申香群，仁增多杰，馬倩倩，朱沁芳，Mohamed Magged，張 偉，任延明

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

大腸桿菌可以與人體內(nèi)共生菌同時(shí)寄生于胃腸道中而不引發(fā)疾病，但是部分分型的大腸桿菌如腸源性大腸桿菌(EPEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)等具有致病性。在一些地區(qū)，EPEC和EHEC依然是腹瀉致死的重要病因[1]。因此，對于EPEC、EHEC發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。枸櫞酸桿菌(Cirtrobacterrodentium，C.rodentium)是一種小鼠特異性革蘭氏陰性桿菌，毒力基因序列及形成的病理損傷機(jī)制與人類感染EPEC、EHEC具有相似性，常用于研究人類大腸桿菌感染。因此，本研究以C.rodentium感染小鼠模型模擬EPEC、EHEC對人類的感染。石榴健胃散出自《四部醫(yī)典》，主要用于治療腹瀉?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，石榴具有抗氧化、抗炎、抗感染的作用。本研究依此探討石榴健胃散干預(yù)對C.rodentium感染小鼠腸道免疫功能的影響。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠24只，體重18～20 g，購于湖南史萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。動(dòng)物的使用和處理經(jīng)過青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 石榴健胃散購自青海省藏醫(yī)院，依據(jù)《四部醫(yī)典》要求煎煮，以水煎煮，煎成100%(1g/mL)的中藥原液。

1.2.2 ELISA所用抗小鼠CD3抗體(Anti-CD3)、抗小鼠1stAb、抗小鼠2ndAb、標(biāo)準(zhǔn)品(IL-10、IL-17、IFN-γ、IgG2a)試劑均購自BD公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara Bio公司，引物購自寶生物工程(大連)有限公司，H&E試劑購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 酶標(biāo)儀(infinite M200PRO)購自TECAN公司，冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5430 R)購自Eppendorf公司，恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-200D)購自上海智城分析儀器制造有限公司，熒光定量PCR儀(CFX96 Optic Module)購自BIO-RAD公司，冰凍切片機(jī)(HM525)購自Thermo scientific公司，紫外分光光度計(jì)(22331 Hamburg)購自Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立

將小鼠置于溫度為(20±2)℃、相對濕度為(35±5)℃的IVC通氣鼠框中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成4組。分別為正常組、藥物組(1.5g/kg)、感染組、感染+藥物組(1.5g/kg)，周期為21 d。正常組連續(xù)灌胃(無菌水，0.10mL/10g/d)21 d；藥物組連續(xù)灌胃(石榴健胃散，0.10mL/10g/d)21 d；感染組連續(xù)灌胃(無菌水，0.10mL/10g/d)21 d，第8 d給予一次細(xì)菌灌胃(C.rodentium，1×109CFU/只)處理；感染+藥物組連續(xù)灌胃(石榴健胃散，0.10mL/10g/d)21 d，第8 d給予一次細(xì)菌灌胃(C.rodentium，1×109CFU/只)處理。為避免肺部誤吸和降低樣本間的差異，小鼠需提前禁食8 h再給予細(xì)菌灌胃。

1.3.2C.rodentium活化和準(zhǔn)備

首先將儲存的C.rodentium(strain DBS100)凍存液于室溫解凍30 s，用無菌環(huán)在菌液表面輕輕刮取，在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌液渾濁，然后采用四區(qū)畫線法將細(xì)菌接種在麥康凱培養(yǎng)基平板上，并將平板置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。第二天用無菌環(huán)取平板上單個(gè)菌落置于裝有25 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶置恒溫培養(yǎng)振蕩器中(200rpm/min，37℃)過夜培養(yǎng)。第三天先用分光光度計(jì)測量菌液在600 nm處的光密度，然后將菌液在新的錐形瓶中稀釋成OD600nm為0.1的濃度繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)振蕩器中(200rpm/min，37℃)培養(yǎng)4～6 h，使菌液OD600 nm濃度至1～1.5(細(xì)菌生長對數(shù)期)，最后根據(jù)所需要的細(xì)菌總數(shù)取相應(yīng)菌液離心、PBS洗滌、再離心，加入所需體積無菌水。灌胃，完成造模。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材及標(biāo)本處理

