基于宏基因組學(xué)技術(shù)不同地區(qū)蛋源表面微生物的比較

李 俠，溫佳奇，王秀娟，宋雨奇，代偉長(zhǎng)，王玉華

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 春 130118）

我國(guó)是生產(chǎn)和消費(fèi)禽蛋大國(guó)，禽蛋和蛋制品的質(zhì)量與安全也備受消費(fèi)者關(guān)注[1]。蛋源在母禽生殖道及生產(chǎn)環(huán)境中會(huì)受到污染，表面帶有大量微生物，未經(jīng)處理的禽蛋在打蛋過(guò)程中微生物會(huì)感染到蛋液[2-4]；液蛋制品加工時(shí)，分離、過(guò)濾及均質(zhì)過(guò)程中蛋液也會(huì)因加工器械等未消毒完全而被污染。雖然灌裝后的液蛋制品會(huì)進(jìn)行滅菌，但前期大量微生物的污染會(huì)導(dǎo)致滅菌難度大，滅菌效果差，影響液蛋制品的質(zhì)量及保質(zhì)期。因此，微生物污染源的控制非常重要[5]，在可能產(chǎn)生污染的過(guò)程里，蛋源的微生物污染數(shù)量最多，污染最嚴(yán)重，對(duì)蛋源微生物來(lái)源的控制成為控制液蛋制品微生物污染源重中之重。蛋源表面的微生物種類(lèi)繁多，常見(jiàn)的微生物有大腸桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、變形桿菌屬、產(chǎn)氣單胞菌屬、葡萄球菌屬、沙門(mén)氏菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、副大腸桿菌屬等[6-8]。據(jù)相關(guān)材料報(bào)道，輸卵管帶菌的家禽所產(chǎn)的蛋，70%是帶菌蛋，所帶細(xì)菌如雞白痢沙門(mén)氏菌、雞副傷寒沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌等[9-10]。禽蛋腐敗的主要原因是微生物的存在，主要有非致病性細(xì)菌和霉菌。分解蛋白質(zhì)的微生物主要是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、變形桿菌屬、梭菌屬、葡萄球菌屬、無(wú)色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、黃桿菌屬和腸桿菌屬等[11-12]；分解糖的微生物有大腸桿菌屬、枯草桿菌屬和丁酸梭狀芽孢桿菌屬等[13]；分解脂肪的微生物主要有假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬等[14]。此外，還可能存在一些不可培養(yǎng)的微生物，特別是致病菌的存在，如霍亂弧菌和大腸埃希氏雖均具有生命活性，但不能培養(yǎng)[15-17]，而這些未被培養(yǎng)的種類(lèi)卻代表了巨大的多樣性，此類(lèi)微生物可能存在潛在危害。因此，對(duì)蛋源表面微生物多樣性的探究對(duì)后續(xù)消毒處理方法的選擇具有重要意義，有助于液蛋制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

雞蛋表面微生物種類(lèi)繁多，利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法雖然能檢測(cè)出常見(jiàn)食品致病菌的數(shù)量，但并不能將所有菌相完全高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)，并且傳統(tǒng)方法耗時(shí)耗力，將高通量測(cè)序宏基因組技術(shù)應(yīng)用于蛋源表面微生物多樣性的檢測(cè)，從宏觀角度準(zhǔn)確高效地檢測(cè)出微生物種類(lèi)，為后期對(duì)蛋源前處理消毒方法的優(yōu)化研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也拓寬了宏基因組學(xué)技術(shù)在食品領(lǐng)域的探索。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)技術(shù)，分析吉林、安徽、北京和河北4 個(gè)不同地區(qū)蛋源表面微生物多樣性，確定蛋源表面微生物菌相分布，并分析不同蛋源之間的差異性，為蛋源消毒前處理方法的優(yōu)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)日產(chǎn)新鮮雞蛋，分別來(lái)自吉林、北京、河北、安徽地區(qū)的大規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖企業(yè)（存欄量達(dá)300萬(wàn) 羽以上）。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DNA試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AUM220電子分析天平 日本島津公司；MCV-131超凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AHWY-200B超低溫冰箱 日本三洋公司；YX280立式壓力蒸汽滅菌器、YX280立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療有限公司；Infinile M200多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；DHG-9146電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

