影響“御金香”黃茶γ-氨基丁酸含量的因素研究

伊 冉，黃曉琴*，姜忠磊，楊小青，于 敏，劉亭亭

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.日照市嵐山區(qū)茶業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，山東 日照 276800；3.山東泰山茶溪谷農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東 泰安 271022

γ-氨基丁酸（GABA）是一種具保健作用的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、降低膽固醇、改善心率和睡眠、增強(qiáng)記憶力、抗焦慮、抗疲勞[1-8]等作用。自1987年日本開始研究γ-氨基丁酸茶葉以來(lái)，國(guó)內(nèi)的許多專家也相繼開展高γ-氨基丁酸茶葉的研究，大多是通過(guò)一些厭氧技 術(shù)[1、9]的處理來(lái)提高茶葉中γ-氨基丁酸的含量，而針對(duì)茶葉自身中γ-氨基丁酸含量及其影響因素的研究較少。

目前，對(duì)茶葉中γ-氨基丁酸（GABA）的研究多集中在白茶[10-11]、綠茶和紅茶[12]，近幾年也有對(duì)巖茶[13]等的研究，而對(duì)黃茶的研究還比較少見(jiàn)。黃茶被稱為最適合人體飲用的茶[14]，近年來(lái)隨著消費(fèi)水平的提高和消費(fèi)習(xí)慣的改變，黃茶也逐漸興起。黃茶由于其獨(dú)特的“悶黃”工序成就了“黃湯黃葉”的品質(zhì)特點(diǎn)，而在黃茶“悶黃”工序過(guò)程中，本身就存在一定的厭氧環(huán)境，本文擬對(duì)影響黃茶中γ-氨基丁酸含量的因素進(jìn)行研究，通過(guò)設(shè)置不同的工藝參數(shù)（如搖青時(shí)間、悶黃時(shí)間、悶黃溫度等）、采摘不同季節(jié)茶樹鮮葉加工成黃茶，比較不同條件下黃茶γ-氨基丁酸（GABA）含量的變化，為探究黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量及其影響因素提供參考，為開發(fā)高品質(zhì)且具一定保健功能的黃茶提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用鮮葉原料均為一芽二葉初展，品種為御金香，采自泰安市泰山茶溪谷農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司茶園。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑

十二水磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，茚三酮，氯化亞錫；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（sigma，純度≥99.9%），HPLC級(jí)乙腈，鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純，36.0% ～ 38.0%），正亮氨酸，三乙胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純，純度≥99.0%），異硫氰酸苯酯（sigma，純度≥99.9%），正己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純，純度≥97.0%），冰醋酸（生工，純度≥98%），無(wú)水乙酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純，純度≥99%）。

1.3 試驗(yàn)儀器

分析天平；島津UV－2450型分光光度計(jì)；RIGOL L3000高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器波長(zhǎng) 254 nm）。

1.4 試驗(yàn)處理與方法

本試驗(yàn)黃茶加工工藝流程為增加了搖青工序的新工藝：鮮葉→攤放→搖青→殺青→揉捻→悶黃→干燥。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定黃茶加工工藝為：搖青時(shí)間2 min；滾筒殺青溫度260℃；揉捻 20 min；40℃進(jìn)行悶黃 14 h；干燥溫度為初烘130℃，足干90℃，80℃提香2 h。各試驗(yàn)樣品工藝參數(shù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同的變量設(shè)置。

搖青時(shí)間處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，搖青時(shí)間分別設(shè)置為 1 min、2 min、3 min，其他加工參數(shù)同預(yù)試驗(yàn)工藝進(jìn)行處理。

悶黃時(shí)間處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，悶黃時(shí)間分別按梯度設(shè)置為 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，其他加工參數(shù)同預(yù)試驗(yàn)工藝處理。

悶黃溫度處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，悶黃溫度分別設(shè)置為35℃、40℃、45℃，其他加工參數(shù)同預(yù)試驗(yàn)工藝進(jìn)行處理。

不同季節(jié)黃茶加工試驗(yàn)：選用5月份、7月份、9月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，加工流程同預(yù)試驗(yàn)工藝進(jìn)行處理。

1.5 測(cè)定條件與方法

游離氨基酸測(cè)定方法參照GB/T 8314—2013。GABA測(cè)定方法：γ-氨基丁酸（GABA）測(cè)定采用HPLC法，色譜柱為賽分Amethyst C18-H（250 mm*4.6 mm, 5 μm）。

