唐曉雯 范美華① 王超峰 廖 智 李 鵬 徐年軍 王健鑫①

外源CaCl2調(diào)控滸苔()高溫逆境的比較轉(zhuǎn)錄組研究*

唐曉雯1范美華1①王超峰1廖 智1李 鵬1徐年軍2, 3, 4, 5王健鑫1①

(1. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 舟山 316022; 2. 寧波大學(xué) 海洋生物技術(shù)與工程國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 寧波 315832; 3. 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315832; 4. 浙江海洋高效健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 寧波 315832; 5. 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315832)

鈣(Ca2+)作為一種必需的信號(hào)分子, 在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用BGISEQ平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序, 獲得滸苔外源CaCl2添加(UpCa)和高溫對(duì)照(UpHT)處理下相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 分析了在高溫(35 °C)下外源CaCl2的添加轉(zhuǎn)錄組的變化。結(jié)果顯示, 根據(jù)UpHT和UpCa處理分析共獲得36625條基因; 與UpHT相比, 在UpCa下鑒定出7513個(gè)差異表達(dá)的基因, 包括6002個(gè)上調(diào)基因, 1151個(gè)下調(diào)基因, 對(duì)差異基因進(jìn)行了GO富集和KEGG富集分析。對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析, 主要富集在內(nèi)吞(Endocytosis)、植物病原菌互作(Plant-pathogen interaction)、絲裂原激活的蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-plant)、植物激素的信號(hào)傳遞(Plant hormone signal transduction)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ABC transporters)和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)等代謝通路上。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中, 細(xì)胞分裂素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)。抗氧化酶中FeSOD、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和抗壞血酸過氧化物酶等基因表達(dá)上調(diào), 下調(diào)的基因主要是熱激蛋白。Ca2+信號(hào)組分基因鈣結(jié)合蛋白、鈣調(diào)素、鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶以及鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性3′,5′環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的基因表達(dá)上調(diào), 絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶和磷脂酰肌醇信號(hào)相關(guān)的基因也差異性上調(diào)。本研究系統(tǒng)闡述了植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化酶、MAPK信號(hào)系統(tǒng)以及Ca2+信號(hào)組分基因在外源CaCl2對(duì)滸苔高溫壓力的調(diào)節(jié)中的重要作用, 可為進(jìn)一步闡明Ca2+信號(hào)對(duì)高溫的調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

滸苔(); 外源氯化鈣; 轉(zhuǎn)錄組; 高溫

滸苔()是典型的大型綠藻, 屬于石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)。滸苔繁殖速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng), 是綠潮暴發(fā)的優(yōu)勢(shì)藻種, 在海洋生態(tài)平衡中發(fā)揮重要的作用。滸苔在生長過程中不可避免的受到高溫、光照和鹽度等環(huán)境變化的影響, 而溫度是限制滸苔生長和繁殖的關(guān)鍵因素(Fan, 2018)。其中, 高溫作為影響滸苔生長發(fā)育的關(guān)鍵因素, 越來越受到學(xué)者的高度關(guān)注。迄今為止, 已有學(xué)者相繼報(bào)道了溫度對(duì)滸苔生長發(fā)育或者分子機(jī)理的影響(李雪娜等, 2016; Fan, 2018)。

溫度的升高影響著滸苔的生活史, 導(dǎo)致滸苔形態(tài)和生理指標(biāo)發(fā)生變化, 影響孢子囊的形成、孢子釋放和幼苗成長(Wang,2016; Chávez-Sánchez, 2017; Li, 2017; Rybak, 2018)。高溫條件下, 大型海藻主要通過調(diào)節(jié)自身的生長發(fā)育過程來提高生存和繁殖能力, 特別是光合作用、基因的表達(dá)、蛋白質(zhì)的合成和代謝都有適應(yīng)性的改變, 而這些改變主要是通過植物信號(hào)響應(yīng)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。

