王曉婷 黃 健 劉 云 宋書群 李才文

不同氮濃度對紅色赤潮藻()生長、孢囊形成和生源要素組成的影響*

王曉婷1黃 健1劉 云2, 3, 4①宋書群2, 3, 4李才文2, 3, 4

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003; 2. 中國科學院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室 青島 266237; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071)

為闡明紅色赤潮藻()對氮營養(yǎng)條件的適應機制, 本研究在不同氮濃度條件下對紅色赤潮藻進行一次性培養(yǎng), 系統(tǒng)研究了氮濃度對紅色赤潮藻生長、休眠孢囊形成和細胞生源要素組成的影響。結果顯示, 紅色赤潮藻生長率隨著初始氮濃度的增加而增大, 200 μmol/L氮添加組生長率最大, 為0.79 /d。不同氮處理組細胞形態(tài)存在差異, 低氮條件下藻細胞個體變小。培養(yǎng)第6天, 各氮處理組均觀察到休眠孢囊, 且隨著培養(yǎng)時間的延長, 孢囊數量逐漸增多; 50 μmol/L氮添加組孢囊形成率最高, 為2.95%±0.16%。氮濃度對紅色赤潮藻細胞生源要素組成有顯著影響, 紅色赤潮藻胞內碳、氮含量隨氮濃度的升高而增加, 其C:N:P也隨氮濃度的增加而增加。紅色赤潮藻生長過程中, 加氮處理組細胞在指數期碳、氮、磷含量較低, 穩(wěn)定期含量較高; 相關性分析表明, 紅色赤潮藻胞內碳、氮、磷含量與藻生長率之間呈顯著負相關關系(< 0.05)。不同氮濃度對紅色赤潮藻的生長、休眠孢囊形成和藻細胞生源要素組成有顯著影響, 為揭示紅色赤潮藻對氮營養(yǎng)條件的適應機制提供參考。

紅色赤潮藻; 氮濃度; 藻生長; 休眠孢囊; 生源要素組成

紅色赤潮藻()是一種在全球范圍內廣泛存在的海洋裸甲藻類, 常見于沿岸和河口地區(qū), 屬于廣溫廣鹽性物種, 營混合型營養(yǎng)生活, 并有較高的生長速率(吳玉霖等, 2001; Matsubara, 2007)。自2004年以來, 紅色赤潮藻在我國廈門、煙臺、深圳等地多次引起有害藻華(王金輝等, 2005; 喻龍等, 2009; 陳國斌, 2012; 馬方方等, 2018)。紅色赤潮藻藻華對無脊椎動物、鮑魚幼蟲、魚類和海鳥危害顯著(Horner, 1997; Botes, 2003; Jessup, 2009), 對漁業(yè)、水產養(yǎng)殖業(yè)造成了直接經濟損失。

甲藻在不利于營養(yǎng)細胞生長的條件下, 通過產生孢囊來度過不良環(huán)境。在已知的大約2000種海洋甲藻中, 超過10%會產生孢囊(Bravo, 2014)。孢囊具有厚的囊壁, 能耐受不良環(huán)境條件和抵御病毒、寄生蟲的侵襲(唐贏中等, 2016; Liu, 2020b)。Tang等(2015)首次記錄了紅色赤潮藻休眠孢囊形成與萌發(fā)全過程, 證實該藻可以通過有性生殖形成休眠孢囊, 但目前為止, 紅色赤潮藻休眠孢囊形成機制仍未闡明。

前期, 我們在進行紅色赤潮藻室內培養(yǎng)時, 發(fā)現氮營養(yǎng)對該藻生長特征、生化組成及光合特性產生顯著影響(Liu, 2019, 2020a)。紅色赤潮藻生理生化特征的改變, 必將對藻細胞生源要素組成產生影響。因此, 本文系統(tǒng)研究了不同氮濃度對紅色赤潮藻生長、休眠孢囊形成及細胞內碳(C)、氮(N)、磷(P)含量的影響, 為揭示該藻對氮營養(yǎng)條件的適應機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

