劉志新，徐玉穎，姚培杰，許可凈，韓一鳴，傅強，萬正杰

華中農業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430070

芥菜(Brassicajuncea)是一種原產(chǎn)于我國的十字花科蕓薹屬蔬菜[1]。研究表明，西北地區(qū)為我國芥菜的初生起源地，四川盆地為我國芥菜的次生起源地[2]。目前，芥菜在全國各地均有栽培，其中，長江中下游地區(qū)和西南地區(qū)是主產(chǎn)區(qū)[3-5]。由于芥菜具有營養(yǎng)物質豐富、栽培容易、多樣化的加工與食用方式等特點，深受消費者歡迎[6]。芥菜作為一種常異花授粉植物，新品種主要來自于系統(tǒng)育種和優(yōu)勢雜交育種[7]，芥菜雜交種的營養(yǎng)體在生長勢、抗逆性、豐產(chǎn)性等方面較常規(guī)種具有明顯優(yōu)勢[8]，雜交種生產(chǎn)過程中，人工授粉存在種子生產(chǎn)成本過高、生產(chǎn)效率低下的問題，因此，細胞質雄性不育系在芥菜雜交種選育和制種中得到了大規(guī)模的應用[9]。

長期以來，雄性不育作為植物雜種優(yōu)勢利用和生殖發(fā)育研究的熱點內容之一，已取得大量研究成果[10]。余鳳群等[11]在對甘藍型油菜花藥敗育的研究中發(fā)現(xiàn)，花藥敗育主要分為小孢子發(fā)育異常、花粉母細胞發(fā)育異常、花粉囊發(fā)育異常3類。在微觀水平上，胡永敏等[12]進行了5種甘藍型油菜細胞質雄性不育系的細胞學觀察實驗，發(fā)現(xiàn)PolCMS材料的敗育大多發(fā)生在孢原細胞時期；許代香等[13]通過對甘藍型油菜顯性核不育系D3A的花藥敗育研究發(fā)現(xiàn)，不育系的花藥敗育主要是花粉囊的異常發(fā)育所導致。而ogu細胞質不育系材料則存在多種敗育方式，黃邦全等[14]通過種間雜交方式，將ogu蘿卜雄性不育胞質轉入紫菜薹中，經(jīng)過多代回交，獲得了發(fā)育正常的紫菜薹ogu胞質不育系，其花藥敗育發(fā)生在孢原細胞分化期；田福發(fā)[15]通過種間雜交獲得了Pol紅菜薹不育系、ogu紅菜薹不育系材料，并且進行細胞學切片觀察，發(fā)現(xiàn)ogu紅菜薹不育系花藥在四分體時期，絨氈層細胞發(fā)育異常，擠壓四分體，最終導致絨氈層和四分體同時解體，引起花藥敗育。我們在實踐過程中發(fā)現(xiàn)，芥菜雜交育種過程中，以雄性不育系材料為母本創(chuàng)制雜交種，部分不育系材料會表現(xiàn)出不同程度的結莢畸形現(xiàn)象。為了揭示芥菜雄性不育系結莢畸形性狀的形成機制，筆者對59份芥菜材料進行了結莢情況的鑒定以及細胞學研究，以期為芥菜胞質雄性不育系的品種改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為華中農業(yè)大學十字花科蔬菜遺傳育種課題組所收集來自全國各地的59份芥菜材料，經(jīng)多年提純復壯，如表1所示，包括29份芥菜保持系、30份芥菜細胞質雄性不育系、hauCMS原始材料(FanY-9A)及其保持系(FanY-9B)。

表1 供試材料Table 1 The list of experimental materials

續(xù)表1 ContinuedTable 1

1.2 芥菜胞質雄性不育系材料不育類型鑒定

利用CTAB法提取30份芥菜細胞質雄性不育基因組總DNA，獲得基因orf288和orf138的保守序列[16]，利用NCBI在線網(wǎng)頁設計引物,orf138正向引物:GAAACGGGAAGTGACAATAC,反向引物：GCATTATTTTCTCGGTCCAT；orf288正向引物CAATGGCTATTACCCCTGCT；反向引物： ATGCCGGGCATTTACCTGATGG。

