秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細胞體外抑制和對海馬神經(jīng)元細胞缺氧/復(fù)氧保護作用的研究①

周麗娟 楊 樸 鄭道都 孫勁璞（商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，商丘 476000）

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤疾病，近些年的發(fā)病率持續(xù)增高且患病人群逐漸呈現(xiàn)年輕化特征［1］。腦膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲性特別強，會透過血管壁及膠質(zhì)細胞間的連接來浸潤壓迫并破壞腦組織［2］。腦膠質(zhì)的手術(shù)難點在于其常與正常腦組織分界不清，導(dǎo)致手術(shù)切除不徹底，同時術(shù)后又極易復(fù)發(fā)［3］。目前針對腦膠質(zhì)瘤的治療依舊是個醫(yī)學(xué)難題，又因其對放療和化療不敏感，所以針對腦膠質(zhì)瘤的藥物研究成為熱點。腦膠質(zhì)瘤往往會對正常腦神經(jīng)產(chǎn)生壓迫，導(dǎo)致腦神經(jīng)細胞暫時的缺血和缺氧從而誘導(dǎo)腦神經(jīng)死亡［4-7］，因此在針對腦膠質(zhì)瘤的藥物治療過程中，如果對缺血性腦卒中具有一定的保護作用，這將非常有利于患者的治療和康復(fù)。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥的治療方案，本研究發(fā)現(xiàn)秋水仙素具有對腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中治療的潛力。秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的種子和球莖的一種植物堿，白色或淡黃色的粉末或針狀晶體。最先用于治療風(fēng)濕病和痛風(fēng)，但已有研究報道其對腫瘤具有一定的治療效果。

因此本研究以U87細胞和HT22細胞為研究對象，探討不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細胞和海馬神經(jīng)元細胞的抑制和保護作用，為秋水仙素在臨床上治療腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中提供可靠的實驗依據(jù)和藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 秋水仙素購自河南省食品藥品檢驗所；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自美國HyClone公司；蛋白酶抑制劑購自Roche美國公司；青鏈霉素混合液購自北京Solarbio公司；βactin、Caspase-3、Bcl-2、Cyclin-D1、Bax和p53以及PIK3/AKT抗體、兔二抗購自英國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Advansta公司；CCK-8試劑盒和ROS檢測試劑盒購自河南瑞祥生物公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自北京碧云天。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖實驗 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞數(shù)4×105個/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的秋水仙素（0、10、20、30、40 ng/ml），以正常培養(yǎng)細胞為空白對照組，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12～60 h。結(jié)束后每孔加入20μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm檢測細胞CCK-8混合液OD值進行活力分析。

1.2.2 qRT-PCR使用TRIzol和氯仿提取RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成性質(zhì)穩(wěn)定的cD?NA。隨后qRT-PCR檢測目的基因相對β-actin的表達水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95℃預(yù)變性10 min；95°C退火10 s；60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。2-ΔΔCt方法用于計算目的基因相對mRNA表達。引物序列如下。Caspase-3：Forward-5′-GCACCCAGCGA TGTAATAGA-3′，Reverse-5′-TTGGATGAAGGAGA?ACCC-3′；Bcl-2：Forward-5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse-5′-AGGGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；Cyclin-D1：Forward-5′-CCTGATGATGAATCAGCATTT-3′，Reverse-5′-GGAGATGATGGAGGCAAGG-3′；Bax：Forward-5′-CCTTTACTGAAGTTATTGATTTCTC-3′，Reverse-5′-GGCAGTTAGACTTTGATGCACTTT-3′；p53：Forward-5′-CTGGCGGTGAAACCTG-3′，Reverse-5′-CCCCTGCAAGGGTATCCCTGC?GGT-3′；β-actin：Forward-5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，Reverse-5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.3 Western blot調(diào)整細胞數(shù)5×104個/ml接種至6孔板，80%細胞密度時收集細胞，PBS洗滌1 min加入加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速離心吸取蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.4 OGD細胞模型構(gòu)建HT22細胞體外正常培養(yǎng)待細胞密度達到30%左右，預(yù)先細胞給藥5、10、15、20、30和40 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 h。取出細胞換成正常培養(yǎng)液，正常細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察細胞活力、ROS變化和線粒體膜電位變化。

1.2.5 ROS活性檢測HT22細胞體外正常培養(yǎng)待細胞密度達到30%左右，預(yù)先細胞給藥30 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。結(jié)束后每孔加入20μl ROS檢測試劑，避光1 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀570 nm檢測細胞OD值進行活力分析。