供試液的準(zhǔn)備：0.1 mol/L鹽酸：取900 uL濃鹽酸加入100 mL水，混勻；三乙胺乙腈溶液：取2.8 mL三乙胺加入17.2 mL乙腈，混勻；異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取125 uL異硫氰酸苯酯加入10 mL乙腈，混勻；正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取正亮氨酸2 mg，加入0.1mol/L鹽酸水溶液2 mL 溶解，混勻。

前處理：稱取約0.1 g樣品，加入1 mL水，研磨成漿后移入EP管中，過(guò)夜浸提，10000 g離心，取上清，過(guò)濾膜待衍生。

氨基酸的衍生：取上述待衍生的清液200 μL，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，分別置于2 mL EP管中；往每個(gè)離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL；依次向每個(gè)EP管中加入三乙胺乙腈溶液 100 μL（確保 PH > 7）和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻后25℃下放置1 h。然后加入正己烷400 μL至每個(gè)EP管中，搖晃后放置10 min。取下層溶液，0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

流動(dòng)相：流動(dòng)相A：稱取7.6 g無(wú)水乙酸鈉，加水925 mL,溶解后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.5，然后加入乙腈70 mL,混勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B：80%乙腈水溶液。

色譜條件：進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min； 柱溫40℃；走樣時(shí)間為45 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)整理與收集，并利用 IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 法測(cè)定 GABA 結(jié)果

在試驗(yàn)方法中所述的高效液相色譜條件下，對(duì) GABA 的單標(biāo)和待測(cè)樣品（春季“御金香”黃茶樣品）進(jìn)行測(cè)定，GABA標(biāo)樣和待測(cè)樣品經(jīng)衍生后獲得的圖譜如下圖1、圖2所示。由圖1 GABA標(biāo)品譜圖所知，出峰時(shí)間在12.26 min左右。在此色譜條件下，經(jīng)處理后的待測(cè)樣品在12.32 min左右時(shí)檢測(cè)到GABA（圖2）。

圖1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)品HPLC譜圖Figure 1 HPLC spectrum of experimental standard

圖2 春季御金香黃茶樣GABA HPLC譜圖Figure 2 HPLC spectrum of GABA in Yujinxiang yellow tea in spring

表1 流動(dòng)相梯度Table 1 Gradient of mobile phase

2.2 不同搖青時(shí)間對(duì)黃茶GABA含量的影響

為使加工成的黃茶更有特色，香氣顯花香，在傳統(tǒng)黃茶加工工藝的基礎(chǔ)上，增加了搖青工藝，并設(shè)置 1 min、2 min、3 min 的不同搖青時(shí)間處理。通過(guò)對(duì)加工成的干茶中游離氨基酸總量和γ-氨基丁酸（GABA）含量的測(cè)定，結(jié)果表明（表2）：游離氨基酸含量與搖青時(shí)間成反 比，在搖青1 min時(shí)含量最高，但與搖青2 min處理無(wú)顯著差異，二者與搖青3 min處理有顯著差異；γ-氨基丁酸（GABA）含量隨著搖青時(shí)間增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在搖青2 min時(shí)含量最高，各處理之間差異顯著。

表2 不同搖青時(shí)間黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 2 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of shaking

2.3 不同悶黃時(shí)間對(duì)黃茶GABA含量的影響

結(jié)果表明（表3）：游離氨基酸含量隨著悶黃時(shí)間加長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，8 h、10 h與12 h樣品間含量無(wú)顯著差異，在悶黃12 h左右時(shí)含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量隨著悶黃時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在6 h左右出現(xiàn)最大值，與其他組之間有著顯著差異，且其他各處理間均有顯著差異。從數(shù)據(jù)分析可得，在悶黃 4 ～ 6 h 這一范圍內(nèi)，γ-氨基丁酸（GABA）含量較其他時(shí)間段有著明顯的增加趨勢(shì)，而6 ～ 8 h時(shí)段相對(duì)其他時(shí)間段含量要高。

表3 不同悶黃時(shí)間黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 3 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of yellowing

2.4 不同悶黃溫度對(duì)黃茶GABA含量的影響

結(jié)果表明（表4），游離氨基酸的含量與悶黃溫度成反比，在35℃含量最高，各處理之間有顯著差異；而γ-氨基丁酸（GABA）呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，各處理之間存在顯著差異。

表4 不同悶黃溫度黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 4 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different temperature of yellowing

2.5 不同季節(jié)鮮葉對(duì)黃茶GABA含量的影響

結(jié)果表明（表5），游離氨基酸總量隨著季節(jié)變化逐漸降低，各季節(jié)之間存在明顯差異，春季含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量在三個(gè)季節(jié)樣本之間均有顯著差異，且春季含量最高，夏季最低，含量隨季節(jié)變化較為明顯。