在同一月份，分別從吉林、北京、河北、安徽4 個(gè)地區(qū)的雞場(chǎng)進(jìn)行樣品采集，隨機(jī)采集每個(gè)雞場(chǎng)當(dāng)日產(chǎn)出的新鮮雞蛋，用滅菌生理鹽水棉拭子均勻擦拭蛋殼表面，每組樣品50 枚，每個(gè)地區(qū)采6 組平行樣品。取樣后，-80 ℃冷凍保存，用于后續(xù)蛋源蛋殼表面微生物多樣性分析。

1.3.2 細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定

將擦拭蛋源表面的棉拭子充分溶于無(wú)菌生理鹽水、混勻，獲得樣品菌液，然后進(jìn)行稀釋，分別取稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5的樣品，按照GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定》進(jìn)行蛋源表面菌落總數(shù)的測(cè)定。

1.3.3 DNA的提取

將擦拭蛋源表面的棉拭子充分溶于滅菌生理鹽水，采用EasyPureGenomic DNA試劑盒進(jìn)行DNA提取，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 微生物多樣性分析

通過(guò)蛋源表面微生物16S rRNA基因的高度可變區(qū)V3和V4進(jìn)行測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物多樣性分析。實(shí)驗(yàn)流程為：提取的DNA→靶標(biāo)片段PCR擴(kuò)增→擴(kuò)增產(chǎn)物回收和純化→擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量→測(cè)序文庫(kù)制備→高通量測(cè)序，實(shí)驗(yàn)測(cè)序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。通過(guò)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）對(duì)獲得的序列進(jìn)行分類(lèi)，并且通常使用97%的序列相似度作為OTU分區(qū)閾值，其等于分類(lèi)中的物種水平。根據(jù)不同樣品中OTU的豐度分布，評(píng)價(jià)每個(gè)樣品的多樣性水平，使用稀疏曲線反映測(cè)序深度是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。分析不同分類(lèi)水平的各地區(qū)微生物的具體組成，對(duì)吉林、安徽、北京和河北4 個(gè)地區(qū)的蛋源表面微生物菌群進(jìn)行α多樣性、群落結(jié)構(gòu)和β多樣性分析比較。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin 2017、GraphPad Prism 7.0.軟件和Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)與分析。P＜0.05為差異顯著、P＜0.01為差異極顯著、P＜0.001為差異高度顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)蛋源表面微生物OTU分布

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)不同樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，本研究選用相似度為97%的OTU，結(jié)果如圖1所示。吉林地區(qū)蛋源表面微生物OTU總的數(shù)目為2 341，其中獨(dú)有的OTU數(shù)目為1 285，河北地區(qū)蛋源表面微生物OTU總的數(shù)目為1 216，其中獨(dú)有的OTU數(shù)目為328，北京地區(qū)蛋源表面微生物OTU總的數(shù)目為1 708，其中獨(dú)有的OTU數(shù)目為295，安徽地區(qū)蛋源表面微生物OTU總的數(shù)目為1 301，其中獨(dú)有的OTU數(shù)目為135。4 個(gè)地區(qū)共有的OTU數(shù)目為218，吉林和河北地區(qū)共有的OTU數(shù)目為488，吉林和北京地區(qū)共有的OTU數(shù)目為765，吉林和安徽地區(qū)共有的OTU數(shù)目為574，河北和北京地區(qū)共有的OTU數(shù)目為675，河北和安徽地區(qū)共有的OTU數(shù)目為540，北京和安徽地區(qū)共有的OTU數(shù)目為957。由OTU數(shù)目分布Venn圖可以初步得出，吉林地區(qū)微生物豐富度最高，北京和安徽地區(qū)微生物最相似。

圖1 不同地區(qū)蛋源表面微生物OTU的Venn圖Fig.1 Venn diagram showing unique and shared microbial OTUs among eggs from different regions

2.2 不同地區(qū)蛋源表面微生物α多樣性分析

α多樣性即每個(gè)樣本群落的多樣性，可用Shannon指數(shù)曲線和α多樣性指數(shù)等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.2.1 不同地區(qū)蛋源表面微生物Shannon指數(shù)曲線

Shannon指數(shù)曲線是反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性[18]。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。可以用來(lái)判斷測(cè)序的有效性[19]。本實(shí)驗(yàn)選用Shannon指數(shù)曲線對(duì)測(cè)序有效性進(jìn)行分析。

