蘋果多酚/果膠相互作用及其對濁汁體系理化特性和穩(wěn)定性的影響

任佳琦，劉 昕，雷 琳，趙吉春，曾凱芳,2，明 建,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

隨著消費者健康意識的不斷增強，“新鮮、健康、天然、安全”的非濃縮（not from concentrate，NFC）果汁越來越受到消費者的青睞，市場占有率不斷攀升。NFC果汁分為清汁、濁汁及果肉果汁3 類，其中蘋果濁汁通常會去除大塊果肉以維持體系的渾濁穩(wěn)定性，是較為常見的NFC果汁類型[1]。而濁汁產品穩(wěn)定性不佳是制約該產業(yè)發(fā)展的關鍵因素。研究表明，果膠、多酚及蛋白質等物質會發(fā)生相互作用導致云狀顆粒物在體系生成、聚集及失穩(wěn)，引起濁汁穩(wěn)定性下降[2]，而云狀顆粒物的穩(wěn)定性與其粒徑大小，體系黏度等因素有關[3]。

蘋果果膠是一種由D-半乳糖醛酸和中性糖組成的酸性雜多糖，既存在于蘋果濁汁溶液中，也存在于濁汁云狀體系中。蘋果果膠對于維持濁汁穩(wěn)定性具有良好效果，能夠在濁汁體系內的顆粒外形成較好的包裹體系，為相互作用的顆粒提供保護涂層，進而增加體系穩(wěn)定性[2]。且果膠對體系的穩(wěn)定效果與其含量及相對分子質量有關，Shomer等[4]研究發(fā)現橙汁的絮凝程度會隨著果膠含量及相對分子質量大小而改變，果膠會隨著濁汁貯藏時間的延長及環(huán)境溫度的上升而發(fā)生降解，導致濁汁體系黏度下降，果汁出現變清、分層等穩(wěn)定性下降現象[5]。目前，關于濁汁穩(wěn)定性的研究主要集中在優(yōu)化加工方式[6]、添加穩(wěn)定劑[7]及探究濁汁渾濁機理[8]等方面，關于蘋果自身內源因素（如蘋果多酚）對體系穩(wěn)定性的影響鮮有報道。但蘋果中酚類物質的種類及含量會直接影響蘋果汁的最終品質（如顏色、穩(wěn)定性、營養(yǎng)價值等）。梁迪[9]研究發(fā)現添加蘋果多酚后，蘋果果膠溶液的黏度增加，體系穩(wěn)定性較好。在蘋果榨汁過程中，蘋果多酚會與果膠接觸并產生相互作用[10]，這可能會對果膠結構產生一定影響，最終影響濁汁體系的渾濁穩(wěn)定性。Bai Xuelian等[11]研究發(fā)現原花青素除了增強蘋果汁苦味外，還可能與蛋白質、多糖發(fā)生相互作用產生絮狀物從而導致體系內沉淀的產生。近年來的研究發(fā)現多酚與果膠之間存在著共價及非共價相互作用力，且相互作用強度與各自結構、pH值、溫度、離子強度等因素有關[12-13]。非共價相互作用的多酚和果膠主要涉及氫鍵、范德華力、疏水相互作用及靜電相互作用，影響食品的感官和營養(yǎng)屬性[14-15]；共價相互作用能夠通過酶促、碳二亞胺交聯(lián)及自由基誘導等方法產生[16]。

蘋果中酚類化合物主要有表兒茶素、綠原酸、原花青素B2和C1[17]。目前有關原花青素的研究較多，而對于其他多酚作為內源因子與果膠相互作用及其對濁汁體系穩(wěn)定性的研究鮮見報道。因此本實驗選擇蘋果中常見的3 種多酚：根皮苷（phlorizin，PHL）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）及表兒茶素（epicatechin，EC），根據其在不同產地、品種及成熟度的蘋果中的含量確定濃度梯度[18]，模擬濁汁體系中的內源因子。探究不同濃度的3 種多酚對其與蘋果果膠（pectin，PT）組成的濁汁復合體系的理化特性及穩(wěn)定性的影響，為濁汁原料的選取，濁汁體系穩(wěn)定性的改善提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果PT（APA系列103） 煙臺安得利果膠股份有限公司；PHL、CGA、EC 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；Spectrun100傅里葉紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；ZEN3690激光粒度分析儀 英國馬爾文公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕公司；SYNERGYH1MG全波長酶標儀 美國基因公司；Phenom Pro掃描電鏡 荷蘭Phenom Pro公司；TGA550熱重分析儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將PT、PHL、CGA、EC分別溶解于超純水中，室溫下分散至少2 h。之后將PT分別與不同多酚混合后再分散2 h，靜置至少2 h。制成多酚濃度依次為0.03、0.08、0.22、0.42、0.70 mmol/L，PT質量濃度為5 mg/mL的混合體系（混合體系按照多酚濃度增加，以A～E依次編碼）。溶液制備后部分存放于-40 ℃冰箱中，部分使用真空冷凍干燥為粉末保存，待用。