鈣離子(Ca2+)作為植物信號(hào)系統(tǒng)中普遍存在的第二信使, 在植物的生長發(fā)育和非生物刺激調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。Ca2+信號(hào)也是響應(yīng)非生物刺激的關(guān)鍵信號(hào)。高溫脅迫下, 大型海藻會(huì)誘導(dǎo)一系列抗氧化物酶, 蛋白激酶以及Ca2+依賴性相關(guān)蛋白的表達(dá), 積累了多種糖和氨基酸代謝產(chǎn)物(Fan, 2018; He, 2018b)。高溫脅迫下, 在轉(zhuǎn)錄組水平主要涉及光合和能量代謝率降低, 抗氧化活性物質(zhì)的增加, Ca2+信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的熱休克蛋白(Hsp70)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和過氧化氫酶(CAT)等分子伴侶與自由基清除相關(guān)酶基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。另外, 篩選鑒定了參與Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藻類生長和植物激素生物合成的基因和蛋白(Im, 2015; Fan, 2017, 2018), 并且 Ca2+信號(hào)在應(yīng)激反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用。高溫下, 外源Ca2+處理使小麥鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)、HSP、SOD和APX基因的表達(dá)差異性上調(diào)(Goswami, 2015)。Ca2+在扁滸苔()中對(duì)銅脅迫的調(diào)節(jié)可能是通過CaMs或者CDPKs來激活抗氧化基因的表達(dá)(González, 2012); 外源Ca2+處理在一定程度上可提高杜氏鹽藻()對(duì)高滲脅迫和UV-B響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用(陳輝, 2011)。

綜上所述, 高溫影響了藻類的生長發(fā)育, Ca2+信號(hào)作為第二信使在高溫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用, 但是Ca2+信號(hào)對(duì)滸苔高溫脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚, 需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以滸苔為材料, 采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法, 闡述外源Ca2+添加對(duì)滸苔高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制, 不僅有助于了解Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)的通路, 而且對(duì)滸苔規(guī)模暴發(fā)的機(jī)制提供大量的基因數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019年6月份在青島石老人海灘海面采集漂浮滸苔樣品(120.481037°E, 36.100093°N)。采集后的滸苔先清洗掉其他雜質(zhì)、0.2% KI處理5 min和滅過菌的海水進(jìn)行洗滌。滸苔在加入100 μg/mL氨芐青霉素的Provasoli培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25 °C、12 h光照和12 h黑暗的光周期, 光照強(qiáng)度為40 μmol/(m2·s)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理 2 g滸苔分別放在含有5 mmol/L CaCl2的400 mL Provasoli培養(yǎng)基中, 轉(zhuǎn)移到35 °C高溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(處理組, 標(biāo)記為UpCa)。2 g滸苔在不含CaCl2的400 mL Provasoli培養(yǎng)基中在35 °C高溫培養(yǎng)作為對(duì)照, 標(biāo)記為UpHT。每個(gè)處理有3個(gè)生理性重復(fù)。在光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s)、光照周期12L:12D的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h, 每個(gè)樣品各取1 g, 液氮冷凍, –70 °C保存直至RNA提取, RNA提取后送樣到武漢華大基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.2 RNA提取和cDNA文庫的構(gòu)建 利用十六烷基三甲基溴化銨-聚乙烯吡咯烷酮(CTAB-PVP)的方法根據(jù)說明書來提取滸苔的總RNA, 使用NanoDrop ND2000紫外分光光度計(jì)(Thermo)測(cè)定RNA的濃度和質(zhì)量。利用Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建。文庫的構(gòu)建是帶polyA的mRNA被含有OligodT的磁珠富集純化。二價(jià)陽離子把富集的mRNA片段化, 將片段化的RNA合成cDNA (朱婷芳等, 2020)。在BGISEQ (MGI2000)平臺(tái)按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 在BGISEQ平臺(tái)獲得原始序列(Raw data), 用fastq文件格式存儲(chǔ)結(jié)果。利用SOAPnuke軟件將原始序列過濾, 去除帶接頭(Adaptor)的reads、含有N(無法確定堿基信息)的比例>10%的reads和低質(zhì)量reads(質(zhì)量值≤15的堿基數(shù)占整個(gè)reads總堿基數(shù)的50%以上), 得到Clean data (朱婷芳等, 2020)。Clean reads通過HISAT和Bowtie2軟件比對(duì)到參考基因序列, 進(jìn)行基因注釋。轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平主要通過RSEM計(jì)算獲得。