本實驗所用紅色赤潮藻藻種于2019年5月采集于青島浮山灣海域, 經毛細管分離、純化單細胞后, 于實驗室內長期保種及培養(yǎng)。使用f/2 (不含Si)培養(yǎng)基, 培養(yǎng)溫度(20±1) °C, 光暗比為12 h : 12 h, 光照強度為3000 lx。培養(yǎng)所用海水取自青島太平灣海域, 鹽度為30±0.1, 經0.22 μm 孔徑混合纖維膜過濾后, 121 °C高溫滅菌30 min后使用。

1.2 培養(yǎng)實驗

實驗組培養(yǎng)液體積為180 mL, 置于250 mL錐形瓶中,取生長良好的指數期藻種, 按比例接種至培養(yǎng)液中, 接種后的初始藻密度約為500 cells/mL。實驗共設6個氮濃度(NaNO3)處理組, 初始氮濃度分別為0、25、50、100、200、883 μmol/L, 其余營養(yǎng)鹽按照f/2 (不含Si)配方添加。每個處理組設3個平行, 置于培養(yǎng)箱中進行一次性培養(yǎng), 其他培養(yǎng)條件同1.1。培養(yǎng)過程中, 隔天取1 mL 樣品, 置于24孔板中, 在顯微鏡(Olympus, IX71)下觀察、計數孢囊。然后向孔板中加入2.5 μL Lugol’s 碘液, 混合均勻, 取100 μL樣品在顯微鏡下計數營養(yǎng)細胞, 每個樣品計數兩次。

紅色赤潮藻生長率()用公式(1)計算:

式中,N表示時刻細胞密度(cells/mL);N-2表示-2時刻細胞密度(cells/mL)。

使用Olli等(2002)中描述的方法計算孢囊形成率(%), 并使用以下公式(2)計算:

式中,表示營養(yǎng)細胞密度(cells/mL);表示孢囊密度(cysts/mL)。

1.3 紅色赤潮藻細胞生源要素組成分析

1.3.1 微藻培養(yǎng) 實驗組培養(yǎng)液體積為750 mL, 置于1 L錐形瓶中進行一次性培養(yǎng), 初始藻密度約為800 cells/mL。實驗設置3個氮濃度(NaNO3)處理組, 添加氮濃度分別為0、100、883 μmol/L, 每個處理組設3個平行, 其他培養(yǎng)條件同1.1。在培養(yǎng)的第16 d, 每個培養(yǎng)組隨機選擇30個細胞, 測量細胞大小。

1.3.2 藻體碳、氮含量測定 微藻培養(yǎng)方法同1.3.1, 在培養(yǎng)的第0、2、4、6、8、12、16 d, 用GF/F 濾膜(450 °C, 10 h)低壓(<0.04 MPa)抽濾40—60 mL藻液。濾膜于60 °C烘干24 h, 稱重后, 使用元素分析儀(Elementar, vario Macro cube)測其碳、氮質量。

1.3.3 藻體磷含量測定 微藻培養(yǎng)方法同1.3.1, 在培養(yǎng)的第0、2、4、6、8、12、16 d, 用GF/F濾膜(450 °C, 10 h)低壓(<0.04 MPa)抽濾40—60 mL藻液。將濾膜置于10 mL樣品瓶(450 °C, 10 h)中, 加入2 mL 0.017 mol/L MgSO4溶液于60 °C條件下烘干72 h, 馬弗爐灼燒2 h, 降溫后加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液, 85 °C下烘烤30 min。采用磷鉬藍比色法測定溶液中磷含量(張海云等, 2013)。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

不同處理組藻生長率、孢囊形成率及生源要素組成差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計, 統(tǒng)計軟件為SPSS 19.0; 以< 0.01為差異極顯著,< 0.05為差異顯著。采用Pearson相關性分析法對紅色赤潮藻細胞生源要素組成與生長率及細胞干重進行相關性分析并制圖, 軟件為R 2.5.6。