1.3.2 紫外光譜測定

移取3 mL待測樣品于石英比色皿中，以超純水作為參比，于室溫（25 ℃）檢測樣品在20～660 nm波長范圍內的紫外吸收光譜。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜測定

參考Raei等[19]的方法并略有修改。凍干樣品與干燥后的KBr以1∶50置于瑪瑙研缽中均勻混合研磨，取研磨后樣品（每個樣品3 份，每份75 mg）烘干后壓片進行測量。KBr為掃描背景，掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描分辨率4 cm-1，累計掃描32 次。

1.3.4 掃描電子顯微鏡測定

取適量凍干后的樣品置于粘臺后進行噴金處理，在加速電壓10 kV下觀察樣品的微觀結構。

1.3.5 靜態(tài)流變性質測定

參考Wellala等[6]的方法并略有修改。使用藥匙舀取樣品，選定cp60-1錐板；掃描溫度25 ℃；流動曲線（黏彈性流體、膠體）測定模式；剪切速率變化：0.1～100 s-1。測試完畢后對數據進行數學公式擬合，成功應用于Power-Law方程：

式中：σ為剪切應力/Pa；KPL為稠度系數/（Pa·s）；γ為剪切速率/s-1；n為非牛頓指數。

1.3.6 復合物黏度/溫度曲線測定

選定cp60-1錐板；測定模式：旋轉模式，溫度掃描；平衡溫度20 ℃，預剪切3 min，剪切速率10 s-1；數據取點時間：由穩(wěn)態(tài)；剪切速率為恒定值50 s-1；溫度為變量，測量25～75 ℃線性變化。測試完畢后對溶液黏度與剪切速率數據進行數學公式擬合，成功應用于果膠-多酚混合溶液的方程為Arrhenius方程：

式中：η為特定溫度條件下溶液表觀黏度/（mPa·s）；A為頻率因子（常數）；Ea為活化能/（kJ/mol）；R為摩爾氣體常數（8.31 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.3.7 熱重曲線測定

取適量凍干樣品于石英坩堝中，在氮氣環(huán)境中進行熱重分析，升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍為30～800 ℃，系統(tǒng)自動采集數據。

1.3.8 粒徑測定

選擇純水作為測量背景，取1 mL待測樣品放入激光粒度儀的樣品池中進行粒徑及分布的檢測。動態(tài)光散射角度為90°，溫度為25 ℃，檢測波長為633 nm。

1.3.9 濁度及濁度保留率的測定

將所有樣品置于旋渦振蕩器中混合振蕩均勻，取200 μL于96 孔板中，650 nm波長處測量吸光度，每樣一式三份進行測量，吸光度即樣品的濁度。

參考托爾坤·買買提[20]的方法并略有修改。濁度保留率即離心后的濁度與離心前的濁度的比值。將各樣品分為離心、不離心兩部分，離心部分經離心機以3 500 r/min離心15 min，不離心部分相應靜置15 min。取不離心各樣品以及離心后各樣品上清液各200 μL加入96 孔板中，記錄在650 nm波長處的吸光度，每個樣品平行測量3 次。不離心樣品吸光度記為A1，離心樣品吸光度記為A2。按照下式計算濁度保留率：

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次。利用Origin 8.1軟件作圖。使用SPSS 19.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析與t檢驗，使用TRIOS對熱重及流變數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜分析

圖1 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系紫外光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations

由圖1可知，PT于202 nm波長處存在最大吸收峰，符合果膠多糖的特征吸收峰[21]。在281 nm波長處存在一個微小肩峰，可能是由于選取的商品果膠純度不足，存在微量雜質所致。PHL屬于二氫查爾酮類物質，具有苯環(huán)、雙鍵、羰基等不飽和結構，其在284 nm波長處有紫外特征吸收峰[22]；CGA屬于羥基肉桂酸衍生物，在300、327 nm波長處出現吸收峰[23]；EC屬于單體黃烷醇類，吸收峰約在279.80 nm波長處[24]?？梢杂^察到隨著多酚濃度的增加，各譜圖多酚對應波長的吸收峰強度逐漸增加，出現輕微位移，表明多酚與果膠之間可能發(fā)生了相互作用[23]。PT特征峰吸收強度隨著多酚濃度的增加有規(guī)律地增強，對應波長存在著不同程度的紅移現象，這可能是由于多酚的加入改變了體系極性或在體系內形成了共軛體系所引起[23]。圖譜中并未出現新的吸收峰，表明多酚與果膠復合過程中無新的不飽和鍵生成[22]。

2.2 紅外光譜分析

本實驗通過紅外光譜進行相互作用力的分析，如圖2所示，樣品具有典型的PT紅外譜圖特征。在3 000～3 700 cm-1處出現的寬峰是由PT及相應多酚的分子間或分子內的O—H的伸縮振動引起的。2 933 cm-1處的吸收峰由果膠半乳糖醛酸甲酯或CH2基團上的C—H伸縮振動引起[25]。不同樣品在此吸收峰處發(fā)生不同程度的藍移現象，表明C—H鍵參與3 種多酚與果膠的相互作用。1 747 cm-1及1 622 cm-1處的吸收峰分別為PT中酯化羧基C＝O的伸縮振動及未發(fā)生酯化的游離羧基的C＝O伸縮振動，可根據這2處的吸收峰計算PT酯化度[26]。由圖2可看出，1 747 cm-1處峰明顯高于1 622 cm-1，因此樣品均為高酯果膠，且可觀察到體系中有多酚加入后，酯化度有降低趨勢，這與酯化度的測定結果保持一致。1 040～1 060、1 015 cm-1處吸收峰表明復合體系中有阿拉伯糖及糖醛酸存在；740～780 cm-1處的吸收峰表明復合體系是由α-糖苷鍵連接而成[27]。由紅外光譜可知，PT與PHL、CGA及EC之間可能發(fā)生了非共價相互作用，其中分子間或分子內氫鍵、C—H、C＝O鍵均參與了反應。

圖2 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

2.3 掃描電鏡分析

圖3 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由圖3可知，PT的微觀結構整體呈現出板狀形態(tài)，表面粗糙多孔，有類似蜂窩狀的結構穿插其中。與PT相比，PT-PHL復合體系表面較為平滑，隨著PHL濃度的增加，體系的整體性降低，出現片狀結構構型，這一形貌特征與范新景等[22]的研究結果相似。加入CGA后的復合體系先是變得緊密，表面出現褶皺結構，而當濃度逐漸增大至0.22 mmol/L時，復合體系開始出現片狀結構，變得松散，這與本實驗中表觀黏度的變化一致，可能是由于PT與CGA之間的結合能力有限[28]或是多酚與果膠之間形成了聚合體所致[29]。隨著EC的加入，復合體系表面變得光滑，出現片狀結構，體系變得松散。根據掃描電鏡圖可知，多酚的引入會改變果膠原有的網絡構象，使得體系的結構發(fā)生改變。

2.4 流變學分析

2.4.1 表觀黏度分析

圖4 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系表觀黏度圖Fig.4 Apparent viscosity versus shear rate curves of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由圖4可知，不同多酚與PT的復合體系均表現出明顯的剪切變稀現象，這與梁迪[9]的研究結果一致。在低剪切速率條件下，復合體系的黏度迅速下降，PT是由鏈狀分子構成的大分子聚合物，其分子間會互相纏結形成較大黏度，而隨著剪切速率的增大，分子間的纏結作用減弱[27]；在高剪切速率條件下，PT的鏈狀分子因為會受到流層之間的剪切應力作用，分子構象遭到破壞，分子鏈之間的纏結數量降低，PT分子偏離自身平衡結構，來不及形成新的網絡構象，此時黏度對剪切速率的依賴程度較低，復合體系的黏度幾乎維持不變或略微下降[30]。此外，圖中還可觀察到隨著剪切速率的增加，各復合體系的剪切應力基本呈現線性增加的趨勢，并未出現屈服現象[20]。

表1 PHL、CGA、EC與PT混合體系Power-Law模型擬合參數Table 1 Power-Law model parameters for composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