1.2.4 差異基因的鑒定和GO、KEGG富集分析 主要是根據(jù)UpHT(對(duì)照) vs UpCa(處理)即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣品的Unigene表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比, 差異基因(Differentially Expressed Genes)的篩選主要是根據(jù)<0.05和|log2(UpCa FPKM/UpHT FPKM)|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn), 獲得DEGs (Wang, 2010)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫和GO數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路和GO富集分析(He, 2018a), 將值≤0.05的GO注釋和KEGG注釋歸屬為DEGs顯著富集的GO和KEGG通路。值是用KOBAS(2.0)的BH方法得到的修正后的值(Hu, 2019)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

本研究以UpCa和UpHT處理的滸苔總RNA為模板, 每個(gè)3個(gè)重復(fù), 共構(gòu)建了6個(gè)cDNA文庫, 利用BGISEQ平臺(tái)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。UpHT對(duì)照組平均獲得48.51 M的總Raw reads, 過濾后獲得43.12 M Clean reads, 過濾后的堿基數(shù)是6.47 Gb, 過濾后的reads的比例是88.88% (表1)。UpCa實(shí)驗(yàn)處理組平均獲得48.67 M的總Raw reads, 經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾獲得43.25 M Clean reads。過濾后的堿基數(shù)是6.49 Gb, 過濾后的reads比例為88.86% (表1)。UpHT和UpCa處理比對(duì)到基因的Clean reads的比例分別為50.53%和45.64%。

表1 滸苔UpHT和UpCa處理轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果

Tab.1 The result of transcriptome sequencing in U. prolifera under UpHT and UpCa treatments

注:20表示過濾后的reads中質(zhì)量值大于20的堿基數(shù)(測(cè)序錯(cuò)誤率<0.01)占總堿基數(shù)的比例,= –10 lg, M為million

2.2 基因的注釋

UpHT主要注釋到26545條基因, UpCa注釋到35368條基因, 交叉的基因有25288條, 總共注釋到36625條基因(圖1)。

圖1 UpCa處理組和UpHT對(duì)照組基因表達(dá)的韋恩圖

2.3 差異基因的篩選和表達(dá)

參照其他相關(guān)的基因庫, 在<0.05和|log2(FC)|≥1條件下, 獲得7153個(gè)DEGs (圖2)。其中上調(diào)的DEGs有6002個(gè), 下調(diào)的DEGs有1151個(gè)(圖2a)。

2.4 DEGs的GO分類和富集分析

對(duì)DEGs進(jìn)行GO分類分析, 共有4335條DEGs基因被注釋歸屬到GO的功能統(tǒng)計(jì)里面, 結(jié)果如圖3所示。對(duì)于參與的生物過程(biological process)來說,GO注釋最多的為細(xì)胞的過程(cellular process, 1691)、代謝的過程(metabolic process, 1446)、生物的調(diào)節(jié)(biological regulation, 447)、定位(localization, 360)、對(duì)刺激反應(yīng)(response to stimulus, 328)、信號(hào)(signaling, 119)和發(fā)育過程(developmental process, 63)等。對(duì)于細(xì)胞的構(gòu)成(cellular component)來說膜(membrane, 1731)、膜部分(membrane part, 1630)和細(xì)胞(cells, 1612)是GO基因注釋最多的分類。對(duì)與分子功能(molecular function)來說, 注釋的基因歸類最豐富的為結(jié)合(binding, 2218)、催化的活性(catalytic activity, 2511)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity, 286)等。另外, 有29個(gè)DEGs歸屬到抗氧化活性(antioxidant activity), 25個(gè)DEGs歸屬到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(signal transducer activity)。

對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析, 結(jié)果如圖4所示。在生物過程(biological process)的GO通路中DEGs主要富集到有機(jī)循環(huán)化合物代謝過程(organic cyclic compound metabolic process, GO: 1901360, 741)、細(xì)胞芳香族化合物的代謝過程(cellular aromatic compound metabolic process, GO: 0006725, 714)、雜環(huán)代謝過程(heterocycle metabolic process, GO: 0046483, 714)、有機(jī)循環(huán)復(fù)合生物合成過程(organic cyclic compound biosynthetic process, GO: 1901362, 286)和RNA代謝過程(metabolic process, GO: 0016070, 318)等GO術(shù)語。