2 結果

2.1 不同氮濃度對紅色赤潮藻生長的影響

不同氮濃度條件下紅色赤潮藻的生長如圖1所示。結果表明, 培養(yǎng)第2 d, 所有氮處理組的細胞密度逐漸增加, 第4 d各處理組之間的細胞密度有顯著性差異(< 0.05)。培養(yǎng)第8 d時, 各處理組細胞生長逐步進入穩(wěn)定期, 細胞密度隨著初始氮濃度的增加而增大(883 μmol/L組除外), 中氮處理組(100和200 μmol/L)的細胞密度分別為(15737±844)、(18487±584) cells/mL, 是0 μmol/L氮添加組的2.3、2.6倍(圖1a)。

不同氮濃度對紅色赤潮藻的生長率有顯著影響(< 0.05)(圖1b)。低氮(0、25、50 μmol/L)、中氮(100和200 μmol/L)添加組的生長率分別在第4、6 d達到最大; 883 μmol/L氮添加組的生長率在培養(yǎng)前期呈下降趨勢, 14 d后其生長率增加。在0—200 μmol/L范圍內, 紅色赤潮藻最大生長率隨氮濃度的增加而增大, 0 μmol/L氮添加組最大生長率最小, 為0.56 /d; 200 μmol/L氮添加組的生長率最大, 為0.79 /d。883 μmol/L氮添加組的生長率要小于200 μmol/L處理組, 表明紅色赤潮藻在200 μmol/L氮濃度條件下其生長率已達到較高水平。

圖1 不同氮濃度條件下紅色赤潮藻的生長狀況

2.2 不同氮濃度對紅色赤潮藻休眠孢囊形成的影響

不同氮濃度條件下紅色赤潮藻休眠孢囊形成狀況如圖2所示。在培養(yǎng)第4 d, 低氮處理組(25、50 μmol/L)首先觀察到了休眠孢囊; 第6 d, 所有處理組均觀察到休眠孢囊。培養(yǎng)第6—8 d, 各處理組休眠孢囊數量較低, 且各組之間沒有顯著差異(> 0.05 ); 培養(yǎng)第10 d后, 各處理組之間孢囊密度出現顯著性差異(< 0.05), 且休眠孢囊數量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增多; 第20 d時, 883 μmol/L處理組孢囊數量是其他處理組的2—3.5倍(圖2a)。

培養(yǎng)的第6—14 d, 各處理組的孢囊形成率沒有顯著差異(> 0.05 )。從16 d開始, 不同氮處理組孢囊形成率出現顯著差異(< 0.05); 第20 d時, 0—50 μmol/L氮添加組孢囊形成率隨著初始氮濃度的升高逐漸增高, 50 μmol/L處理組最高, 為2.95%±0.16%; 隨著氮濃度的進一步增加, 孢囊形成率降低, 200 μmol/L處理組的孢囊形成率最低, 為1.05%±0.04% (圖2b)。

圖2 不同氮濃度條件下紅色赤潮藻休眠孢囊的形成狀況

2.3 不同氮濃度對紅色赤潮藻細胞干重的影響

不同氮濃度條件對紅色赤潮藻細胞干重的影響如圖3所示。加氮處理組(100和883 μmol/L)的單位藻液體積干重明顯高于0 μmol/L氮添加組。培養(yǎng)前6 d, 各處理組的單位藻液體積干重變化不大。第8 d開始, 883 μmol/L氮添加組的單位藻液體積干重呈增加趨勢, 且明顯高于其他兩個處理組(圖3a)。0 μmol/L氮添加組的細胞干重在整個培養(yǎng)過程中持續(xù)減少; 加氮處理組的細胞干重呈先減小后增大的變化趨勢, 第16 d時, 紅色赤潮藻細胞干重隨著初始氮濃度的增加而增大(圖3b)。

此外, 不同氮濃度條件下, 紅色赤潮藻細胞大小呈現顯著差異(< 0.05), 初始氮濃度越高, 細胞個體越大。高氮處理組(883 μmol/L)的藻細胞長(59.61± 1.95) μm, 寬(40.66±1.59) μm, 細胞個體明顯大于0和100 μmol/L氮添加組(表1)。