1.2.6 線粒體膜電位檢測HT22細胞體外正常培養(yǎng)待細胞密度達到30%左右，預(yù)先細胞給藥30 ng/ml秋水仙素處理12 h。隨后放入三氣培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件90%CO2、5%N2、5%O2，換至無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。結(jié)束后每孔加入30μl JC-1檢測試劑，避光12 h，隨后激光共聚焦觀察線粒體膜電位變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗，多組件比較用F檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秋水仙素抑制U87細胞增殖能力 檢測不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細胞的增殖抑制作用，以確定最佳的藥物作用濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素對U87細胞增殖抑制作用隨著秋水仙素給藥濃度的增加而增加（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)給藥濃度達到30 ng/ml時秋水仙素抑制作用最強（P＞0.05），因此后續(xù)對U87細胞作用濃度選為30 ng/ml。見圖1。

圖1 不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of col-chicine on proliferation of glioma U87 cells

2.2 秋水仙素抑制PIK3/AKT信號通路和抑制U87細胞凋亡蛋白表達qRT-PCR和Western blot檢測秋水仙素給藥后對PIK3/AKT信號通路的影響以及下游促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1和抑癌基因Bax和p53的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素可以有效抑制促癌基因Caspase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表達（P＜0.05），促進抑癌基因Bax和p53的表達（P＜0.05），同時抑制PIK3和AKT的磷酸化（P＜0.05），從而抑制PIK3/AKT信號通路的激活。提示秋水仙素是通過阻滯PIK3/AKT信號通路的激活從而抑制U87細胞的增殖作用。見圖2、3。

圖2 PCR檢測秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.2 Effect of colchicine on PIK3/AKT signaling down-stream related proteins in glioma U87 cells detected by PCR

圖3 Western blot檢測秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤U87細胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effects of colchicin on PIK3/AKT signaling path-way and its downstream related proteins in glioma U87 cells

2.3 秋水仙素預(yù)處理可提高OGD誘導(dǎo)HT22細胞活力10、20、30、40和50 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD誘導(dǎo)HT22細胞活力具有明顯的保護作用（P＜0.05），而20 ng/ml濃度秋水仙素對OGD誘導(dǎo)HT22細胞活力開始產(chǎn)生抑制作用，30 ng/ml時抑制作用最強。說明秋水仙素在30 ng/ml時對HT22產(chǎn)生細胞毒性。因此后續(xù)HT22細胞秋水仙素給藥濃度為30 ng/ml。見圖4。

圖4 不同濃度秋水仙素對OGD模型HT22細胞活力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of colchicin on vi-ability of HT22 cells in OGD model

2.4 秋水仙素預(yù)處理降低OGD誘導(dǎo)HT22細胞ROS和線粒體膜電位的變化OGD誘導(dǎo)會刺激細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體的凋亡，活性氧ROS和線粒體膜電位的變化分別反映了這兩種細胞的生理反應(yīng)，而細胞在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體的凋亡時會產(chǎn)生NO來減緩ROS的產(chǎn)生和線粒體膜電位的降低。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，秋水仙素預(yù)處理組HT22細胞NO表達顯著增多（P＜0.05），ROS含量明顯降低（P＜0.05），同時線粒體膜電位也顯著降低（P＜0.05）。說明秋水仙素預(yù)處理可以有效緩解OGD誘導(dǎo)的HT22細胞的氧化應(yīng)激和線粒體凋亡。見圖5、6。

圖5 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細胞ROS表達的影響Fig.5 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on ROS expression in HT22 cells of OGD model

圖6 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細胞線粒體膜電位影響Fig.6 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on mito-chondrial membrane potential of HT22 cells in OGD model

2.5 秋水仙素降低MMP-9和CRP的表達MMP-9和CRP是發(fā)生缺血性腦卒中的標(biāo)志細胞因子，OGD模型下，秋水仙素預(yù)處理后，ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液中MMP-9和CRP的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素可以有效抑制MMP-9和CRP的表達（P＜0.05），減緩OGD誘導(dǎo)HT22細胞MMP-9和CRP的分泌。見圖7。

圖7 30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細胞MMP-9和CRP的影響Fig.7 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment onMMP-9 and CRP in OGD model HT22 cells