參與細(xì)胞組成(Cellular component)的GO通路中, 富集程度最高的是nucleus (GO: 0005634, 601)和細(xì)胞內(nèi)的核糖核蛋白復(fù)合體(Intracellular ribonucleoprotein complex, GO: 0030529, 765)。參與分子功能(molecular function)富集程度最高的包括催化活性(catalytic activity, GO: 0003824, 2511)和連接酶活性, 形成碳氮鍵(ligase activity, forming carbon-nitrogen bonds, GO: 0016879, 87)等(圖4)。

圖2 滸苔UpCa處理下差異基因的分析

注: a. 上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)目; b. 火山圖。X軸代表log2轉(zhuǎn)換后的差異倍數(shù)值, Y軸代表-l轉(zhuǎn)換后的顯著性值。紅色點(diǎn)表示上調(diào)的DEGs, 綠色點(diǎn)表示下調(diào)的DEGs, 灰色點(diǎn)表示差異不顯著的基因

圖3 差異基因GO分類

注: X軸代表注釋到GO條目上的基因數(shù)目, Y軸代表GO功能分類

圖4 差異基因GO富集分析氣泡圖

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG通路和KEGG富集分析

為了研究涉及重要代謝途徑的基因, 我們把注釋的基因Mapped到KEGG pathway途徑中。通過KEGG和KOBAS軟件, 共有2121個(gè)DEGs基因mapped到21個(gè)level2。47個(gè)DEGs mapped到environmental adaptation, 66個(gè)DEGs mapped到signal transduction, 20個(gè)DEGs mapped到Membrane transport (圖5)。

圖5 差異基因的KEGG分類

根據(jù)KEGG注釋結(jié)果, 利用KOBAS進(jìn)行KEGG富集分析。富集程度較高的Pathway代謝途徑主要是煙酸和煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism, ko00760, 36)、核糖核酸聚合酶(RNA polymerase, ko03020, 95)、賴氨酸降解(lysine degradation, ko00310, 34)、糖基磷脂酰肌醇生物合成(glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis,ko00563, 20)、維生素B1代謝(thiamine metabolism, ko00730, 20)、RNA降解(RNA degradation, ko03018, 60)、類胡蘿卜素生物合成(carotenoid biosynthesis, ko00906, 22)和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction, ko04075, 33)等(圖6)。

進(jìn)一步對(duì)KEGG分類中運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism, 155)、膜運(yùn)輸(membrane transport, 20)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction, 66)和環(huán)境適應(yīng)(environmental adaptation, 47)共288個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG富集散點(diǎn)圖分析(圖7)。富集程度較高的代謝途徑主要包括內(nèi)吞(endocytosis, ko04144, 72)、植物-病原體相互作用(plant-pathogen interaction, ko04626, 42)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction, ko04075, 33)、絲裂原激活的蛋白激酶植物信號(hào)通路(MAPK signaling pathway-plant, ko04016, 42)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ABC transporters, ko02010, 20)和磷酸肌醇代謝(inositol phosphate metabolism, ko00562, 14)等(圖7)。

3 討論

藻類在遭受一系列的非生物脅迫, 如高溫、低溫、干旱等環(huán)境狀況, 其對(duì)環(huán)境壓力的防御機(jī)制主要是通過抗氧化酶的表達(dá)來調(diào)節(jié)適應(yīng)性機(jī)制。我們主要從信號(hào)傳導(dǎo)、抗氧化酶和熱激蛋白等方面對(duì)差異基因的表達(dá)和鑒定進(jìn)行進(jìn)一步分析。