圖3 不同氮濃度對紅色赤潮藻細胞干重的影響

表1 不同氮濃度條件下紅色赤潮藻的細胞大小

Tab.1 Cell size of A. sanguinea in different nitrogen concentrations

2.4 不同氮濃度對紅色赤潮藻細胞生源要素組成的影響

不同氮濃度對紅色赤潮藻的碳含量有顯著影響(< 0.05)。整個培養(yǎng)過程中, 0 μmol/L氮添加組的單位藻液體積碳含量處于較低水平且呈下降趨勢; 加氮處理組(100和883 μmol/L)的單位藻液體積碳含量明顯高于0 μmol/L氮添加組。883 μmol/L氮添加組的藻液體積碳含量逐漸增加, 在第12 d達到最大, 為(24.73±0.97) mg/L (圖4a)。0 μmol/L氮添加組的胞內碳含量在16 d內呈下降趨勢; 100 μmol/L氮添加組的胞內碳含量先減少后增加, 在第16 d達到最大, 為(7.15±0.24) ng/cell; 883 μmol/L氮添加組的胞內碳含量始終高于其他兩個處理組, 在第16 d達到最大, 為(10.94±0.004) ng/cell (圖4b)。

不同氮濃度對紅色赤潮藻的氮含量有顯著影響(< 0.05)。整個培養(yǎng)過程中, 0 μmol/L氮添加組的單位藻液體積氮含量都處于較低水平; 加氮處理組(100和883 μmol/L)的單位藻液體積氮含量顯著高于0 μmol/L氮添加組; 883 μmol/L氮添加組的單位藻液體積氮含量呈增加趨勢, 在第16 d達到最大, 為(4.79± 0.55) mg/L (圖4c)。三個處理組的胞內氮含量在整個培養(yǎng)過程中都呈先減少后增加的趨勢, 883 μmol/L氮添加組的胞內氮含量始終高于其他兩個處理組, 第16 d達到最大, 為(2.04±0.087) ng/cell (圖4d)。

在整個培養(yǎng)過程中, 三個氮處理組的單位藻液體積磷含量無顯著差異(> 0.05) (圖4e)。紅色赤潮藻生長6—12 d, 0 μmol/L氮添加組的胞內磷含量顯著高于加氮處理組; 加氮處理組(100和883 μmol/L)的胞內磷含量先減少后增加; 第16 d, 各處理組的胞內磷含量無顯著差異(> 0.05) (圖4f)。

不同氮添加濃度對紅色赤潮藻的C:N:P有顯著的影響, 隨著氮濃度的增加, 藻體C、N、P比率逐漸增大。在紅色赤潮藻生長過程中, 含氮處理組的C:P、N:P隨培養(yǎng)時間的延長而增大(表2)。相關性分析表明, 單位細胞C、N、P含量與其生長率均呈顯著負相關關系(< 0.05), 與細胞干重呈極顯著正相關關系(< 0.01)。紅色赤潮藻藻體N:P 與細胞干重呈極顯著正相關關系(< 0.01)。

3 討論

3.1 不同氮濃度對紅色赤潮藻生長及休眠孢囊形成的影響

氮元素是浮游植物生長的必需元素, 參與合成浮游植物細胞的結構組分。本實驗中, 氮添加濃度對紅色赤潮藻的生長有顯著影響, 在0—200 μmol/L濃度范圍內, 最大細胞密度和生長率隨著氮添加量的增加而增大。在氮限制條件下, 紅色赤潮藻的細胞形態(tài)發(fā)生變化。劉云等人(2019)發(fā)現紅色赤潮藻細胞體積隨著培養(yǎng)液中氮的消耗而變小。本研究中, 0—50 μmol/L氮添加組在培養(yǎng)的第2—4 d細胞變小, 藻細胞分裂加快, 使得0—50 μmol/L氮添加組最先達到最大細胞密度和最大生長率。883 μmol/L氮添加組的生長率在培養(yǎng)的2—14 d逐漸下降, 培養(yǎng)一段時間后, 生長率開始增加, 但最大生長率仍低于200 μmol/L氮添加組。由于不同培養(yǎng)組細胞大小存在差異, 根據細胞密度計算得到的生長率不能完全反映生物量的變化, 由單位藻液體積干重或葉綠素濃度變化評價紅色赤潮藻的生長狀況更合理。此外, 不同氮磷比對藻細胞的生長有明顯的影響(孫軍等, 2004), 883 μmol/L氮添加組過高的氮磷比可能不利于紅色赤潮藻的生長, 該藻生長的最適氮磷比需要進一步實驗驗證。