2.6 秋水仙素抑制PIK3/AKT信號通路和抑制OGD誘導(dǎo)HT22細胞凋亡30 ng/ml秋水仙素可以減緩OGD誘導(dǎo)HT22細胞凋亡。qRT-PCR和Western blot檢測秋水仙素預(yù)處理后OGD誘導(dǎo)HT22細胞內(nèi)PIK3/AKT信號通路相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素同樣通過抑制AKT的磷酸化（P＜0.05），抑制促凋亡因子Capase-3、Bcl-2和Cyclin-D1表達（P＜0.05），從而緩解OGD誘導(dǎo)HT22細胞凋亡。見圖8、9。

圖8 PCR檢測30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.8 PCR detection of 30 mg/ml colchicin pretreatment on OGD model effects of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

圖9 Western blot檢測30 ng/ml秋水仙素預(yù)處理對OGD模型HT22細胞PIK3/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白的影響Fig.9 Effect of 30 ng/ml colchicin pretreatment on down-stream related proteins of PIK3/AKT signaling pathway in HT22 cells

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是臨床上人顱內(nèi)常見原發(fā)性惡性腫瘤，近些年發(fā)病率逐漸增高且趨于年輕化［8］。腦膠質(zhì)瘤侵襲性強，常通過侵襲血管壁及膠質(zhì)細胞間的連接來浸潤、壓迫和破壞腦組織［2，9］。由于其與正常腦組織分界不清，手術(shù)難以徹底切除，術(shù)后極易復(fù)發(fā)［9-10］。而其對放療及化療的敏感性均欠佳，故患者預(yù)后差，死亡率高［9，11］。目前臨床上針對腦膠質(zhì)瘤尚無有效的藥物，因此，針對抗腦膠質(zhì)瘤藥物的研究就顯得尤為重要。腦膠質(zhì)瘤常常會壓迫腦神經(jīng)，造成神經(jīng)元細胞缺血再灌注造成腦卒中。因此腦卒中常常伴隨著腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。腦卒中是人類災(zāi)難性疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點，是世界范圍內(nèi)死亡和長期致殘的三大原因之一［9］，同時也是世界上單病種導(dǎo)致成人后天功能障礙的首位原因［12］。腦卒中主要原因是腦缺血再灌注引起的［9］。而腦缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，氧化還原平衡的破壞是其重要的病理特征［13］。因此，探索高效的抗氧化神經(jīng)保護及對腦缺血再灌注損傷的改善和治療具有重要的研究意義和臨床價值。

秋水仙素是萃取于百合科植物秋水仙的種子和球莖的一種植物堿［14］。它是白色或淡黃色的粉末或針狀晶體，最先用于治療風(fēng)濕病和痛風(fēng)，但已有研究報道其對腫瘤具有一定的治療效果［15］，但是關(guān)于秋水仙素治療腦膠質(zhì)瘤和缺血性腦卒中的作用如何，其如何發(fā)揮作用的分子機制尚不清楚。因此本研究以U87細胞和HT22細胞為研究對象，探討了不同濃度秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細胞和海馬神經(jīng)元細胞的抑制和保護作用。

本研究首先研究了秋水仙素對U87細胞增殖的影響，初步確定秋水仙素的作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ng/ml的秋水仙素顯著抑制U87細胞增殖作用，同時對OGD模型中HT22具有一定的保護作用。為了研究秋水仙素對腦膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用機制，我們檢測了腫瘤經(jīng)典信號通路PI3K/AKT在秋水仙素給藥后U87細胞中的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)秋水仙素抑制了AKT的磷酸化，同時降低下游促癌基因的表達，促進下游抑癌基因的表達。這提示秋水仙素通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抑癌作用。同時我們檢測了HT22細胞在OGD模型中秋水仙素對PI3K/AKT的影響，結(jié)果同樣顯示秋水仙素抑制PI3K/AKT信號通路以及下游促凋亡基因的表達。這說明秋水仙素在對腦膠質(zhì)瘤發(fā)揮作用的同時對腦缺血再灌注損傷有很好的改善作用，且都是通過PI3K/AKT信號通路來實現(xiàn)的。同時在HT22細胞OGD模型中秋水仙素抑制了ROS的釋放，降低線粒體膜電位從而減少細胞的凋亡，并且對腦缺血再灌注損失標(biāo)志蛋白MMP-9和CRP同樣具有抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果中秋水仙素通過PI3K/AKT信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖，同時有效緩解腦缺血再灌注引發(fā)的損傷，但是秋水仙素在腦膠質(zhì)瘤和腦缺血再灌注中發(fā)揮作用的首觸靶分子是哪個基因，又是如何進一步激活下游PI3K/AKT信號通路的，這將是我們下一步的研究重點。