鄭良璐，王 剛，吳 穹

(1.青海大學(xué)，青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，810000，青海 西寧；2.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，510900，廣東 廣州)

研究表明，炎癥反應(yīng)與糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。因此，具有抗炎功效的十八味訶子利尿丸在臨床上用于治療DN，但其作用機(jī)制不明，本研究擬通過RAGE-NF-κB炎癥信號通路探討十八味訶子利尿丸對DN的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級4周齡雄性Sprague Dawley( SD)大鼠30只，體質(zhì)量80～100 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號【SCXK( 陜)2017-003】。每籠喂養(yǎng)2只，室溫( 22±2)℃，相對濕度65%～75%，燈光設(shè)置為12小時的明暗循環(huán)(早上8點(diǎn)開燈)。予自由攝食(水)。在研究開始之前，所有動物的血糖正常，尿液蛋白為陰性。動物飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房(SYXK(青)2016-0001)。本研究經(jīng)青海大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥物與試劑

十八味訶子利尿丸(青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司，批號為2008107)；STZ( Sigma公司)；檸檬酸鈉無菌緩沖液(Solarbio公司)；RAGE、IL-6、IL-1β兔克隆抗體(biossantibodies公司，批號分別為Bs-0177R、Bs-4539R、Bs-0812R)；NF-κB P65兔克隆抗體(affbiotech公司，批號為AF5006)；TNF-α兔克隆抗體(proteintech公司，批號為17590-1-ap)；β-actin兔克隆抗體(abclonal公司，批號為AC026)；兔多克隆抗體NF-κB P65、RAGE、IL-6、IL-1β(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為bs-0465R、bs-0177R、bs-4539R、bs-0812R)；兔多克隆抗體TNF-α(abcam公司，批號為ab6671)。

1.1.3 主要儀器

卓越金采血糖儀及試紙(Roche公司)；DW-86L386超低溫冰箱(中國海爾集團(tuán))；H2050R高速低溫離心機(jī)(中國湘儀集團(tuán))；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)(中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(中威電子儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h后選取20只喂以高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料上加10%蔗糖、10%豬油、1%膽固醇、0.3%膽酸鈉)，喂養(yǎng)12 w后于尾靜脈一次性注射STZ溶液[注射劑量：25mg/kg。將STZ溶于檸檬酸鈉無菌緩沖液(0.1mmol/L)，配制成2%的STZ溶液]，在注射后第3、7 d測尾靜脈血糖，以7 d隨機(jī)血糖高于16.7 mmol/L視為糖尿病大鼠造模成功。繼續(xù)用原飼料喂養(yǎng)大鼠5 w，收集24 h尿液，以24 h尿蛋白≥30 mg視為DN大鼠造模成功。其余10只作為對照組喂以普通飼料，喂養(yǎng)12 w后于尾靜脈一次性注射等量的檸檬酸鈉無菌緩沖液，繼續(xù)用原飼料喂養(yǎng)5 w。將造模成功的大鼠分為模型組(n=9)、藏藥組(n=9)。藏藥組予十八味訶子利尿丸灌胃(丸藥研細(xì)粉，過100目篩，用蒸餾水配置成混懸液，給藥劑量0.3g/kg)。對照組和模型組均予等容量的生理鹽水。連續(xù)灌胃2 w。

1.2.2 標(biāo)本收集及指標(biāo)測定

藥物灌胃結(jié)束當(dāng)天，大鼠禁食12 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉(300mg/kg)大鼠，處死大鼠后取雙側(cè)腎臟，經(jīng)腎門冠狀面切取組織用4%多聚甲醛固定用于HE染色；部分腎組織置-80 ℃冰箱保存用于WB檢測；取若干約1 mm3體積大小的腎組織置4%多聚甲醛液中固定，用于免疫組化檢測。

1.2.3 切片制作

切片：組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋、切片、染色、封片而成，可在光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀察。

1.2.4 Western blot檢測

取大鼠腎組織，裂解，離心后取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、孵育(抗體)、顯影、定影，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 免疫組化染色

以常規(guī)方法做免疫組化染色。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 腎臟病理結(jié)構(gòu)