圖4 不同氮濃度對紅色赤潮藻生源要素組成的影響

表2 不同氮濃度對紅色赤潮藻藻體化學組成比率的影響

Tab.2 Effects of different nitrogen concentrations on the chemical composition ratio of A. sanguinea

3.2 不同氮濃度對紅色赤潮藻細胞生源要素組成的影響

營養(yǎng)鹽濃度不僅會影響藻類的生長狀況和孢囊形成, 還會影響藻類細胞的生源要素組成。營養(yǎng)鹽缺乏時, 細胞新陳代謝減緩, 藻細胞內的碳水化合物和蛋白質合成減少, 導致其碳、氮含量降低(Stramski, 2002; 王燕等, 2011)。本研究中, 不同氮濃度對紅色赤潮藻碳、氮含量有顯著的影響, 該藻的胞內碳、氮含量隨氮濃度的升高而增加。在整個培養(yǎng)過程中, 0 μmol/L氮添加組的碳、氮含量顯著低于加氮處理組(100和883 μmol/L)。培養(yǎng)后期(12、16 d), 加氮處理組藻細胞生長速率下降, 胞內碳、氮含量增加, 這可能與細胞內碳水化合物、蛋白質和脂肪酸的積累有關(Liu, 2019)。藻體生源要素含量的改變可引起藻細胞干重變化, 二者之間呈顯著的正相關關系(圖5)。

圖5 紅色赤潮藻細胞生源要素與生長率及細胞干重的相關性分析

注: *< 0.05; **< 0.01; 紅色: 正相關; 藍色: 負相關

藻類對P的吸收方式為“奢侈”吸收, 當周圍環(huán)境中磷含量充足時, 某些藻類能吸收環(huán)境中的磷酸鹽并將其儲存在胞內, 以維持低磷時的細胞繁殖(張勝花等, 2013)。本實驗培養(yǎng)過程中, 不同處理組的單位藻液體積磷含量變化較小, 但胞內磷含量存在顯著差異, 0 μmol/L氮添加組的胞內磷含量顯著高于加氮處理組(100和883 μmol/L)。藻類對磷酸鹽的吸收受細胞大小的影響, 小個體藻細胞的吸收速率高于大細胞(Shen, 2007)。0 μmol/L氮添加組藻細胞個體變小, 利于其對磷酸鹽的吸收, 從而使該培養(yǎng)組胞內磷含量顯著增高。此外, 有研究表明, 在缺氮條件下, 藻細胞會大量吸收P元素以達到體內的生化平衡, 這是藻類自我調整的策略之一(羅曉霞等, 2018)。

一直以來, 將浮游植物的P配額理解藻類元素化學計量學的基礎, 在Redfield范式中, 其他主要的細胞成分都標準化為P含量(Fu, 2005)。經典Redfield定律認為藻類細胞組成的原子比率為 C:N:P=106:16:1, 該比率隨著藻類營養(yǎng)狀況和藻種類群而變化。本實驗中, 紅色赤潮藻的C:P和N:P隨氮濃度的增加而增加; 在培養(yǎng)過程中, 隨培養(yǎng)時間的延長而增加; 該趨勢與藻體C、N含量的變化趨勢一致。藻體C:N:P與Redfield比值相差較大, 0與100 μmol/L兩個處理組由于培養(yǎng)液中氮含量較低, N:P < 16:1, 從而導致藻細胞C:N:P小于Redfield值。而對于營養(yǎng)充足的883 μmol/L組, 在培養(yǎng)的前8 d, C:N:P也低于Redfield值, 可能是由于微藻對不同類型營養(yǎng)鹽的貯存方式不同引起的(Zhao, 2009; 曲瑩雪等, 2020)。有研究表明, 微藻磷庫包括吸附于細胞表面的磷庫和細胞內儲存的磷庫, 而碳、氮則無表面吸附現象, 受細胞表面吸附磷庫的影響, C:N:P低于Redfield比值( Sa?udo-Wilhelmy, 2004; Fu, 2005)。到了培養(yǎng)后期, 隨著細胞表面吸附的磷庫被藻細胞吸收, 藻體內含碳、氮化合物逐漸積累, 高氮處理組的C:N:P接近106:16:1。