3.1 植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因的鑒定和分析

已有的研究表明在非生物脅迫條件下高溫改變了激素相關(guān)蛋白的表達(dá)(Reguera, 2013; Fan,2018)。在本研究中, UpCa處理改變了高溫條件下參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激素生物合成的關(guān)鍵酶的表達(dá)。篩選獲得33個(gè)編碼關(guān)鍵蛋白激酶的差異表達(dá)基因, 其中32個(gè)DEGs上調(diào), 1個(gè)DEGs下調(diào)。脫落酸(abscisic acid, ABA)途徑和細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物的生長發(fā)育及壓力脅迫調(diào)節(jié)中有很重要的作用。組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(histidine-containing phosphorytransfer protein, AHP)主要作為細(xì)胞分裂素傳感因子組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(B-type ARRs)之間的磷酸化轉(zhuǎn)移的介質(zhì), 通過His到Asp的多步磷酸化, 在促進(jìn)細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞分裂素(cytokinin)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中, 下游的AHPs主要是通過保守的組氨酸殘基來轉(zhuǎn)運(yùn)需要轉(zhuǎn)運(yùn)的保守的氨基酸。1個(gè)unigene編碼的AHP和8個(gè)unigenes編碼的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(two-component response regulator ARR-B family)的表達(dá)水平都是差異性上調(diào)。在ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中, 在擬南芥的生化和分子遺傳學(xué)研究中, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶2C(PP2C)酶是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的負(fù)調(diào)節(jié)因子(Rodriguez, 1998; Fan, 2018)。在沒有ABA的情況下, PP2C主要抑制蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶2(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2, SnRK2)蛋白的活性狀態(tài)。在ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中, SnRK2s起著重要的作用。SnRK2s蛋白活性狀態(tài)的抑制導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的減少。ABA減輕PP2C對(duì)SnRK2s的抑制作用, 激活SnRK2s啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。已有的研究表明, 滸苔在高溫壓力下, AHP和SnRK2s蛋白的表達(dá)增加, 而PP2C蛋白的表達(dá)降低說明細(xì)胞分裂素和ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高溫下被誘導(dǎo)(Reguera, 2013; Fan, 2018)。本研究表明, 在UpCa處理下8個(gè)unigenes編碼絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/ threonine-protein kinase, SRK2),基因表達(dá)都顯著上調(diào)。PP2C也是顯著性上調(diào)(表2)。另外, MAPK signal system中, 有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶17/18(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 17/18, MAPKKK17/18)和有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase 9, MAPKK9)都是上調(diào)。結(jié)果表明UpCa處理緩解了高溫的壓力, 改變了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑和MAPK signal途徑, 提高了對(duì)高溫壓力的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

圖6 差異基因的KEGG富集分析

注: Rich Factor是指在該代謝通路中差異表達(dá)的基因數(shù)與注釋基因總數(shù)的比值。比值越大, 說明富集程度越高。value是校驗(yàn)后的value, 在0—1之間, 越鄰近0, 富集越顯著

圖7 信號(hào)和膜運(yùn)輸相關(guān)基因的KEGG富集分析

在油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中, 絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine- protein phosphatase BSU1, Unigene3691_All)基因的表達(dá)增加, BR的信號(hào)途徑增強(qiáng)。乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中, 8個(gè)unigene編碼的乙烯受體(ethylene receptor, ETR)和CL3860.Contig2_All編碼的EIN3-binding F-box protein都是差異性上調(diào)。4個(gè)unigenes編碼的CTR1(serine/threonine-protein kinase CTR1)表達(dá)上調(diào)。

植物的生長受到環(huán)境和激素信號(hào)的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié), 油菜素類固醇(BR)、細(xì)胞分裂素和ABA在溫度脅迫適應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用; 然而, 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與環(huán)境信號(hào)之間的相互作用在分子水平上仍不清楚。結(jié)果表明, 可能是在高溫狀況下, 滸苔自身有一套應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對(duì)高溫脅迫, 氯化鈣的施加促進(jìn)了這一套反應(yīng)機(jī)制。因此, 滸苔細(xì)胞分裂素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng), 促進(jìn)了對(duì)非生物環(huán)境脅迫的適應(yīng)。在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí), 滸苔激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中氯化鈣調(diào)節(jié)起著重要的作用, 但是其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深化研究。

表2 抗氧化、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Ca2+相關(guān)差異基因(部分)

Tab.2 Antioxidant, plant signal transduction and Ca2+ related differentially expressed genes (portion)

續(xù)表

3.2 編碼Ca2+信號(hào)組分的基因表達(dá)