對照組腎小球未見毛細(xì)血管基底膜或基質(zhì)增生，無變性、壞死及纖維化；腎小管結(jié)構(gòu)較為完整，間質(zhì)內(nèi)無充血及炎細(xì)胞浸潤；髓質(zhì)集合管結(jié)構(gòu)完整清晰，未見變性、壞死和脫落。模型組腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎小管呈蛋白管型，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。藏藥組腎組織病理損傷有不同程度的改善。詳細(xì)情形見圖1。

對照組 模型組 藏藥組

2.2 大鼠腎組織炎癥因子蛋白水平

與對照組比，模型組RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，藏藥組RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。黃色或棕黃色為陽性表達(dá)。對照組RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β在腎小管細(xì)胞胞漿內(nèi)僅見少量表達(dá)，與對照組比，模型組黃色或棕黃色區(qū)域增加，顏色深度明顯增強(qiáng)，與模型組比，藏藥組黃色或棕黃色表達(dá)區(qū)域減少，顏色深度變淺，詳細(xì)情形見圖2。

表1 各組大鼠腎組織RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)量

2.3 炎性因子水平

與對照組比，模型組大鼠腎組織NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與模型組比，藏藥組大鼠腎組織NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2，詳細(xì)情形見圖3。

圖2 各組大鼠腎組織RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)圖

表2 Western blotting檢測各組大鼠腎組織RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)量的變化結(jié)果

圖3 十八味訶子利尿丸對雄性DN大鼠腎組織RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)的影響圖

3.討論

本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飲食加STZ尾靜脈注射制備DN大鼠模型。模型大鼠腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎小管呈蛋白管型，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，顯示DN大鼠造模成功。經(jīng)十八味訶子利尿丸治療后，腎臟病理損傷明顯好轉(zhuǎn)，提示十八味訶子利尿丸對DN大鼠腎組織有保護(hù)作用。

越來越多的研究證明炎癥反應(yīng)在DN發(fā)病中起重要作用。RAGE是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族的一種模式識別受體[2]，該受體由一個胞外區(qū)域(一個V型和兩個C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)、一個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短的細(xì)胞質(zhì)尾部組成[3]。細(xì)胞外區(qū)域可以結(jié)合多種配體，長期高糖刺激致RAGE表達(dá)增強(qiáng)[4]，與配體(如晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs)相互作用激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NADPH氧化酶和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路[5]，其中NF-κB的激活在DN的腎臟炎癥進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[6]。NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，包括5個亞單位(Rel、p65、RelB、p50、p52)，其中屬NF-κB通路蛋白家族重要組成之一的p65蛋白，能加速炎癥因子的表達(dá)[7]，一旦NF-κB被激活，就會進(jìn)一步激活其下游促炎因子如RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，導(dǎo)致DN的惡化[8]。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，在DN小鼠模型中，RAGE基因失活可明顯抑制DN早期和晚期的腎臟功能及結(jié)構(gòu)改變，包括蛋白尿和血清肌酐增加及腎臟增大、系膜擴(kuò)張、腎小球細(xì)胞數(shù)量增加、晚期腎小球硬化，且腎臟損傷程度與RAGE基因劑量成正比[9]。研究表明TNF-α可能通過改變腎小球的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變具有血管收縮和血管舒張作用的物質(zhì)之間的平衡，從而導(dǎo)致腎血流減少和血管通透性增加[10]，IL-6與內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變、系膜細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)以及纖維連接蛋白表達(dá)的增加有關(guān)[11]。尿白蛋白排泄率與腎臟IL-6、TNF-α表達(dá)增加顯著相關(guān)[12]。IL-1β能激活固有系膜細(xì)胞釋放生長因子增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)腎臟損害[13]。產(chǎn)生的RAGE、TNF-α反過來繼續(xù)刺激NF-κB，形成惡性循環(huán)[14]，從而加重DN炎癥進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，模型組NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，經(jīng)十八味訶子利尿丸干預(yù)后表達(dá)下降，提示十八味訶子利尿丸可通過抑制RAGE-NF-κB炎癥信號通路減輕腎臟損傷。

綜上所述，十八味訶子利尿丸可以改善DN大鼠腎臟組織病理損傷，減輕腎臟炎癥損傷，其機(jī)制可能與抑制RAGE-NF-κB炎癥通路有關(guān)。