紅色赤潮藻屬于廣溫廣鹽性種類, 在全球水體中廣泛分布, 并在多地引發(fā)赤潮。本研究通過室內實驗, 證實該種對低氮營養(yǎng)條件存在多種適應策略。首先, 該藻可通過減小細胞體積, 增大細胞比表面積, 增加藻細胞對營養(yǎng)鹽尤其是磷酸鹽的吸收; 其次, 低氮條件下, 該藻降低生長速率, 減少對氮營養(yǎng)的需求; 第三, 通過有性生殖形成休眠孢囊。休眠孢囊的形成有助于該藻度過不良環(huán)境條件, 為赤潮的年際復發(fā)提供種源, 且利于該藻擴大地理分布范圍。

4 結論

(1) 紅色赤潮藻生長率隨著初始氮濃度升高而增大, 200 μmol/L氮添加條件下該藻生長率最大。

(2) 不同氮濃度對紅色赤潮藻休眠孢囊的形成有顯著影響, 50 μmol/L氮添加組的孢囊形成率最高。

(3) 不同氮濃度對紅色赤潮藻細胞生源要素組成變化有顯著影響, 紅色赤潮藻的胞內碳、氮含量隨氮濃度的升高及藻的生長而增加。

(4) 紅色赤潮藻的C:P和N:P隨氮濃度的增加而增加, 隨培養(yǎng)時間的延長而增加。

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EFFECTS OF NITROGEN NUTRITION ON THE GROWTH, ENCYSTMENT AND BIOGENIC ELEMENTS COMPOSITION OF

WANG Xiao-Ting1, HUANG Jian1, LIU Yun2, 3, 4, SONG Shu-Qun2,3,4, LI Cai-Wen2, 3, 4

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China;4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

To classify the adaption mechanism ofto nitrogen, a batch culture ofwas carried out in different nitrogen concentrations. Changes in growth, resting cyst formation, and biogenic element composition were studied. The results show that the specific growth rate ofincreased with the increasing of nitrogen addition. The highest specific growth rate 0.79 /d was achieved in 200 μmol/L N-added treatment. Different cellular morphology was shown in different nitrogen conditions. Under low nitrogen conditions, the individual algae cells become smaller. On the 6th day of culture, resting cysts were observed in each nitrogen treatment group, and the number gradually increased with the extension of the culture time; the 50 μmol/L N-added treatment had the highest cyst formation rate at 2.95%±0.16%. Furthermore, the biogenic element composition changed significantly under different nitrogen concentrations. The C and N content inincreased with the increase of nitrogen concentration, and its C:N:P also increased with the increase of nitrogen concentration. During the growth of, the cellular content of C and N was lower in the exponential phase, while the content was higher in the stationary phase. The Pearson’s correlation analysis indicated that cellular C, N, and P contents correlated negatively with the growth rate of(<0.05). Different nitrogen concentrations had significant effects on the growth, resting cyst formation, and biogenic elements composition of. This study provided a reference for revealing the adaptation mechanism ofto a different condition of nitrogen nutrition.

; nitrogen concentration; growth; resting cysts; biogenic elements composition

* 山東省重大科技創(chuàng)新工程專項, 2018SDKJ0504-2號; 國家自然科學基金, 41976136號。王曉婷, 碩士研究生, E-mail: 2292254840@qq.com

劉 云, 副研究員, E-mail: liuyun4709@163.com

2020-12-23,

2021-01-28

X55

10.11693/hyhz20201200339