Ca2+信號(hào)組分主要由3部分組成, 即生成Ca2+信號(hào), 識(shí)別Ca2+信號(hào), 轉(zhuǎn)導(dǎo), 最后開始針對(duì)特定刺激的反應(yīng)。細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平是高度動(dòng)態(tài)的, 并通過通道、泵和轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)各種生物和非生物信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中游離Ca2+水平的變化由Ca2+響應(yīng)蛋白檢測(cè)。鈣調(diào)蛋白(CaM)、鈣調(diào)磷酸酶b(CBL)和Ca2 +依賴的蛋白激酶(CDPKs)直接或間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子通過磷酸化/脫磷酸作用響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加(Shankar, 2014)。本研究結(jié)果表明15個(gè)DEGs編碼的CDPK基因表達(dá)有差異性變化, 其中4個(gè)DEGs編碼的基因表達(dá)下調(diào), 11個(gè)DEGs編碼的基因上調(diào)。鈣結(jié)合蛋白(calcium-binding protein CML)、鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase)、鈣調(diào)素(calmodulin)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性3′,5′環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(calcium/ calmodulin-dependent 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase)的基因表達(dá)上調(diào)(表2)。Ca2+的感應(yīng)因子CDPKs僅在植物和原生生物中被鑒定, 并且有一個(gè)結(jié)合Ca2+離子的自動(dòng)調(diào)節(jié)域。對(duì)于CDPKs活性的調(diào)控, 不僅需要Ca2+離子, 還需要特定的磷脂和自磷酸化。結(jié)果表明, 外源CaCl2離子的添加激活了多種Ca2+信號(hào)組分, 使?jié)G苔產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)和Ca2+的吸收更加順暢, 這與已有研究結(jié)果相一致(González, 2012; Shankar, 2014; Goswami, 2015)。

3.3 抗氧化基因功能的鑒定

非生物脅迫如高溫、低溫和干旱可以誘發(fā)植物防御機(jī)制, 可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶表達(dá)來適應(yīng)非生物壓力。在高等植物中, 對(duì)高溫脅迫的信號(hào)響應(yīng)包括正常蛋白質(zhì)合成的減少, 并伴隨著熱響應(yīng)性的基因和熱激蛋白(heat shock protein, Hsps)表達(dá)的上調(diào), 導(dǎo)致活性氧的積累(Kim, 2013)?；钚匝?ROS)是指自由基, 包括過氧化氫(H2O2)、單重態(tài)氧(O2?)和羥基自由基(OH–)。過量的ROS會(huì)破壞大分子和細(xì)胞膜。為了清除有毒的ROS, 藻類啟動(dòng)自身的抗氧化防御系統(tǒng), 即超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白和谷胱甘肽等(Wang, 2011)。目前的研究表明, 主要有15個(gè)抗氧化基因有差異性表達(dá), 其中9個(gè)DEGs表達(dá)上調(diào), 6個(gè)DEGs表達(dá)下調(diào)。上調(diào)的基因主要包括抗壞血酸過氧化物酶(L-ascorbate peroxidase)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)、鐵超氧化物歧化酶(Fe superoxide dismutase)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)、ATP依賴的RNA解旋酶(ATP-dependent RNA helicase DOB1)(表2)。下調(diào)的基因主要為谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶和熱激蛋白(heat shock 70 kDa protein)等(表2)。

Hsp70在新生蛋白的折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和錯(cuò)誤蛋白的修復(fù)方面起著重要的作用。在植物遭受壓力時(shí), HSP70上調(diào)參與保持細(xì)胞的平衡, 保護(hù)機(jī)體免受傷害。高溫下滸苔Hsp70的表達(dá)升高(Fan, 2018)。谷胱甘肽過氧化物酶主要是催化氧化谷胱甘肽(glutathione disulfide, GSSG)降解成巰基化的谷胱甘肽(sulfhydryl form glutathione, GSH), GSH在抵抗氧化反應(yīng)和維持細(xì)胞的還原環(huán)境方面起到重要的作用。本研究結(jié)果表明UpCa處理緩解了高溫壓力, Hsp70的表達(dá)量下調(diào), FeSOD genes和抗壞血酸過氧化物酶基因表達(dá)的上調(diào)顯著增強(qiáng)了滸苔的抗氧化能力。谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄本有上調(diào)也有部分下調(diào), 可能是因?yàn)椴煌霓D(zhuǎn)錄本可能有相似的表象, 但是它們可能通過不同的Pathway途徑行使不同的功能。