表1為各復合體系樣品表觀黏度數據擬合情況，其中R2均大于0.99，擬合情況較好。KPL為復合體系的稠度系數，KPL數值越高，表明體系黏度越高。由表1可知，PHL與EC的加入對其與PT組成的復合體系的黏度有輕微影響，但影響并不顯著。0.08 mmol/L CGA可以增大復合體系的黏度，其余濃度則未有顯著影響，這與掃描電鏡在該濃度下變得緊密后逐漸疏松的現象相似，推測CGA濃度為0.08 mmol/L時與PT之間相互作用強度達到最大，之后隨濃度增大逐漸降低，可能與多酚與PT疏水相互作用的結合位點數量有關[31]。復合體系的非牛頓指數n值均小于1，表明多酚的引入并未改變體系的流體類型，多酚與果膠相互作用的復合體系較為穩(wěn)定[32]，所有復合體系均表現出假塑性流體的特征。n值越接近1，體系越接近于牛頓流體。多酚的加入使得體系假塑性流體特征略加強，但大多未達到顯著程度，其中0.08 mmol/L CGA能夠顯著增強體系假塑性。

2.4.2 溫度掃描分析

由圖5可知，隨著溫度的上升，復合體系的黏度下降。在25～65 ℃之間，復合體系黏度下降速率較快，表明溫度破壞了多酚與果膠的相互作用，可能是破壞了二者之間的氫鍵相互作用使得復合體系黏度下降[33]。當溫度超過65 ℃后，黏度下降速率降低，這可能與分子間疏水相互作用力有關[34]。也可能是溫度升高，分子熱運動加劇，分子之間的間距變大，削弱了分子之間的氫鍵相互作用力導致黏度降低[20]。不同濃度多酚與PT復合體系，其黏度變化趨勢相似，不同多酚之間有些許差別可能與不同多酚的結構有關，不同結構的多酚攜帶不同數量的羥基，與果膠之間可形成的氫鍵相互作用程度不同[16]。

圖5 不同PHL、CGA、EC與PT復合體系溫度掃描圖Fig.5 Temperature-dependent viscosity of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

表2 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系Arrhenius方程擬合表Table 2 Arrhenius model parameters for composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

由表2可知，數據擬合R2均大于0.940，擬合情況良好。Ea可以反映復合體系對于溫度的敏感程度，Ea越高，表明體系內的分子鏈剛性越強，體系黏度對溫度越敏感[35]。理論上，體系對溫度越敏感，體系的溫度越高，其內部分子熱運動越快，分子間的相互作用力就越小[36]。0.03 mmol/L PHL的引入能夠降低體系活化能，降低了PT溶液黏度對溫度的敏感程度，表明0.03 mmol/L PHL與PT之間的相互作用力在熱環(huán)境下較為穩(wěn)定，可能與果膠甲基群和PHL的吡喃雜環(huán)（C環(huán)）之間形成的疏水相互作用有關[37]。0.08 mmol/L CGA與PT復合體系的活化能較高，黏度對溫度較敏感，可能是因為二者之間相互作用（氫鍵）較強，形成的分子鏈的鋼性較大所致[20]，這也可以解釋在該濃度下復合體系黏度的增大。

2.5 熱重分析

為了探究不同多酚對復合體系熱穩(wěn)定性的影響，從營養(yǎng)健康及穩(wěn)定性角度出發(fā)，本實驗選取最大濃度多酚與果膠形成的復合體系進行熱重分析。其中實線為樣品的熱重圖像，反映物質質量隨溫度的變化，虛線為熱重曲線的一階導數，表明樣品質量損失所經過的階段。由圖6及表3可知，多酚與PT的復合體系熱損失主要可分為3 個階段：第1階段為30～100 ℃，這一階段主要為自由水的損失，在此階段樣品的質量損失率在8%～12%之間。第2階段主要發(fā)生在100～200 ℃，此時的質量損失主要為體系內結合水及其他揮發(fā)性物質的損失，質量損失率為5%～8%。多酚的加入會降低體系的質量損失率，可能是因為多酚與果膠之間形成了氫鍵，降低了果膠對水的結合作用，使得復合體系內的結合水含量下降[9]。復合體系主要的質量損失發(fā)生在第3階段（200～300 ℃），在此階段復合體系質量迅速下降，此時主要為果膠受熱分解導致的質量快速損失[25]。在多酚的存在下，復合體系在第3階段的質量損失較PT低，其中0.70 mmol/L EC對復合體系質量損失率的降低程度最大。因此認為多酚能夠提高復合體系的熱穩(wěn)定性，這與托爾坤·買買提[20]的實驗結果相似。