收集感染后第2、6、10、13 d小鼠糞便涂板，觀察細(xì)菌定植及負(fù)荷。以CO2麻醉小鼠，用75%的酒精消毒后開腹。取腸系膜淋巴結(jié)研磨、計(jì)數(shù)、定量，以Anti-CD3刺激制備細(xì)胞上清液凍存于-80 ℃冰箱；測量結(jié)腸長度；取0.5 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸用OCT包埋做冰凍切片；以PBS沖洗結(jié)腸糞便，剪碎結(jié)腸組織凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 表觀指標(biāo)觀測

間隔一日觀測小鼠體重變化，注意小鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)，關(guān)注小鼠腹瀉情況。

1.5 IgG2a含量檢測

采用ELISA法檢測：將小鼠新鮮血液收集于1.5 mL的EP管中，于室溫靜置2 h離心(6000rpm/min，15min)，分裝血清(50μL/管。防止反復(fù)凍融)，按照常規(guī)方法檢測IgG2a含量。

1.6 腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中相關(guān)炎癥因子檢測

采用ELISA法檢測：取腸系膜淋巴結(jié)，用橡皮塞輕柔研磨、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，定量為每孔1×107個(gè)細(xì)胞，以Anti-CD3刺激，收集上清，余同IgG2a檢測步驟。γ-干擾素(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)含量檢測方法同上。

1.7 其他相關(guān)指標(biāo)檢測

采用熒光定量PCR法檢測：取凍存的結(jié)腸組織，根據(jù)RNA Trizol提取法提取組織中的RNA并檢測，保證其純度OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，調(diào)整其濃度在500～600 ng/μL之間，然后根據(jù)說明書進(jìn)行去基因組DNA、反轉(zhuǎn)錄步驟得到cDNA模板，最后通過熒光定量PCR法檢測相關(guān)指標(biāo)。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 體重

表2顯示，同一處理組小鼠在不同觀察天數(shù)、不同處理組小鼠在同一觀察天數(shù)的體重變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 不同組小鼠體重

2.2 結(jié)腸長度

表3顯示，與正常組比較，感染組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.05)。與感染組相比，感染+給藥組小鼠結(jié)腸長度明顯增長(P<0.05)，并且與藥物組相比，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示石榴健胃散干預(yù)能緩解Cr細(xì)菌感染引起的結(jié)腸長度縮短情況。

表3 不同組小鼠結(jié)腸長度

2.3 排菌量

表4顯示，對小鼠連續(xù)排菌量使用重復(fù)測量法統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示同一組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的排菌量存在明顯差異(F=13.386，P=0.001)，不同組小鼠排菌量在同一時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(F=0.343，P=0.795)。與感染組相比，感染+給藥組排菌量稍有增加，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果提示石榴健胃散干預(yù)在早期不會影響C.rodentium在小鼠體內(nèi)的定植。

表4 兩組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的排菌量

2.4 血清IgG2a抗體濃度

表5顯示，與正常組比較，感染組小鼠血清IgG2a抗體表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與感染組比較，感染+藥物組小鼠血清抗體亦顯著增加(P<0.05)，結(jié)果提示石榴健胃散的干預(yù)能夠促進(jìn)機(jī)體IgG2a表達(dá)。

表5 不同組小鼠血清IgG2a抗體濃度

2.5 腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子濃度

表6顯示，與對照組比較，感染組IFN-γ、IL-17、IL-10含量均顯著升高(P<0.05)；與感染組比較，感染+給藥組IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量顯著升高(P<0.05)，IL-17含量無明顯變化，結(jié)果提示石榴健胃散干預(yù)能夠抑制炎癥因子IFN- γ表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子IL-10表達(dá)。

