響應面法優(yōu)化艾草精油抗菌微膠囊的制備工藝

翟媛媛，劉艷君，趙 瑞，王 進，高路明

(西安工程大學 紡織科學與工程學院，陜西 西安710048)

0 前言

艾草(Tsao essential oil)又稱黃草，為菊科植物，生長于低海拔至中海拔地區(qū)的荒地、路旁及山坡等地。艾草是一種來源廣泛的植物和中藥材，在我國南方也是一種食材[1]?，F代醫(yī)學藥理研究表明艾草是一種廣譜抗菌抗病毒的植物[2]，具有祛濕、散寒、止血、鎮(zhèn)靜、消炎、護肝利膽等功效[3－5]，還對多種病毒和細菌都有一定的抑制和殺傷作用[6－7]，對呼吸道疾病也有一定的防治作用。

艾草精油是從艾草的莖、葉中提取的精華萃煉而成的一種揮發(fā)性精油，其主要的化學成分有:萜烯類化合物(4－萜烯醇與6－芹子烯－4－醇等)、桉油醇、石竹烯氧化物等[8]。這些酚類、酮類[9－10]、酯類物質的存在，使其具有芳香[11]、抑菌、消炎[12]、抗感染[13]、鎮(zhèn)痛、利尿、祛痰等功能，這些優(yōu)異的功效使其在紡織品及醫(yī)療保健品領域有廣泛的應用前景。但艾草精油的物理化學性不穩(wěn)定，在空氣中極易揮發(fā)，受環(huán)境影響較大，限制了艾草精油及其相關產品的開發(fā)[14－16]。微膠囊化可以有效地提高這類揮發(fā)油的穩(wěn)定性[17]，延緩精油的釋放速度及保護精油不受外界環(huán)境影響等[18]。目前，市場上對于艾草精油的微囊化基本都是沒有緩釋作用的，這類微囊只有通過機械外力作用(如摩擦)，使微膠囊囊壁破裂，精油便能瞬間全部釋放。而對于自然狀態(tài)下，不受任何機械外力作用，便可緩慢釋放芯材的緩釋型膠囊仍處于實驗研究階段[19]。因此，本研究基于前期的探索，以明膠與殼聚糖做為壁材，采用復凝聚法制備緩釋型芳香、抗菌艾草精油微膠囊，在單因素探究的基礎上，以包埋率作為響應曲面法的響應值，優(yōu)化艾草精油微膠囊的制備工藝。

1 實驗部分

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

艾草精油(吉安華碩香料油有限公司)；殼聚糖(脫乙酰度≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；明膠(天津市天理化學試劑有限公司)；冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；司班－80(天津市科密歐化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠)；正己烷(天津市大茂化學試劑廠)；去離子水(自制)。

1.1.2 實驗儀器

A300－70G－S高剪切分散乳化機(上海昂尼儀器儀表有限公司)；DHC－0505－A低溫恒溫反應浴(鞏義市予華有限責任公司)；07HWS－2數顯恒溫磁力攪拌機(杭州儀表電機有限公司)；KQ32OOE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS－3C酸度計(上海科學儀器股份有限公司)；DHA－D(III)循環(huán)水真空泵(鞏義市英裕華玉儀器廠)；T－6系列紫外可見分光光度計(南京菲勒儀器有限公司)；Zetesizer Nano－ZS型馬爾文粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

1.2 實驗內容

1.2.1 微膠囊的制備

將一定比例的明膠、殼聚糖作為混合壁材，以艾草精油為芯材，戊二醛交聯劑，采用復凝聚法[20]制備艾草精油微膠囊。具體操作步驟如下:

(1)溶液A:將一定量的冰乙酸稀釋至1%，加入1g殼聚糖，攪拌使其充分溶解得到1%的殼聚糖醋酸溶液待用。溶液B:取1g的明膠用100mL的蒸餾水在50℃的水浴鍋中進行溶解，得到明膠溶液待用。

(2)取2g艾草精油和少量的乳化劑加入溶液B中混合均勻，采用高剪切分散乳化機在40℃的恒溫水浴中以5000r/min高速剪切乳化，得到均一水包油的乳液。

(3)將上述的水包油乳液轉移至恒溫磁力攪拌器上，以700r/min恒定速度攪拌的同時緩慢滴加溶液A，然后用10%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至5.7，持續(xù)攪拌30min。

