苷元對心律失常大鼠的保護作用，利用分子對接技術(shù)探索馬錢苷元與抗心律失常靶點的相互作用，為其開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 馬錢苷元（C11H16O5，CAS：29748-10-5），由山東新時代藥業(yè)有限公司提供（97.51%）；氯仿（分析純，西隴科學股份有限公司）；烏頭堿（分析純，南京澤朗植提技術(shù)有限公司）；鹽酸胺碘酮注射液［賽諾菲安萬特（杭州）制藥有限公司］。

1.1.2 實驗動物 SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量為180 ～220 g。購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物使用許可證號：SYXK（魯）20180008，大鼠入室后至少檢疫3 d，區(qū)分性別飼養(yǎng)。研究中所有實驗動物相關(guān)的操作嚴格按照國際實驗室動物倫理行為準則“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”實施[9]。

1.1.3 主要儀器 Waters 2489 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SP2006 型心電圖分析系統(tǒng)（北京軟隆科技有限責任公司）；PL-2002 型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 方法

1.2.1 氯仿誘發(fā)大鼠心律失常實驗 取SD 大鼠40只，按照性別和體質(zhì)量隨機分為4 組，模型組、馬錢苷元低、高劑量組、胺碘酮組，每組10 只，雌雄各半。模型組按照10 mL/kg 腹腔注射生理鹽水，馬錢苷元劑量組按照10 mL/kg 腹腔注射馬錢苷元1 mg/kg、10 mg/kg，胺碘酮組按照5 mL/kg 靜脈注射鹽酸胺碘酮注射液20 mg/kg，連續(xù)給藥3 d，1 次/d。末次給藥30 min 后，將大鼠放入含有10 mL 氯仿棉球的倒置2 000 mL 燒杯中（每換1 只大鼠添加2 mL 氯仿），待呼吸停止后立即沿胸骨左緣剖開胸腔，觀察心臟跳動節(jié)律，以確定是否發(fā)生室顫，記錄室顫大鼠數(shù)，計算室顫發(fā)生率[10]。

1.2.2 烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常實驗 取SD 大鼠40 只，按照性別和體質(zhì)量隨機分為4 組，模型組、馬錢苷元低、高劑量組、胺碘酮組，每組10 只，雌雄各半。模型組按照10 mL/kg 腹腔注射生理鹽水，馬錢苷元低、高劑量組按照10 mL/kg 分別腹腔注射馬錢苷元1 mg/kg、10 mg/kg，胺碘酮組按照5 mL/kg靜脈注射鹽酸胺碘酮注射液20 mg/kg，各組大鼠連續(xù)給藥3 d，1 次/d。末次給藥30 min 后，以3%戊巴比妥鈉按45 mg/kg 將大鼠麻醉后，仰臥固定于大鼠手術(shù)臺上，以針形電極扎入四肢皮下，用SP 2006心電圖分析系統(tǒng)檢測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，心電圖穩(wěn)定后尾靜脈快速注射烏頭堿（20 g/kg），觀察心電圖變化，記錄大鼠室早的出現(xiàn)及終止時間，計算大鼠室早潛伏期和持續(xù)時間[11]。

1.2.3 分子對接 從KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/kegg/drug/）[12]中檢索抗心律失常藥物及其對應(yīng)的靶點，共得到66 個藥物和39 個靶點，根據(jù)藥物分類和作用通路，分別選擇SCN5A、ADRB1、KCNH2 和CACNA1C 作為受體，馬錢苷元作為配體，并同已上市藥物利多卡因（lidocaine）、普萘洛爾（propranolol）、胺碘酮（amiodarone）、維拉帕米（verapamil）比較與受體的結(jié)合能和結(jié)合位點。

下載上述配體/ 藥物的mol2 格式文件，用Autodock Tool 軟件打開該化合物，使其能量最小化并判定化合物的Root、選定可扭轉(zhuǎn)的鍵，保存為*pdbqt格式文件。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）[13]下載受體的PDB 格式文件，運用Pymol 軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），再保存為PDB 格式文件。隨后用Autodock Tool 軟件打開的PDB 文件，加氫、計算電荷并“Assign AD4 type”給蛋白添加原子類型，將其保存為*pdbqt 格式文件[14]。運用Autodock vina 將配體/藥物和受體進行對接。結(jié)合能小于0 說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，目前對于活性分子的靶點篩選尚無統(tǒng)一標準，本實驗對結(jié)合能進行排序，結(jié)合能排序靠前且數(shù)值絕對值越大，對接結(jié)果較好。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗。計數(shù)資料用例與百分數(shù) ［n（%）］ 表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬錢苷元對氯仿所致心律失常的影響

與模型組比較，馬錢苷元高劑量組和胺碘酮組大鼠室顫率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.01），馬錢苷元低劑量組大鼠室顫率無明顯降低，見表1。表明馬錢苷元高劑量組可以抗室顫。

表1 各組大鼠室顫情況[n（%）]Tab. 1 Incidence comparation of ventricular fibrillation in each group[n（%）]

2.2 馬錢苷元對烏頭堿所致心律失常的影響

實驗結(jié)果如表2 所示，靜脈注射烏頭堿后大鼠均可出現(xiàn)室性心律失常，與模型組相比，馬錢苷元高劑量組和陽性藥胺碘酮組大鼠出現(xiàn)心律失常的潛伏期明顯延長（P ＜0.05），并有效縮短心律失常的持續(xù)時間（P ＜0.05）。結(jié)果表明，馬錢苷元高劑量組大鼠對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常有較好的拮抗作用，低劑量組效果不明顯。