圖2 不同地區(qū)蛋源表面微生物Shannon指數(shù)曲線Fig.2 Shannon index curves showing microbial community diversity on eggs from different regions

如圖2所示，橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣品中隨機(jī)抽取序列的總數(shù)；縱坐標(biāo)表示微生物多樣性的Shannon指數(shù)。曲線的長(zhǎng)度反映了樣品測(cè)序的數(shù)量。曲線的漸變程度反映了測(cè)序深度對(duì)觀察樣品多樣性的影響，曲線趨于平坦，表明測(cè)序已趨于飽和，增加測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法再找到更多的OTU。隨著樣品測(cè)序數(shù)量的不斷增加，當(dāng)其大于5 000時(shí)，曲線已趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，足夠反應(yīng)樣本中包含的微生物多樣性。

2.2.2 不同地區(qū)蛋源表面微生物α多樣性指數(shù)

對(duì)于微生物群落的α多樣性可以通過(guò)Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映。一般而言，Chao1指數(shù)或ACE指數(shù)越大，表明群落的物種種類(lèi)越多、豐富度越高[20]。而Shannon多樣性指數(shù)不僅反映群落的豐富度，還綜合考慮了群落的均勻度。Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高；Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)類(lèi)似，是群落多樣性的評(píng)價(jià)常用指數(shù)之一，Simpson指數(shù)值越高，說(shuō)明群落的多樣性越高[21]。

表1 不同地區(qū)蛋源表面菌群微生物多樣性指數(shù)表Table 1 Microbial diversity indexes of surface microbial flora in eggs from different regions

由表1可知，4 個(gè)地區(qū)都具有較高的菌群多樣性。其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表現(xiàn)為JL＞BJ＞AH＞HE，說(shuō)明在菌群豐富度上按照吉林、北京、安徽、河北的順序依次降低；而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表現(xiàn)為JL＞BJ＞HE＞AH，表明在群落多樣性上按照吉林、北京、河北、安徽的順序依次降低。由此可知，4 個(gè)地區(qū)相比，吉林地區(qū)蛋源表面微生物的群落豐富度及群落多樣性均最高。

2.3 不同地區(qū)蛋源表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 不同地區(qū)蛋源表面基于門(mén)水平的微生物分析

根據(jù)OTU劃分和分類(lèi)地位鑒定，獲得了吉林、安徽、北京和河北在門(mén)、綱、目、科和屬分類(lèi)水平的具體微生物分布狀況。在本研究中，選擇門(mén)和屬這2 個(gè)水平，對(duì)4 個(gè)地區(qū)的微生物進(jìn)行分析。4 個(gè)地區(qū)蛋源基于門(mén)水平上的群落組成如圖3所示。

吉林地區(qū)的蛋源樣品細(xì)菌組成為放線菌門(mén)（Actinobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），相對(duì)豐度分別為49.12%、31.93%、8.41%及4.37%，還包括少量的異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）以及綠彎菌門(mén)（Chloroflex）；安徽地區(qū)的蛋源樣品細(xì)菌組成為Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別為77.03%、18.21%及2.90%，還包括少量的Cyanobacteria；北京地區(qū)的蛋源樣品細(xì)菌組成為Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別為57.93%、37.68%及2.93%，還包括少量的Cyanobacteria；河北地區(qū)的蛋源樣品細(xì)菌組成為Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別為84.28%、10.42%及3.12%，還包括少量的Cyanobacteria。安徽、北京和河北3 個(gè)地區(qū)蛋源菌群組成相似，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為Proteobacteria，而在吉林地區(qū)Proteobacteria豐度僅為8.40%，變形菌門(mén)中包括很多種食品中常見(jiàn)的致病菌，如幽門(mén)螺桿菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌等，吉林地區(qū)蛋源表面此類(lèi)致病菌可能遠(yuǎn)低于其他3 個(gè)地區(qū)；而吉林地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)Actinobacteria在其他3 個(gè)地區(qū)豐度較低， Chloroflex僅在吉林地區(qū)發(fā)現(xiàn)。因此，吉林地區(qū)與其他3 個(gè)地區(qū)在蛋源表面微生物菌群有很大差異，但由于其變形菌門(mén)豐度較低，含有常見(jiàn)致病菌的風(fēng)險(xiǎn)可能低于其他3 個(gè)地區(qū)，因此更適合作為蛋源生產(chǎn)產(chǎn)區(qū)。