表3 PHL、CGA、EC與PT復合體系在不同溫度范圍的質量損失率Table 3 Mass loss rates of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations in different temperature ranges

2.6 穩(wěn)定性分析

2.6.1 粒徑分析

圖7 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系粒徑大小Fig.7 Particle sizes of composite systems containing PT and PHL,CGA or EC at different concentrations

由圖7可知，相較于PT溶液，3 種多酚均能降低模擬濁汁復合體系的平均粒徑大小。其中0.08 mmol/L PHL對體系粒徑的降低效果最為顯著，由1 365 nm降至1 072 nm。表明多酚的引入可能起到一定的抑制果膠分子自聚集的作用，使得溶質粒子分散更加均勻[27]。隨著多酚濃度的上升，溶液粒徑呈現略微增加的趨勢，可能是PT與多酚之間形成了分子聚集體并發(fā)生纏結所致，這與Mamet等[29]的實驗結果相似。

2.6.2 濁度及濁度保留率分析

表4顯示了不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合后體系的濁度變化。由紫外光譜圖可知在650 nm波長處果膠與多酚均無吸收峰存在，因此選取650 nm為濁度測量波長。引入不同濃度的PHL、CGA、EC后，體系濁度均有一定程度的下降，其中0.70 mmol/L PHL，0.42 mmol/L CGA以及0.08 mmol/L EC與PT復合體系濁度顯著降低。3 種多酚中PHL對體系濁度的影響程度最大，吸光度由0.053 7下降至0.051 0。主要是由于不同結構的多酚與果膠的結合能力不同所致[13]。溶液的渾濁穩(wěn)定性可用溶液經離心力作用后其濁度保留率來衡量，保留率越大，表明溶液的渾濁穩(wěn)定性越好。0.03 mmol/L PHL與PT復合體系的濁度保留率有所增加，其余多酚與果膠復合體系的濁度保留率均無顯著變化。根據粒徑結果可知，當體系內PHL濃度大于0.08 mmol/L時，復合體系的粒徑增大，穩(wěn)定性輕微下降，因此綜合得到，0.03mmol/L PHL對復合體系的穩(wěn)定性維持效果較好。

表4 不同濃度PHL、CGA、EC與PT復合體系濁度及濁度保留率Table 4 Turbidity and turbidity retention of composite systems containing PT and PHL, CGA or EC at different concentrations

3 結 論

不同濃度的PHL、CGA、EC均會對PT的結構產生影響，使得體系表面變得光滑，出現片狀結構。3 種多酚與PT之間發(fā)生了非共價相互作用，其中分子內、分子間氫鍵、C—H、C＝O鍵均參與反應，多酚與PT之間并未生成新的不飽和鍵。復合體系均為假塑性流體，體系內引入多酚后流體類型不發(fā)生改變，3 種多酚均可以提高復合體系的熱穩(wěn)定性，降低其在高溫下的質量損失率，降低體系粒徑及濁度，CGA、EC對體系的濁度保留率無顯著影響。不同多酚與PT的相互作用程度不盡相同，但整體趨勢相似。在一定的濃度范圍內，3 種多酚均能夠增強體系的穩(wěn)定性，其中PHL與CGA對體系的作用效果強于EC；這與其分子結構，羥基數量及羥基位置有關。多酚對復合體系穩(wěn)定性的影響與其在復合體系中的濃度并未顯現出一定的規(guī)律性，其中0.08 mmol/L CGA與PT之間的氫鍵相互作用力較強，可以增加復合體系的黏度及假塑性，提升復合體系對溫度的敏感程度，降低體系粒徑；0.03 mmol/L PHL能夠降低復合體系的活化能，提高復合體系的濁度保留率，降低體系粒徑。從穩(wěn)定性及相互作用效果綜合得到，0.03 mmol/L PHL及0.08 mmol/L CGA對維持復合體系穩(wěn)定性的效果較好。在后續(xù)研究中，可進一步明確這3 種多酚與PT之間的相互作用機制，探究不同多酚濃度及不同結構對相互作用效果的影響，或針對其他內源因子做更深入的研究，為濁汁的原料選擇提供依據。