華國勇，郭建琴，李 旻，張曉巖，湯 鋒，李潤樂

(1.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810007；2.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001)

多房棘球絳蟲與其他寄生蟲一樣通過宿主獲取生命活動所必須的營養(yǎng)物質，其代謝脂類和氨基酸的能力有限，因此需要從外界攝入糖類作為主要的能量來源。多房棘球絳蟲本身無消化道，通過體表吸收宿主環(huán)境中的葡萄糖并以糖原形式儲存，以此維持自身能量代謝進行生命活動。葡萄糖作為一種極性分子它不能以自由擴散的方式通過細胞膜脂質雙層結構的疏水區(qū)，多數情況下需要葡萄糖轉運蛋白(GLUT)的協(xié)助[1，2]。GLUT1是目前所發(fā)現(xiàn)的分布最廣泛的轉運體，負責組織與血液間葡萄糖的轉運[3]。2018年Jun Matsumoto團隊[4]研究發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲攝取宿主葡萄糖的過程依賴EmGLUT1，如以葡萄糖轉運蛋白為抗原，能切斷多房棘球蚴能量來源從而抑制其增殖。本文擬對EmGLUT1結構進行預測，篩選其氨基酸序列中的非跨膜區(qū)域進行串聯(lián)，設計序列插入到原核表達載體中用以表達及純化，獲得純度較高的重組表位肽，為后續(xù)疫苗研究尋找有效工具。

1.材料與方法

1.1 材料

pCzn1載體、Artic express表達菌株(Zoonbio)；限制性內切酶Nde I和Xba I(Takara)；IPTG和氨芐青霉素鈉、質粒提取試劑盒，蛋白胨、酵母粉、DNA純化回收試劑盒(Tiangen)；兔抗His抗體、山羊抗兔IgG抗體(Bioss)；Ni-NTA sepharose(Make Research Easy)。

1.2 方法

1.2.1EmGLUT1跨膜結構預測

使用生物信息學軟件TMHM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對EmGLUT1蛋白進行跨膜結構在線預測。

1.2.2 表位肽的篩選及串聯(lián)設計

根據EmGLUT1蛋白跨膜結構預測結果，刪除位于跨膜結構區(qū)域的肽段，保留的表位肽段之間添加GS和KK氨基酸序列，以利于多肽鏈的空間構象和保持抗原的特異性，防止表位肽之間互相干擾。將設計的EmGLUT1表位肽命名為GLEP。

1.2.3 pCzn1-GLEP質粒構建

參照前期實驗方法[5，6]，對GLEP序列進行大腸桿菌密碼子偏愛性優(yōu)化，并添加限制性內切酶NdeI和XbaI酶切位點，序列如下(劃線區(qū)域為酶切位點)：

CATATGACCCATCTGCTGAATACCACCACACTGGGCAGTAATAGCAGCGAAATGCTGAAAGGTGCAAATGTTTCCAGTGATGGCAGCAACAGCGATGGTGTGGTTAATAAAATGCCATTTGTTCTGGTTAAAAAGCCGTCTCTGAATGGTCTGCTGAAAGGTGGTAGTATGCCTGAAACGAAAAACCGTACCTTTGATGAAGTGGCACGCGATCTGGCGTTTGGCAGCATTGTTGTTGGTAAACGTACAGCGGCACTGCAGAGCCCGGTTTTTACAAAAGAAGATGAAGAAGCGGCAACCGCACTGCGTCGTACCGATGATGATAGCAAAGTTGATGCGTAATCTAGA

上述序列送生工生物工程上海股份有限公司進行合成，經酶切、連接入pCzn1載體并轉化入大腸桿菌TOP10后，挑選陽性菌落并提取質粒，采用測序及酶切法判斷質粒pCzn1-GLEP構建是否成功。