(4)攪拌結束后，轉移至冰水浴中攪拌降溫至5℃以下，加入少量戊二醛攪拌固化，使其緩慢升至室溫，得到微膠囊懸浮液。最后經過濾、水洗及干燥制備得到艾草精油微膠囊粉末。

1.2.2 單因素優(yōu)化工藝

本研究先采用單因素篩選法，選用芯壁比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、均質速度(4000 r/min、5000 r/min、6000 r/min、7000 r/min、8000 r/min)、復凝聚pH值(5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2)、復凝聚攪拌速度(400 r/min、600 r/min、800 r/min、1000 r/min、1200 r/min)、固化時間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)等5個因素進行試驗，考察其對艾草精油微膠囊制備的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化工藝

在單因素分析的基礎上[21]，依據Box－Behnken試驗設計原理，選擇芯壁比、復凝聚pH及攪拌速度進行艾草精油微膠囊制備的響應曲面實驗設計，見表1。

表1 艾草精油微膠囊制備的響應曲面試驗設計

1.3 評價指標

1.3.1 微膠囊粒徑測定

采用馬爾文激光粒度儀對艾草精油微膠囊進行粒徑的測量及分析。具體操作步驟:移取濕態(tài)的微膠囊懸浮液0.5 mL，采用無菌蒸餾水進行稀釋定容至50 mL，備用待測。取少量的稀釋后的待測樣品置于比色皿中，儀器參數設置在溫度為25℃，波長為633 nm的條件下測定艾草精油微膠囊的粒徑分布。

1.3.2 微膠囊包埋率測定

取配制的0.2 uL/mL的艾草精油標準樣品，在紫外分光光度計200 nm～700 nm進行全波段掃描，確定最大吸收波長為294 nm。取0.500 mg艾草精油，用正己烷配制濃度為0.2 ug/mL、0.4 ug/mL、0.6 ug/mL、0.8 ug/mL、1 ug/mL艾草精油標準樣品，得到質量濃度－吸光度的線性方程:

y＝0.6115A＋0.2149 (1)，相關系數R2＝0.9973。

取1 mL艾草精油微膠囊懸浮液離心上清液，用正己烷定容至10 mL，在最大吸收波長294 nm處測定吸光度，由質量濃度－吸光度的線性方程計算未被包埋的艾草精油的質量m2，再根據芯材加入量m1計算包埋率(ξ)，計算公式如下:

其中:ξ為包埋率(%)；m1為起始加入芯材的質量(g)；m2為根據方程計算的未被包埋的艾草精油質量(g)。

1.3.3 微膠囊產率測定

產率是評價某一項技術過程的重要經濟指標[22]。該指標反映了在制備艾草精油微膠囊過程中芯材和壁材的利用率，計算公式如下:

其中:w代表微膠囊的產率(%)；m1代表起始加入芯材的質量(g)；m3代表起始加入壁材的質量(g)；m4代表干燥后所得微膠囊的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 芯壁比對艾草精油微膠囊制備的影響

圖1 芯壁比對微膠囊制備的影響

圖1顯示了不同芯壁比對微膠囊粒徑的影響，可以看出艾草精油微膠囊的平均粒徑與產率先變小而后增加，包埋率則先增加后減小的趨勢。這主要是由于復凝聚反應體系中芯材(艾草精油)的量較小時，體系中的壁材量過剩，芯材表面包裹壁材的量增加，囊壁變厚，微膠囊的粒徑越大；當芯材的量由1∶1增加至3∶1時，復凝聚體系中壁材不能完全包覆芯材，待反應結束后芯材會漂浮在整個反應體系上層，造成微膠囊的粘連、破損，因而使微膠囊的粒徑呈現上升趨勢，包埋率呈下降趨勢。當芯壁比為1∶1時，體系芯壁材的量達到平衡，微膠囊的粒徑最小同時包埋率也達到最大值66.56%。