表2 馬錢苷元對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常潛伏期和持續(xù)時間的影響（±s，n = 10）Tab. 2 Influence of loganetin on incubation period and duration of arrhythmia induced by aconitine in rats（±s，n = 10）

表2 馬錢苷元對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常潛伏期和持續(xù)時間的影響（±s，n = 10）Tab. 2 Influence of loganetin on incubation period and duration of arrhythmia induced by aconitine in rats（±s，n = 10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與胺碘酮組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 潛伏期/ s 持續(xù)時間 / s模型組 82.2 ± 37.1 1 090.3 ± 281.4胺碘酮組 138.5 ± 58.0* 553.5 ± 192.2**馬錢苷元低劑量組（1 mg/kg） 106.3 ± 47.6 883.8 ± 222.5##馬錢苷元高劑量組（10 mg/kg） 146.5 ± 69.3* 767.9 ± 213.7*#F 2.989 9.512 0.043 7 9.17×10-5 P

2.3 分子對接

將馬錢苷元和利多卡因（lidocaine）、普萘洛爾（propranolol）、胺碘酮（amiodarone）、維拉帕米（verapamil）與SCN5A、ADRB1、KCNH2 和CACNA1C 四個受體進行分子對接。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，相互作用的可能性越大，結(jié)合能≤-1.2 kcal/mol 作為篩選標準，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol時則視為配體與受體有較好的活性[15]。

由圖1 可知，馬錢苷元和利多卡因、胺碘酮的結(jié)合能接近。馬錢苷元和利多卡因均可與SCN5A 中93位絲氨酸（Ser）形成氫鍵（圖2A 和2B）；馬錢苷元與KCNH2 中810 位天冬酰胺（Asn）和858 位異亮氨酸（Ile）形成氫鍵，胺碘酮與KCNH2 中810 位Asn 和854 位Ser 形成氫鍵（圖2C 和2D）。結(jié)果表明馬錢苷元與SCN5A 和KCNH2 均具有較好的結(jié)合能力，與前者的結(jié)合更穩(wěn)定。

圖1 分子對接結(jié)果氣泡圖Fig. 1 Bubble diagram of molecular docking

圖2 藥物與受體相互作用分析Fig. 2 The analysis of the interaction between drugs and receptors

3 討論

從中醫(yī)的角度來說，心律失常屬于“心悸”“胸痹”“心痛”等范疇，多由于臟腑氣血陰陽虛損、內(nèi)傷七情、氣滯血瘀交互作用致心失所養(yǎng)、心脈失暢而引起[16-17]。許多化學藥品可誘導不同類型的心律失常，常用于制備快速性心律失常模型的藥物有氯仿、烏頭堿、氯化鋇、哇巴因、異丙腎上腺素等[18]。氯仿作用于心肌細胞，使心室不應(yīng)期不規(guī)則地延長、復(fù)極不均一性增加。其誘發(fā)室顫機制可能是刺激植物性神經(jīng)及其遞質(zhì)釋放或腎上腺髓質(zhì)分泌大量兒茶酚胺，激活腎上腺素β 受體有關(guān)[19]。烏頭堿誘發(fā)心律失常的機制較為復(fù)雜，可激活心肌細胞Na＋通道，加速Na＋離子內(nèi)流，促使細胞膜去極化，形成一源或多源性異位節(jié)律而誘發(fā)心律失常[20]。本研究選擇此兩種模型作為基礎(chǔ)探討馬錢苷元的抗心律失常作用。研究結(jié)果表明，馬錢苷元高劑量（10 mg/kg）具有一定的抗心律失常作用，能明顯降低氯仿所致大鼠的室顫發(fā)生率，對烏頭堿所致大鼠室上性早搏也有預(yù)防作用，能延長室早潛伏期并縮短其持續(xù)時間，低劑量（1 mg/kg）時無明顯作用。

目前已知心律失常相關(guān)基因有60 多個，單一基因的異常表達可引發(fā)多種心律失常，而同一種心律失常與多種基因相關(guān)[21]。本研究從已知的作用通路中分別選擇SCN5A、 ADRB1、KCNH2、CACNA1C 作為分子對接的受體[22-26]。同時選擇四類抗心律失常藥物中的代表性藥物（利多卡因、普萘洛爾、胺碘酮和維拉帕米）作為配體，與馬錢苷元和受體對接的結(jié)果進行比較。發(fā)現(xiàn)馬錢苷元與SCN5A、ADRB1 和KCNH2均有較好的結(jié)合能力，與SCN5A 的結(jié)合能最佳。SCN5A 基因編碼的心臟Na＋通道α 亞基（Nav1.5）是維持心肌細胞正常興奮性不可或缺的關(guān)鍵蛋白[22-23]。馬錢苷元可落入該蛋白“口袋”中，并通過1 位羥基與絲氨酸羥基形成的氫鍵，確保二者結(jié)合穩(wěn)定。表明馬錢苷元可能通過阻滯鈉通道發(fā)揮抗心律失常作用。

4 結(jié)論

本研究通過藥效學實驗證明了馬錢苷元抗心律失常的有效性，運用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，馬錢苷元與心律失常相關(guān)蛋白的結(jié)合位點和已上市藥物相似，與Na＋通道蛋白的結(jié)合能力最佳，為馬錢苷元抗心律失常作用的開發(fā)提供了方向，但其作用機制還需進行進一步的實驗驗證。本課題組將針對心律失常不同作用通路的靶點繼續(xù)進行定性和定量分析，以期驗證馬錢苷元抗心律失常的作用機制。