表6 不同組別小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞因子濃度

2.6 細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量

表7顯示，與正常組相比，感染組IFN-γ、TNF-α、T-bet、IL-17、RORrt、IL-10 mRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)；與感染組相比，感染+藥物組IFN-γ、TNF-α、T-bet mRNA表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，IL-17、RORrt mRNA表達(dá)量無明顯變化，IL-10 mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。結(jié)果顯示C.rodentium感染會促進(jìn)Th0向Th1和Th17方向分化，石榴健胃散干預(yù)能夠抑制Th0向Th1方向分化，對Th0向Th17方向的分化無明顯影響。

表7 不同組小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況

2.7 H.E.染色結(jié)果

H.E.染色結(jié)果見圖1。正常組小鼠結(jié)腸病理圖片顯示，腸上皮細(xì)胞緊密排列，腸上皮結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞和炎性細(xì)胞數(shù)目較少。藥物組小鼠結(jié)腸病理圖片與正常組無明顯差異。在感染組小鼠結(jié)腸病理圖片中可以看到腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的脫落(如箭頭所示)及隱窩的延長和杯狀細(xì)胞的增多，并可見炎性細(xì)胞增多，局部出現(xiàn)淋巴濾泡。感染+給藥組小鼠病理結(jié)果顯示腸上皮結(jié)構(gòu)在一定程度上保持完整，炎癥細(xì)胞聚集減少，伴隨杯狀細(xì)胞的明顯增多，隱窩延長現(xiàn)象同樣存在，從整體看，結(jié)腸組織損傷較輕。上述結(jié)果顯示石榴健胃散在一定程度上能夠降低細(xì)菌感染導(dǎo)致的結(jié)腸組織損傷。

A：正常組；B：藥物組；C：感染組；D：感染+藥物組

3.討論

炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一組病因不明的慢性、易復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)。C.rodentium感染模型是國際公認(rèn)的一種嚙齒類動(dòng)物IBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。C.rodentium是一種細(xì)胞外鼠特異性病原體，主要通過利用A/E病變與粘膜炎癥結(jié)合來定植于腸上皮屏障表面。C.rodentium感染小鼠時(shí)主要定植于結(jié)腸和盲腸的管腔和粘膜表面[2]，通常表現(xiàn)出體重減輕、腹瀉、隱窩增生、杯狀細(xì)胞丟失和淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等各種炎性細(xì)胞浸潤結(jié)腸固有層，導(dǎo)致結(jié)腸炎形成。宿主對C.rodentium的免疫反應(yīng)主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞大量浸潤到結(jié)腸固有層，上皮CD8+T細(xì)胞略有增加[3]。因此，本研究主要從CD4+T細(xì)胞的方向，研究石榴健胃散干預(yù)在C.rodentium感染中的免疫調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)宿主受到C.rodentium感染后，機(jī)體會出現(xiàn)明顯的Th1反應(yīng)增強(qiáng)[4]，主要表現(xiàn)在IFN-γ、TNF-α的表達(dá)量增高，這些炎癥因子的增加會破壞線粒體磷酸化功能[5]，線粒體功能障礙促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腸上皮屏障破壞[6]；同時(shí)，IFN-γ、TNF-α表達(dá)的增加會降低粘膜表面粘蛋白含量、杯狀細(xì)胞的豐滿度和影響粘膜形態(tài)的完整性[7]，使細(xì)菌與上皮細(xì)胞接觸增加，引發(fā)炎癥反應(yīng)過度，進(jìn)而加重結(jié)腸組織損傷。因此，抑制Th1反應(yīng)有助于保護(hù)宿主免受C.rodentium導(dǎo)致的組織損傷。本研究顯示，感染組小鼠IFN-γ、TNF-α、T-bet轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)升高，在給予石榴健胃散干預(yù)的感染小鼠中，這些指標(biāo)出現(xiàn)下降趨勢，提示石榴健胃散干預(yù)可能通過抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向的分化，抑制Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α炎癥因子來保護(hù)結(jié)腸組織。