1.3 芥菜材料的結莢情況調查

將59份材料于2017年9月同期播種育苗，之后統(tǒng)一水肥管理，雜交授粉完成后，待種莢成熟時，取典型角果，拍照記錄。

1.4 花蕾的半薄切片技術

材料盛花期，選取生長良好的花序參照文獻[17]制樣，于顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 芥菜不育系材料不育胞質類型鑒定

利用CTAB法提取30份芥菜細胞質雄性不育系材料，利用設計的2對引物進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果(圖1)顯示：以17W05、17W155、17W179為代表的23份材料屬于hau不育胞質類型，以17W501和17W173為代表的7份材料屬于ogu不育胞質類型。

圖1 芥菜雄性不育系材料不育類型鑒定Fig.1 Identification of CMS types of Brassica juncea

2.2 芥菜細胞質雄性不育系的結莢形態(tài)

對59份芥菜材料結莢形態(tài)的調查結果(圖2)顯示，7份芥菜ogu雄性不育系沒有畸形情況發(fā)生，莢果飽滿直立，形態(tài)具有一致性(圖2A)；芥菜hau雄性不育系材料在畸形方面表現(xiàn)較大的差異(圖2B)，其中，17W165、17W171、17W505、17W509和17W69表現(xiàn)出良好的結莢特性，果莢直立飽滿，其他材料則表現(xiàn)出不同程度的畸形；所有的芥菜保持系材料莢果均呈現(xiàn)飽滿、直立的狀態(tài)(圖2C)。

2.3 芥菜細胞質不育系花藥敗育及花器官發(fā)育的細胞學研究

1)芥菜oguCMS材料花藥敗育及花器官發(fā)育觀察。對芥菜ogu細胞質雄性不育系17W173及其對應保持系材料17W174進行半薄切片的細胞學觀察(圖3)，可以發(fā)現(xiàn)，從花器官的整體發(fā)育來看，不育系絨氈層出現(xiàn)降解，小孢子集結成團不能分散，保持系則較為正常。進一步觀察其花藥的敗育情況(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)，四分體時期，絨氈層細胞發(fā)育異常，細胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；單核靠邊期，絨氈層發(fā)生降解，藥室中央的小孢子聚集成團；雙核期，絨氈層已經(jīng)基本降解；三核期時，小孢子出現(xiàn)空泡化跡象，花藥敗育。

A.ogu細胞質雄性不育系；B. hau細胞質雄性不育系；C.保持系。 A.ogu CMS；B.hau CMS； C.Maintainer lines.

A.ogu細胞質雄性不育系； B.保持系。A.ogu CMS； B.Maintainer line.

A.四分體時期; B.單核期; C.單核靠邊期; D.雙核期; E.三核期; F.釋放花粉。A.Tetrad; B.Mononuclear; C.Mononuclear marginal; D.Dikaryotic; E.Trinuclear; F.Pollen release.

2)芥菜hau細胞質雄性不育系材料花器官發(fā)育及花藥敗育觀察。將果莢正常和果莢畸形的芥菜hau細胞質雄性不育系和保持系的花器官進行對比(圖5)，可以發(fā)現(xiàn)，2類材料的雄蕊敗育基本都由絨氈層的異常發(fā)育所引起；而結莢畸形材料，則直接形成了雌蕊-雄蕊嵌合體，嵌合體內生長著多于正常數(shù)量的胚珠。對結莢正常材料雄蕊進行敗育觀察(圖6)，可以看到，孢原細胞時期，產(chǎn)生心皮組織；花粉母細胞時期，絨氈層細胞異常膨大；在四分體時期，絨氈層發(fā)育異常，小孢子因養(yǎng)分不足隨之降解，花藥敗育。對結莢畸形材料的敗育過程進一步觀察(圖7)，可以看到，雌蕊-雄蕊嵌合體在花藥發(fā)育初期就開始形成，此時產(chǎn)生心皮組織而非正常的雄蕊原基，之后，心皮組織不斷生長發(fā)育，形態(tài)各異，整個過程幾乎觀察不到正常的花器官。

A.正常莢果不育系； B.畸形莢果不育系； C.保持系。A.Normal pods with hau CMS; B.Abnormal pods with hau CMS; C.Maintainer line.