圖3 基于門(mén)分類(lèi)水平上的不同地區(qū)樣品菌群分布圖Fig.3 Distribution of microflora on eggs from different regions at the phylum level

2.3.2 不同地區(qū)蛋源表面基于屬水平的微生物分析

圖4 基于屬分類(lèi)水平上的不同地區(qū)樣品菌群分布圖Fig.4 Distribution of microflora on eggs from different regions at the genus level

如圖4所示，吉林地區(qū)的蛋源樣品中豐度較高的菌屬為考克氏菌屬（Kocuria）占10.1%，短狀桿菌屬（Brachybacterium）占9.83%，榛狀桿菌屬（Corynebacterium1）占5.2%，uncultured占7.2%，微球菌屬（Micrococcus）占3.95%，羅思氏菌屬（Rothia）占3.80%，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）占0.96%，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）占0.93%；安徽地區(qū)蛋源樣品中豐度較高的菌屬為Acinetobacter占75.52%，氣球菌屬（Aerococcus）占8.40%，乳酸菌屬（Lactobacillus）占2.82%，Bromus tectorum占1.55%，葡萄球菌屬（Staphylococcus）占1.20%；北京地區(qū)蛋源樣品中豐度較高的菌屬為Acinetobacter占26.42%，Psychrobacter占20.44%，Lactobacillus占15.12%，Aerococcus占14.36%，Staphylococcus占3.53%，uncultured占2.11%，埃希氏菌志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）占3.15%；河北地區(qū)蛋源樣品中豐度較高的菌屬為Acinetobacter占26.70%，Psychrobacter占13.69%，Lactobacillus占7.32%，假單胞菌屬（Pseudomonas）占16.28%，Massillia占15.39%。安徽、北京和河北3 個(gè)地區(qū)菌屬分布較為相似，優(yōu)勢(shì)菌屬均為Acinetobacter，而吉林地區(qū)Acinetobacter豐度僅為0.89%，Brachybacterium為吉林地區(qū)獨(dú)有的豐度較高的菌屬。由此表明安徽、北京和河北3 個(gè)地區(qū)菌屬分布較為相似，優(yōu)勢(shì)菌屬均為條件致病菌的Acinetobacter，而且存在其他致病菌屬，即安徽地區(qū)蛋源樣品Staphylococcus，北京地區(qū)蛋源樣品Staphylococcus和Escherichia-Shigella，河北地區(qū)蛋源樣品Pseudomonas。可見(jiàn)不同地區(qū)蛋源表面微生物屬水平都存在一定差異性，相對(duì)豐度差異顯著，北方地區(qū)與中部以南地區(qū)差異極顯著（P＜0.01），北方地區(qū)更適宜禽蛋生產(chǎn)。同時(shí)，為保障液蛋制品的安全性，蛋制品企業(yè)應(yīng)該根據(jù)蛋源微生物的種類(lèi)適當(dāng)調(diào)整消毒處理方法。

2.3.3 不同地區(qū)蛋源表面微生物多樣性聚類(lèi)熱圖分析

根據(jù)不同樣本的豐度分布或相似程度所組成的聚類(lèi)分析圖。其目的是通過(guò)聚類(lèi)，可以區(qū)分高豐度和低豐度的分類(lèi)單位，并且由顏色組成梯度反映樣本之間的群落組成相似性。

如圖5所示，4 個(gè)地區(qū)蛋源表面豐度前50 位的菌屬聚類(lèi)熱圖，紅色代表相應(yīng)樣品中豐度較高的屬，綠色代表豐度較低的屬。在吉林地區(qū)豐度較高的29 個(gè)屬在其他地區(qū)豐度較低；而河北地區(qū)豐度較高的屬為Brevundimonas、Pseudomonas、Massillia、Alkanindiges、Cupriavidus、Sphingomonas和Ochrobactrum；安徽和北京地區(qū)蛋源屬的分布最為相似，豐度較高的屬為Acinetobacter、Jeoigalicoccus、Fackiamia、Lysinbacliius、Psychrobacter。

圖5 不同地區(qū)蛋源表面微生物多樣性聚類(lèi)分析熱圖Fig.5 Heatmap of clustering analysis for microbial community diversity on eggs from different regions