1.2.4 pCzn1-GLEP重組表達菌構建及表達部位鑒定

1.2.5 GLEP可溶蛋白純化

將誘導表達后的菌液離心(4℃，10000r/min，5min)，收集菌體用緩沖液洗滌3次，加入蛋白純化上樣緩沖液進行超聲破碎(功率：70%；破碎3s暫停4s)，離心(4℃，10000r/min，10min)后收集上清用Ni-NTA-Sepharose親和層析法純化GLEP蛋白，獲得電泳純級的GLEP蛋白。使用His標簽抗體對重組蛋白進行免疫印跡檢測。

2.結果

2.1 GLUT1蛋白跨膜結構預測

生物信息學軟件分析結果如圖1所示，EmGLUT1為12次跨膜蛋白，跨膜區(qū)域為8-30、59-81、94-116、121-143、121-143、148-170、148-170、264-286、301-323、332-354、369-391、404-423、433-452；細胞內區(qū)域為1-7、82-93、144-147、203-263、324-331、392-403、453-509；細胞外區(qū)域為31-58、117-120、171-179、287-300、355-368、424-432，根據分析結果刪除跨膜區(qū)域及12次跨膜細胞內區(qū)域及氨基酸殘基小于5的序列區(qū)域，選定171-179、287-300、355-368和424-432跨膜胞外區(qū)及453-509胞內區(qū)共5個肽段為研究對象。

圖1 GLUT1蛋白跨膜結構預測圖

2.2 重組質粒pCzn1-GLEP酶切及測序驗證

重組質粒pCzn1-GLEP的雙酶切驗證顯示，大小約350 bp，與實際大小符合，且陽性克隆序列測序結果與預期序列吻合度達100%(經BLAST比對)，如圖2～3所示。

M：DNA標志物；1：pCzn1-GLEP陽性克隆質粒；2：pCzn1-GLEP經Nde I和Xba I雙酶切后的質粒

圖3 陽性克隆序列比對結果圖

2.3 重組蛋白GLEP表達部位鑒定

將重組表達菌株經誘導(0.4nM IPTG，26℃)，菌體用蛋白純化上樣緩沖液超聲破碎后，分別取菌體誘導前、誘導后、破碎后上清(可溶蛋白)及破碎后沉淀(包涵體蛋白)，用12%SDS-PAGE鑒定表達部位，結果如圖4所示，經IPTG誘導后，菌體出現(xiàn)與目的蛋白相一致的條帶(約13.3kDa，泳道2)，超聲破碎上清與沉淀物均在13.3kDa處出現(xiàn)明顯條帶，表明GLEP蛋白以可溶性蛋白和包涵體蛋白兩種形式表達。從后續(xù)大規(guī)模生產及蛋白空間結構的穩(wěn)定性考慮，選擇可溶性蛋白進行純化。

M：蛋白質分子質量標值；1：未經0.4nM IPTG誘導；2：經0.4nM IPTG誘導；3：誘導破碎后上清；4：誘導破碎后沉淀

2.4 重組蛋白GLEP純化

根據上述實驗結果，GLEP以可溶性蛋白的形式表達，因此將菌體破碎后上清經Ni-NTA-Sepharose純化，收集洗脫液，采用12%SDS-PAGE考查純化蛋白的純度。結果如圖5所示，純化后蛋白在13.3kDa左右處有明顯單一條帶，且未發(fā)現(xiàn)雜蛋白。

M：蛋白質分子質量標值；1：菌體經破碎后的樣品；2：樣品上樣后的流出樣；3～4：經250nM咪唑洗脫后的樣品

為檢測純化后GLEP蛋白的純度及其特異性，采用His抗體對GLEP蛋白進行免疫印跡檢測，結果如圖6所示，純化后的GLEP能特異性的與His抗體結合，未見其他條帶，表明經Ni-NTA親和柱層析獲得了目的蛋白GLEP。

M：蛋白質分子質量標值；1：純化后的GLEP

3.討論

近年來，包蟲病基礎研究一直致力于尋找具有良好抗原性和免疫原性的抗原，因為棘球絳蟲具有復雜的生命周期且體外培養(yǎng)困難，阻礙了對免疫現(xiàn)象和相關機制的研究[7，8]。盡管如此，在細粒棘球絳蟲中也發(fā)現(xiàn)了一些優(yōu)勢抗原具有良好的抗原性，如EG95[9]、EgB[10，11]、Eg mefAg-1[12]等，這些抗原蛋白大多數為膜蛋白和分泌蛋白。與寄生蟲營養(yǎng)相關的一些蛋白具有預防性，如日本血吸蟲腺苷酸轉運蛋白[13]、精氨酸轉運RNA酶[14]、谷胱甘肽S-轉移酶[15]等。