2.1.2 均質速度對微膠囊制備的影響

由圖2可知，當均質速度由4000r/min增加至6000r/min時，可以看出微膠囊的粒徑達到最小3.845um，而包埋率與產率達到最大值63.56%、60.34%，當均質速度繼續(xù)增加至8000r/min時，平均粒徑呈現小幅增加，包埋率與產率都在減小。這主要是因為均質速度過大，所形成的微膠囊粒徑過小，在復凝聚過程中，過小的乳液滴容易聚集，形成較大粒徑的微膠囊，且在干燥前后都易出現團聚、粘黏的現象，造成微膠囊的包埋率與產率都出現小幅度的減小。因此，依據實驗數據分析確定艾草精油微膠囊制備工藝中均質速度為6000r/min。

圖2 均質速度對微膠囊制備的影響

2.1.3 復凝聚pH值對微膠囊制備的影響

圖3 復凝聚p H值對微膠囊制備的影響

從圖3可以看出，復凝聚pH對微膠囊的粒徑、產率及包埋率均有較大的影響。當復凝聚pH值為5.0時，微膠囊粒徑較大，包埋率與產率都極低，這主要是因為復凝聚反應體系中大量的明膠與殼聚糖仍獨立存在。當復凝聚pH為5.6時，微膠囊的粒徑達到最小，包埋率與產率都仍在增加，這是因為隨著pH值的增加明膠分子鏈上羧基所帶的負電荷增加與殼聚糖上帶正電荷的氨基產生靜電作用，形成更多的凝聚相并沉積在芯材(艾草精油)表面，因而艾草精油微膠囊的包埋率與產率都逐漸增加。當復凝聚pH繼續(xù)增加時，微膠囊的粒徑有所增加，但包埋率與產率有所減小。pH的調節(jié)是復凝聚法制備微膠囊的關鍵，因此需在pH值為5.6～6.2范圍內再進一步優(yōu)化。

2.1.4 復凝聚攪拌速度對微膠囊制備的影響

下頁圖4顯示了不同復凝聚攪拌速度下艾草精油微膠囊的粒徑、包埋率及產率的變化情況。可以看出，隨著復凝聚攪拌速度的增加，艾草精油微膠囊的粒徑先減小后增加，而包埋率與產率則呈現相反的趨勢。較低的攪拌速度使乳液狀油滴分散不均勻，油滴的密度較小容易上浮聚集成較大乳滴。其次，在復凝聚反應過程中較低攪拌速度易產生微膠囊團聚、粘黏，則會使微膠囊的包埋率與產率都下降。當復凝聚攪拌轉速超過600 r/min時，微膠囊的粒徑有小幅度的增加且包埋率與產率都有一定的下降趨勢。這是因為當攪拌速度過大時，不利于復凝聚反應體系中壁材在芯材表面的沉積，且過度的攪拌也會使成形的微膠囊發(fā)生破裂，導致芯材流出。因此，對于復凝聚攪拌速度需要在400 r/min～800 r/min范圍內再進一步優(yōu)化。

圖4 攪拌速度對微膠囊制備的影響

2.1.5 固化時間對微膠囊制備的影響

圖5 固化時間對微膠囊制備的影響

從圖5可看出，當固化時間過短時，艾草精油微膠囊的粒徑較大，包埋率與產率都較低。這主要是因為固化時間過短，固化劑與壁材間的交聯反應來不及發(fā)生且形成的交聯作用力小，形成的微膠囊囊壁較薄、強度低，在機械攪拌力的作用下，大量的囊壁會破損，造成微膠囊包埋率與產率較低。此外，未產生交聯作用的壁材會重新分解，并粘附在微膠囊表面而造成粒徑稍微偏大；當固化時間過長，則會因為交聯過度出現粘連，從而影響微膠囊的粒徑、包埋率與產率。因此，固化時間為90min為最佳。

2.2 響應面試驗結果與分析

響應面實驗設計方案及結果如表2所示。

表2 艾草精油微膠囊制備的響應面試驗設計方案及結果

對于表2實驗數據利用Design－ExpertV8.0.6軟件進行回歸擬合，得到艾草精油微膠囊的包埋率對上述3因子的二次多項回歸方程模型:

Y＝67.88－0.8962A＋0.4738B＋0.1250C－1.56AB＋0.8575AC－0.9475BC－5.64A2－5.32B2－3.93C2

該模型的方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3回歸模型方差分析可知，模型的F＝349.05，P＜0.0001表明該模型極度顯著，而失擬項F＝3.33，P＝0.1375表明失擬項不顯著，極度顯著的F值(P＜0.0001＜0.001)與不顯著的失擬值F(P＝0.1375＞0.05)說明實驗所建立的二次回歸方程模型的擬合度較好。其次，該模型的相關系數R2＝0.9978，這也說明了該模型與實際情況之間有高度的相關性，其中修正決定系數(Adj R2)為0.9949，信噪比(Precision)為48.5674(信噪比＞4)都表明該模型具有較高的置信度，因此也進一步證明了該二次回歸方程模型擬合度是非?？煽康?。

對于方程進行顯著性分析可知，一次項A(P＝0.0002＜0.001)表現出差異極度顯著性，一次項B(P＝0.0062＜0.01)表現出差異高度顯著，而一次項C(P＝0.3429)表現出差異不顯著，A2、B2與C2都表現出差異極度顯著。根據方差F值分析，3個因素對艾草精油微膠囊包埋率的影響順序為:芯壁比＞復凝聚pH＞攪拌速度。

圖6呈現了不同因素交互作用的響應面圖及相應的等高線圖可以對該模型進行進一步的驗證說明。圖(a)與(b)可看出，芯壁比與復凝聚pH相互作用的響應曲面圖較為陡峭，等高線圖呈橢圓形。當復凝聚pH值為5.9時，包埋率達到最佳。圖(c)與(d)可以看出，芯壁比與攪拌速度相互作用的響應曲面圖也較為陡峭，等高線圖呈橢圓形。當固定芯壁比時，微膠囊的包埋率隨著攪拌速度的增加(500 r/min到700r/min)，曲面呈現緩慢增加與緩慢減小的趨勢，在攪拌速度為600 r/min左右包埋率達到最佳值；而固定攪拌速度的值時，微膠囊的包埋率隨著芯壁比的增加呈現先緩慢增加后快速減小的趨勢，包埋率仍然在芯壁比為1∶1左右達到最高點。圖(e)與(f)可以看出，當固定其中一個因素時，艾草精油微膠囊的包埋率都隨另一因素的增加呈現先緩慢增加后快速減小的趨勢，微膠囊包埋率在復凝聚pH值為5.9、攪拌速度為600 r/min附近達到最高點。

2.3 模型驗證試驗

為了驗證模型的可靠性，通過對響應面實驗結果分析及對回歸方程模型求解可知艾草精油微膠囊制備的最理想的工藝條件為:芯壁比為1.185∶1、復凝聚pH值為5.91、攪拌速度為599.9r/min，包埋率為67.937%。為了方便實際生產過程中的操作，將最理想工藝條件進行修改更正得到微膠囊的最佳制備工藝為:芯壁比為1∶1、復凝聚pH值為5.9、攪拌速度為600r/min，以此進行3組平行實驗，得到微膠囊的平均包埋率為67.58%，與理論包埋率67.937%相差不大，誤差在可接受范圍內，且67.58%的包埋率符合大多數通過復凝聚法制備微膠囊的包埋率，因此表明通過響應面分析法進行艾草精油微膠囊制備工藝的優(yōu)化是合理的。

圖6 不同因素交互作用對包埋率的3D響應曲面圖:芯壁比與復凝聚pH(a與b)；芯壁比與攪拌速度(c與d)；復凝聚pH與攪拌速度(e與f)

3 結論

為了優(yōu)化艾草精油微膠囊制備工藝，首先采用單因素篩選方法，考察了各因素對微膠囊粒徑、包埋率及產率的影響；其次，選擇芯壁比、復凝聚pH與攪拌速度為響應因子，以包埋率為響應值，采用響應曲面實驗設計對各個響應因子與響應值之間的關系進行評估，得出3個因素對艾草精油微膠囊包埋率的影響順序為:芯壁比＞復凝聚pH＞攪拌速度；最終，確定了艾草精油微膠囊的最佳制備工藝為:芯壁比為1∶1、復凝聚pH值為5.9、攪拌速度為600r/min，得到微膠囊的平均包埋率為67.58%，與理論包埋率的誤差在可接受范圍內。本實驗所建立預測模型可用于艾草精油微膠囊包埋率，也為其它植物型揮發(fā)精油的微囊化提供理論依據。