2.4 不同地區(qū)蛋源表面微生物β多樣性分析

β多樣性分析的主要目的是評(píng)價(jià)不同樣本之間群落結(jié)構(gòu)的相似性。主要通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）、多維尺度分析（multidime-nsional scaling，MDS），對(duì)群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然分解并通過(guò)對(duì)樣本排序，從而觀察樣本之間的差異。

2.4.1 不同地區(qū)蛋源表面菌群PCA

菌群的PCA主要是通過(guò)線性變換將菌群OTU豐度矩陣組合，并通過(guò)線性變換將其投影到較低維空間坐標(biāo)系中。從而達(dá)到降維的目的，簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并顯示樣本的自然分布[22]。PCA可以從原始數(shù)據(jù)中提取樣本之間最重要的差異，并根據(jù)這些差異在新的低維坐標(biāo)系中對(duì)樣本進(jìn)行排序。使樣本接近新坐標(biāo)系可以最大程度地恢復(fù)樣本之間的實(shí)際差異[23]。因此，通過(guò)分析PCA可以知道群落樣本的主要分布特征，從而量化樣本之間的差異和相似性。

圖6 不同地區(qū)蛋源表面菌群PCA二維排序圖Fig.6 Two-dimensional sequencing diagram of PCA analysis for discrimination of microbial community composition on eggs from different regions

如圖6所示，橫坐標(biāo)為PC1，其貢獻(xiàn)率為74.26%?？v坐標(biāo)為PC2，貢獻(xiàn)率為13.65%。這2 個(gè)PC是樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的主要因子。在PC1方向上，吉林和河北地區(qū)蛋源樣品點(diǎn)與安徽地區(qū)樣品點(diǎn)分布差異顯著（P＜0.05），樣本點(diǎn)處于PC1水平的2 個(gè)極端；在PC2水平上，吉林地區(qū)樣品點(diǎn)與河北地區(qū)樣本點(diǎn)分布差異顯著（P＜0.05），吉林地區(qū)樣本點(diǎn)分布于Y軸的下方，河北地區(qū)樣本點(diǎn)分布于Y軸的上方。由此可知，吉林地區(qū)蛋源與河北地區(qū)蛋源菌群結(jié)構(gòu)及微生物多樣性差異極顯著（P＜0.01）。

2.4.2 基于UniFrac距離的NMDS非度量多維尺度分析

NMDS分析是基于樣本距離矩陣的MDS分析方法。因此，在特定的距離尺度下描述了樣本的分布特征。NMDS分析對(duì)樣本距離進(jìn)行排序，以使低維空間中的樣本的順序盡可能彼此接近。因此，NMDS分析不受樣本距離值的影響，僅考慮彼此之間的大小關(guān)系[24]。

圖7 不同地區(qū)蛋源表面菌群NMDS分析的二維排序圖Fig.7 Two-dimensional sequencing diagram of NMDS analysis for discrimination of microbial community composition on eggs from different regions

由圖7A可知，僅考慮OTU在樣本中存在與否的情況下，安徽地區(qū)和北京地區(qū)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高，而吉林地區(qū)與河北地區(qū)樣本差異性大，這與PCA中得到的結(jié)論吻合。而考慮由于群落豐度梯度導(dǎo)致差異的情況，如圖7B可以看出，吉林地區(qū)樣本與其他3 個(gè)樣本之間有很大差異。因此，無(wú)論是否考慮OTU的豐度，吉林地區(qū)樣本與其他地區(qū)差異都較大。