最新研究顯示，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也參與了宿主對C.rodentium感染的防御。然而，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)存在雙重作用[8]：一方面Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有益于宿主，通過阻礙細(xì)菌向全身器官的擴(kuò)散來遏制粘膜炎癥的繼續(xù)發(fā)展；另一方面，在感染早期，細(xì)菌正是通過Th17炎癥反應(yīng)黏附于腸上皮細(xì)胞上，并與腸道內(nèi)其他微生物競爭腸道營養(yǎng)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)更大的定植[9]。有研究發(fā)現(xiàn)感染后期IL-17的表達(dá)有利于機(jī)體對細(xì)菌的清除，IL-17通過招募中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位清除體內(nèi)定植的細(xì)菌。本研究顯示，石榴健胃散干預(yù)并不會影響細(xì)菌感染導(dǎo)致的IL-17的高表達(dá)。

IL-10是常見的炎癥抑制因子，主要由Treg細(xì)胞分泌。IL-10對于宿主清除體內(nèi)定植的細(xì)菌無促進(jìn)作用。然而，有研究顯示，CD4+T細(xì)胞缺乏IL-10會加重IFN-γ、IL-17促炎因子的表達(dá)[10]。由此可知，IL-10主要通過發(fā)揮免疫抑制作用來阻礙過度的炎癥反應(yīng)引起的組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，石榴健胃散干預(yù)能促進(jìn)感染小鼠IL-10的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)造成的結(jié)腸組織損傷。

有研究指出，當(dāng)機(jī)體受到C.rodentium細(xì)菌感染后，細(xì)菌的清除主要依賴于B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白并非分泌性免疫球蛋白A(IgA)或IgM[11]，其中主要發(fā)揮清除作用的抗體是IgG2a[12]。由于B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫同樣需要T細(xì)胞激活介導(dǎo)[13]。在感染后12 d左右，CD4+T細(xì)胞才發(fā)揮對細(xì)菌的清除作用，IgG2a表達(dá)增加還不足以對細(xì)菌的清除在第13 d達(dá)到顯著效果。因此，本研究存在一定缺陷，對于糞便排菌量的觀察時(shí)間應(yīng)當(dāng)延長。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)石榴健胃散處理能促進(jìn)感染小鼠IgG2a的表達(dá)，提示石榴健胃散干預(yù)可能促進(jìn)B細(xì)胞的表達(dá)發(fā)揮細(xì)菌清除作用。

IBD的主要癥狀是腹瀉，中醫(yī)根據(jù)腹瀉這個(gè)主要癥狀一般將IBD歸于泄瀉這一疾病。中醫(yī)關(guān)于泄瀉的記錄早在《皇帝內(nèi)經(jīng)》中已有記載，如《素問氣交大論》記載“殤瀉”“注下”等病名。后世關(guān)于泄瀉的病因病機(jī)研究一直在完善。雖然泄瀉的病因病機(jī)復(fù)雜，但發(fā)病機(jī)理可以歸納為脾虛濕盛。泄瀉的病位在大腸，主病之臟在于脾，與肝、腎的關(guān)系同樣密不可分。石榴健胃散主要成分為溫性藥物，因此，臨床治療常用于寒性腹瀉?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，石榴籽主要含多種揮發(fā)油和脂肪酸，石榴籽油具有增強(qiáng)體液免疫和激活巨噬細(xì)胞的作用[14]；藏紅花活性成分主要為紅花黃素，能抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的表達(dá)[15]；肉桂主要有效成分為肉桂醛，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等具有抗炎活性[16]。概而言之，石榴健胃散具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，石榴健胃散的干預(yù)能夠通過抑制C.rodentium感染引起的Th1反應(yīng)的增強(qiáng)、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞參與體液免疫發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。