4 結(jié)論

采用BGISEQ平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序, 獲得了滸苔UpCa和UpHT處理下相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。分析結(jié)果顯示, 根據(jù)UpHT和UpCa處理分析共獲得36625條基因, 在UpCa下鑒定出7513個(gè)差異表達(dá)的基因, 包括6002個(gè)基因上調(diào), 1151個(gè)基因下調(diào), 對(duì)差異基因進(jìn)行了GO富集和KEGG富集分析。對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的DEGs進(jìn)行分析, 主要富集在內(nèi)吞(Endocytosis)、植物-病原體相互作用(Plant-pathogen interaction)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK signaling pathway-plant)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ABC transporters)和磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)等代謝通路上。

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中, 細(xì)胞分裂素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)?？寡趸钢蠪eSOD、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶, 抗壞血酸過氧化物酶等基因表達(dá)上調(diào), 下調(diào)的基因主要是熱激蛋白。Ca2+信號(hào)組分基因鈣結(jié)合蛋白、鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶、鈣調(diào)素和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性3′,5′環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的基因表達(dá)上調(diào), 絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶和磷脂酰肌醇信號(hào)相關(guān)的基因也差異性上調(diào)。植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化酶、MAPK信號(hào)系統(tǒng)和Ca2+信號(hào)組分基因在外源CaCl2對(duì)滸苔高溫壓力的調(diào)節(jié)中具有重要的作用, 不同信號(hào)通路之間的相互作用還需要進(jìn)一步研究。

朱婷芳, 管 峰, 苗 亮等, 2020. 大彈涂魚()單核巨噬細(xì)胞低氧脅迫比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析. 海洋與湖沼, 51(2): 335—344

陳 輝, 2011. 杜氏鹽藻耐鹽滲透調(diào)節(jié)與Ca2+介導(dǎo)的滲透信號(hào)傳導(dǎo). 廣州: 華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文

李雪娜, 韓 震, 劉賢博等, 2016. 滸苔和馬尾藻的生消與海表面溫度的相互影響研究. 海洋湖沼通報(bào), (5): 126—130

Chávez-Sánchez T A, Pi?ón-Gimate E, Serviere-Zaragoza A, 2017. Recruitment inblooms in relation to temperature, salinity and nutrients in a subtropical bay of the Gulf of California. Botanica Marina, 60(3): 257—270

Fan M H, Sun X, Liao Z, 2018. Comparative proteomic analysis ofresponse to high temperature stress. Proteome Science, 16: 17

Fan M H, Sun X, Xu N J, 2017. Integration of deep transcriptome and proteome analyses of salicylic acid regulation high temperature stress in. Scientific Reports, 7(1): 11052

González A, Cabrera M D L á, Henríquez M J, 2012. Cross talk among calcium, hydrogen peroxide, and nitric oxide and activation of gene expression involving calmodulins and calcium-dependent protein kinases inexposed to copper excess. Plant Physiology, 158(3): 1451—1462

Goswami S, Kumar R R, Sharma S K, 2015. Calcium triggers protein kinases-induced signal transduction for augmenting the thermotolerance of developing wheat () grain under the heat stress. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 24(4): 441—452

He B X, Hou L L, Dong M M, 2018a. Transcriptome analysis in: astaxanthin induction by high light with acetate and Fe2+. International Journal of Molecular Sciences, 19(1): 175

He Y L, Hu C Y, Wang Y H, 2018b. The metabolic survival strategy of marine macroalgaunder temperature stress. Journal of Applied Phycology, 30(6): 3611—3621

Hu C Y, Cui D D, Sun X, 2019. Transcriptomic analysis unveils survival strategies of autotrophicagainst high light stress. Aquaculture, 513: 734430

Im S, Choi S, Hwang M S, 2015. De novo assembly of transcriptome from the gametophyte of the marine red algaeand identification of abiotic stress response genes. Journal of Applied Phycology, 27(3): 1343—1353

Kim H J, Chiang Y H, Kieber J J, 2013. SCFKMDcontrols cytokinin signaling by regulating the degradation of type-B response regulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(24): 10028—10033

Li Y H, Wang D, Xu X T, 2017. Physiological responses of a green algae () exposed to simulated acid rain and decreased salinity. Photosynthetica, 55(4): 623—629