3 討 論

蛋源微生物污染一直是蛋品領(lǐng)域值得研究的問(wèn)題，采用高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)技術(shù)能夠一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，高效準(zhǔn)確地測(cè)定出蛋源表面所有已知微生物菌群分布，它在分析微生物的群落結(jié)構(gòu)時(shí)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)從環(huán)境樣本中直接獲取總DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序[25-27]，用16S rRNA基因的測(cè)序數(shù)據(jù)估計(jì)微生物群落的物種構(gòu)成，更加真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性[28-29]，對(duì)蛋源微生物有一個(gè)宏觀的了解，可以詳細(xì)地掌握蛋源表面所有基因庫(kù)里已知菌屬的情況；同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)蛋源表面微生物除了已知的菌屬外，還存在一定量未知菌屬，為今后更加深入研究蛋源表面微生物種類(lèi)奠定良好基礎(chǔ)，也為后續(xù)蛋源表面微生物多樣性研究提供理論依據(jù)。本研究選擇吉林、北京、河北、安徽4 個(gè)地區(qū)作為采樣地區(qū)，是因?yàn)檫@4 個(gè)地區(qū)為國(guó)內(nèi)主要蛋源產(chǎn)區(qū)，安徽以南溫度過(guò)高，不適合大規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖，因此沒(méi)有代表性。研究目的在于探究北部、中部和南部蛋源在菌群多樣性上的差異性，從結(jié)果可以看出吉林地區(qū)的微生物多樣性和豐富度與其他3 個(gè)地區(qū)差異性最大，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)也不同，但值得關(guān)注的是，擁有較多食品致病菌的變形菌門(mén)在吉林地區(qū)豐度顯著低于其他3 個(gè)地區(qū)，蛋液感染此類(lèi)病源菌的風(fēng)險(xiǎn)也隨之減少；而且不同地區(qū)樣品微生物屬水平差異更大，吉林地區(qū)的蛋源樣品中豐度較高的菌屬為Kocuria和Brachybacterium分別為10.1%和9.83%，目前還沒(méi)有關(guān)于這2 個(gè)屬存在致病菌的報(bào)道；安徽、北京和河北3 個(gè)地區(qū)菌屬分布較為相似，優(yōu)勢(shì)菌屬均為條件致病菌的Acinetobacter，另外還存在致病菌屬。Acinetobacter是條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)易引起機(jī)體感染，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要機(jī)會(huì)致病菌之一?？梢鸷粑栏腥尽⊙Y、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口及皮膚感染、泌尿生殖道感染等。重癥者可導(dǎo)致死亡。安徽地區(qū)蛋源樣品致病菌屬為Staphylococcus，北京地區(qū)蛋源樣品致病菌屬為Staphylococcus和Escherichia-Shigella，河北地區(qū)蛋源樣品致病菌屬為Pseudomonas。從相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可知，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋源表面微生物的研究多采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，集中在細(xì)菌的數(shù)量檢測(cè)上，如Moyle等[30]對(duì)自由放養(yǎng)的2 個(gè)農(nóng)場(chǎng)的雞蛋表面細(xì)菌測(cè)定結(jié)果分別為3.84（lg（CFU/枚））和3.69（lg（CFU/枚）），分離培養(yǎng)得到腸桿菌科細(xì)菌平均水平為0.98（lg（CFU/枚））和0.68（lg（CFU/枚））；薛艷蓉等[31]報(bào)道蛋殼表面細(xì)菌數(shù)一般在103CFU/枚。傳統(tǒng)微生物研究采用實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)，只有少數(shù)的微生物能夠被成功培養(yǎng)鑒定出來(lái)，而且用時(shí)長(zhǎng)、篩選菌屬也不夠廣泛，不能進(jìn)一步分析微生物群落組成及其多樣性。宏基因組學(xué)克服了這一限制，以基因組技術(shù)為基礎(chǔ)通過(guò)對(duì)環(huán)境中全部DNA系統(tǒng)全面的研究，從宏觀角度準(zhǔn)確高效地對(duì)微生物種類(lèi)進(jìn)行測(cè)定。本研究中選取安徽、北京、河北、吉林地區(qū)作為取樣點(diǎn)，涉及范圍廣泛，利用宏基因組學(xué)技術(shù)經(jīng)過(guò)對(duì)蛋源表面菌群多樣性分析，結(jié)果表明以吉林地區(qū)為代表的北方，更適合作為蛋源的生產(chǎn)區(qū)，蛋源表面微生物的菌群多樣性分析結(jié)果為后續(xù)消毒處理方法的優(yōu)化奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

采用高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)4 個(gè)地區(qū)蛋源表面菌群多樣性系統(tǒng)分析，不同地區(qū)蛋源表面主要微生物門(mén)水平和屬水平都存在一定差異性，相對(duì)豐度差異更顯著，北方地區(qū)與中部以南地區(qū)差異明顯，北方地區(qū)更適宜大規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖。為保障液蛋制品的安全性，蛋制品企業(yè)應(yīng)該根據(jù)蛋源表面微生物組成情況適當(dāng)調(diào)整消毒處理方法，對(duì)液蛋制品加工行業(yè)有著重要意義。