A.孢原細胞時期; B.花粉母細胞時期; C.四分體時期; D-F.配子體發(fā)育時期。A.Sporogenous cell stage； B.Pollen mother cell stage； C.Tetrad stage； D-F.Gametophyte development stage.

3 討 論

在植物新品種的選育過程中，為避免長期使用單一不育胞質所帶來的潛在危害，需要引進不同類型的胞質并且對其快速鑒定，而分子標記則具有準確、省時、高效的特點[18]；本研究利用2對特異性引物(orf138和orf288)對芥菜CMS材料的不育胞質類型進行快速鑒定，發(fā)現(xiàn)orf138標記可鑒定芥菜oguCMS，而orf288標記則可將芥菜hauCMS鑒定出來，相較于觀察花器官的方式簡單且快速。從59份材料結莢性狀的田間統(tǒng)計結果中可以發(fā)現(xiàn)，所有的保持系和oguCMS結莢表現(xiàn)均非常優(yōu)異，無畸形情況發(fā)生，這與鄒瑞昌[19]的研究結果相似。芥菜hauCMS是華中農業(yè)大學1999年所發(fā)現(xiàn)的天然芥菜型油菜雄性不育系，具有不育度和不育株率100%的特點，長期以來，在十字花科植物雜種優(yōu)勢利用中得到了大量的應用[3]。施展等[20]對芥菜hauCMS 進行了綜合遺傳分類后，將芥菜hauCMS的不育細胞質轉育到大白菜中，創(chuàng)制了大白菜hauCMS種質資源6w-9605A。張艷等[21]以甘藍型油菜hauCMS為母本，菜心為父本，進行種間雜交和連續(xù)回交，創(chuàng)制了新型菜心hauCMS不育材料。隨著對芥菜hauCMS不育資源利用和研究的不斷深入，筆者課題組也發(fā)現(xiàn)其不足之處，將芥菜hauCMS不育源轉入芥菜后，部分材料存在果莢畸形的情況，實際種子生產(chǎn)中，果莢畸形會嚴重影響種子品質甚至制種產(chǎn)量，部分芥菜hauCMS材料結莢畸形可能會影響其后續(xù)在十字花科作物中的推廣利用，因此，對芥菜hauCMS不育胞質進行遺傳改良顯得尤為重要。

本研究進一步對芥菜hauCMS和oguCMS材料進行花藥敗育的細胞學觀察，可以發(fā)現(xiàn)，芥菜oguCMS和果莢正常的hauCMS材料，雄蕊的敗育均由絨氈層的異常發(fā)育所引起，其雌蕊進行正常的授粉受精后，果莢仍能正常發(fā)育,這與單奇?zhèn)サ萚22]的研究結果類似；果莢畸形的芥菜hauCMS材料在其花器官發(fā)育過程中，除絨氈層發(fā)育異常外，還伴隨著雌蕊-雄蕊嵌合體的發(fā)生，最終導致果莢畸形，可見，雌蕊-雄蕊嵌合體的形成是造成果莢畸形的原因，這與文獻[23]的研究結果不一致，極有可能是核質互作效應引起的[24]。本研究通過細胞學水平的研究證實結莢畸形由雌蕊-雄蕊嵌合體的生成引起，但更深層次的機制尚待探究，根據(jù)花發(fā)育模型假說，B基因組是調控雄蕊發(fā)育、引起雄蕊心皮化形成嵌合體的關鍵[25]，因此，后續(xù)可以從B基因組著手，對芥菜hauCMS進行深入研究，探究其敗育的分子機制。