Reguera M, Peleg Z, Abdel-Tawab Y M, 2013. Stress-induced cytokinin synthesis increases drought tolerance through the coordinated regulation of carbon and nitrogen assimilation in rice. Plant Physiology, 163(4): 1609—1622

Rodriguez P L, 1998. Protein phosphatase 2C (PP2C) function in higher plants. Plant Molecular Biology, 38(6): 919—927

Rybak A S, 2018. Species of(Ulvophyceae, Chlorophyta) as indicators of salinity. Ecological Indicators, 85: 253—261

Shankar A, Srivastava A K, Yadav A K, 2014. Whole genome transcriptome analysis of rice seedling reveals alterations in Ca2+ion signaling and homeostasis in response to Ca2+deficiency. Cell Calcium, 55(3): 155—165

Wang H, Lin A P, Gu W H, 2016. The sporulation of the green algais controlled by changes in photosynthetic electron transport chain. Scientific Reports, 6: 24923

Wang J X, Sommerfeld M, Hu Q, 2011. Cloning and expression of isoenzymes of superoxide dismutase in(Chlorophyceae) under oxidative stress. Journal of Applied Phycology, 23(6): 995—1003

Wang L K, Feng Z X, Wang X, 2010. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data. Bioinformatics, 26(1): 136—138

COMPARATIVE TRANSCRIPTOME STUDY OFTO CALCIUM CHLORIDE TREATMENT UNDER HIGH TEMPERATURE STRESS

TANG Xiao-Wen1, FAN Mei-Hua1, WANG Chao-Feng1, LIAO Zhi1, LI Peng1, XU Nian-Jun2, 3, 4, 5, WANG Jian-Xin1

(1. Marine Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. National Engineering Research Laboratory of marine biotechnology and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315832, China; 3. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology (Ningbo University), Ministry of Education, Ningbo 315832, China; 4. Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-efficiency and Healthy Aquaculture, Ningbo University, Ningbo 315832, China;5. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, Ningbo University,Ningbo 315832, China)

As a necessary signal molecule, calcium (Ca2+) plays an important role in plant growth and abiotic stress regulation. The transcriptome variation of exogenous CaCl2addition in.at a high temperature (35 °C) was analyzed in experiment using BGISEQ platform. The high temperature with CaCl2addition was the treatment group (denoted UpCa), and high temperature was the control group (UpHT). Results show that 36625 genes were obtained, of which 7513 differentially expressed genes were identified, including 6002 up-regulated genes and 1151 down-regulated genes. The DEGs related to membrane transport, plant signal transduction and environmental adaptability were analyzed. They were mainly enriched in endocytosis, plant pathogen interaction, plant hormone signal transduction, mitogen activated protein kinase (MAPK signaling pathway plant), ABC transporters, and phosphatidylinositol signaling system. In the metabolic pathway of plant signaling transduction system, cytokinin, abscisic acid, brassinolide, and ethylene signal transduction pathways were enhanced. The expressions of FeSOD, GSHPx, glutathione-s-transferase, and ascorbic acid peroxidase were up-regulated, and the down regulated genes were heat shock protein. The expressions of calcium binding protein, calcium/calmodulin dependent protein kinase, calmodulin, and calcium/calmodulin dependent 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase were up-regulated. The mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) and phosphatidylinositol signal related genes were also up-regulated. In this study, the important roles of plant signal transduction, antioxidant enzyme, MAPK signal system, and Ca2+signal component genes in exogenous CaCl2regulation of high temperature pressure in.were systematically reviewed. These results will provide a basis for further elucidating the mechanism of Ca2+signal regulation and adaptation to high temperature.

; exogenous CaCl2; transcriptome; high temperature

* 浙江省省屬高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目, 2019J00049號(hào); 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, LY20D060006號(hào); 寧波大學(xué)海洋學(xué)院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目, 2019—2021; 浙江海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目, Q1701號(hào); 浙江省一流學(xué)科開放基金項(xiàng)目, 2019—2021。唐曉雯, E-mail: 1759406725@qq.com

范美華, E-mail: dinger503@163.com; 王健鑫, E-mail: jxwang@zjou.edu.cn

2020-10-26,

2020-12-29

Q523.8; Q789; S917

10.11693/hyhz20201000297