寄生蟲經過漫長的演化適應了宿主環(huán)境，像絳蟲消化系統(tǒng)完全消失，主要依靠皮層主動運輸營養(yǎng)物質并輸入實質組織中以糖原形式儲存。寄生蟲主要的營養(yǎng)物質為葡萄糖，大部分寄生蟲從宿主獲取葡萄糖均依靠Na+葡萄糖協(xié)同轉運蛋白實現(xiàn)，目前葡萄糖轉運蛋白家族包含14個具有共同結構特征但功能不同的亞型，都含有跨膜12次的結構域、位于細胞質側的N-和C-末端以及N-糖基化位點。Jun Matsumoto等[4]研究發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴中可檢測到兩種葡萄糖轉運蛋白(EmGLUT1和EmGLUT2)，其中EmGLUT1是一種易化擴散的葡萄糖轉運體，不依賴Na+和H+對葡萄糖有高度特異性，而EmGLUT2是與寄生蟲發(fā)育無關的轉運蛋白。因此EmGLUT1可能是多房棘球蚴從宿主環(huán)境獲取葡萄糖的一個重要轉運體，本文表達和純化EmGLUT1是為后續(xù)疫苗研究尋找有力工具。

跨膜蛋白采用原核表達時，其細胞器較簡單，無法像真核細胞一樣對蛋白質進行修飾、包裝并分泌，并且跨膜蛋白中含有大量的疏水性序列會對蛋白質的翻譯過程產生抑制作用，較難表達，并且在表達過程中如與原核膜結構融合會形成毒性[16]，因此很難在原核表達系統(tǒng)內表達和純化。目前真核表達系統(tǒng)常用哺乳動物細胞、昆蟲細胞和酵母表達系統(tǒng)，雖然它們表達蛋白活性高，對于需要多修飾的蛋白易于表達，但存在成本高、表達量低、篩選時間長等問題，原核表達系統(tǒng)成本低廉、速度快、表達量高等優(yōu)勢有利于后續(xù)疫苗的研發(fā)及推廣，因此仍然選擇原核表達系統(tǒng)。

葡萄糖轉運體(sGLT)以易化擴散的形式進行葡萄糖轉運，其12次跨膜結構是完成其易化擴散的關鍵結構，因此以該結構作為抗原誘導機體產生抗體或能夠達到抑制其功能的目的。通常情況下，一般對于跨膜蛋白的原核表達選擇胞外肽段進行原核表達，如EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)[17]、跨膜蛋白P185[18]、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體[19]、雞細胞毒性T細胞相關抗原-4(CTLA-4)[20]等。因此本文通過對EmGLUT1跨膜結構的預測，刪除該氨基酸序列中跨膜和部分胞內區(qū)域，選定171-179、287-300、355-368、424-432跨膜胞外區(qū)及453-509胞內區(qū)共5個肽段，使用柔性序列KK和GS將其間隔并加以連接，以保證各表位肽之間的獨立性和特異性，避免相鄰表位肽連接部位出現(xiàn)新的表位，使各表位獨立發(fā)揮免疫原性。本文將串聯(lián)后的GLEP序列插入到pCzn1載體中，該載體能夠低溫誘導蛋白表達，促進可溶蛋白的產生，因此采用26 ℃誘導目的蛋白表達，GLEP以可溶性蛋白表達，形成的融合蛋白穩(wěn)定性較好，經Ni-NTA親和柱層析純化后獲得電泳純級的GLEP蛋白，并通過His標簽抗體對重組蛋白進行免疫印跡驗證。在此建立的GLEP表達及純化方法，為后續(xù)疫苗研究提供了有力工具。