表5 不同季節(jié)黃茶游離氨基酸與GABA含量Table 5 Content of free amino acids and GABA in yellow tea in different seasons

3 討論

研究表明，搖青能夠改變鮮葉內(nèi)酶的活性，增加水浸出物含量，并產(chǎn)生更多的芳香物質(zhì)[15]。因此，近年來(lái)，在許多茶的加工工藝中都引入了搖青工藝，如花香型綠茶、黃茶、紅茶、白茶等的生產(chǎn)[16-19]。通過(guò)本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，搖青在增加茶葉香氣物質(zhì)的同時(shí)，還能夠提高黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量。劉冠卉[11]等人在研究桑葉紅茶時(shí)曾提出，搖青工藝增大葉片之間的摩擦振動(dòng)，能夠給葉片造成輕微的機(jī)械損傷，從而激活谷氨酸脫羧酶（GAD）活性。GAD是催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸的催化酶，是一種逆境酶,植物在低溫、厭氧及機(jī)械損傷等逆境條件下可激活酶促反應(yīng)[20]，而搖青處理造成的機(jī)械損傷打破了底物與酶之間的間隔使得接觸增大、加速葉片的無(wú)氧呼吸和內(nèi)部環(huán)境的酸化，同時(shí)，搖青造成的振蕩促進(jìn)了葉片內(nèi)水分、物質(zhì)的運(yùn)輸與重新分布，這些動(dòng)態(tài)反應(yīng)均有利于GAD的酶促反應(yīng)，進(jìn)而使得葉片中GABA含量增加[21]。但在搖青時(shí)也需注意，雖然隨著搖青時(shí)間的增加，GABA含量會(huì)有上升過(guò)程，但超過(guò)閾值會(huì)產(chǎn)生相反效果，且因原料嫩度較低，易造成葉底紅邊，同時(shí)也會(huì)對(duì)滋味與香氣產(chǎn)生不良影響，造成茶葉品質(zhì)的降低，所以搖青時(shí)間也不可一味的增加，要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。

本試驗(yàn)選用濕悶工藝進(jìn)行悶黃，文帥[22]等人在對(duì)悶黃工藝進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)濕悶有利于游離氨基酸含量的增加。范方媛[23-24]等人在研究悶黃工藝因子對(duì)黃茶品質(zhì)滋味影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸（GABA）含量會(huì)隨著悶黃溫度的提高而增加，本文的試驗(yàn)結(jié)果與其相一致。一些研究表明，在悶黃溫度變化上，隨著悶黃時(shí)間的增加，前期大分子蛋白質(zhì)物質(zhì)在濕熱和酶促作用下水解[25]，導(dǎo)致氨基酸含量的增加，而后期氨基酸和可溶性糖等物質(zhì)結(jié)合發(fā)生孟拉德反應(yīng)[26-28]，含量會(huì)相應(yīng)的減少，本文試驗(yàn)結(jié)果也與此相一致。且有研究顯示，雖然多酚氧化酶等酶類在殺青之后會(huì)大幅下降, 但隨著悶黃過(guò)程的深入,多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶和纖維素酶的活性會(huì)顯著增加，增加至一定程度, 隨后逐步減少[28]，相應(yīng)地在GABA合成機(jī)制中起到重要作用的谷氨酸脫羧酶（GAD）可能也具有同種變化規(guī)律，從而造成其含量在增加到某一時(shí)刻后開始減少，從而使得其GABA含量也呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。

與其他茶樹品種相比，“御金香”呈現(xiàn)出明顯的品種特點(diǎn)，“御金香”是典型的光照敏感型黃色系白化茶品種[29-30]，以氨基酸含量高、酚氨比低為優(yōu)勢(shì)，成為近些年來(lái)綠茶鮮葉原料的熱門選擇，而將其作為黃茶加工的原料還少見(jiàn)報(bào)道。在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采摘自春季的“御金香”鮮葉所加工成的黃茶，氨基酸總量與γ-氨基丁酸（GABA）的含量與其他季節(jié)差異顯著，達(dá)到所有樣本的最大值，品種優(yōu)勢(shì)極為明顯，加上其特殊的鮮葉色澤特點(diǎn)，不失為黃茶原料的新選擇，為高品質(zhì)黃茶的加工提供了新思路。Zhao[31]等人對(duì)常規(guī)白茶、綠茶、烏龍茶和黑茶中的γ-氨基丁酸（GABA）含量做了測(cè)定，其中白茶含量最高，為 45.7 mg/100 g[32]，而本研究中利用春季御金香茶樹品種加工成的黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量為121.24 mg/100 g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)工藝中加工成的各類茶，可見(jiàn)利用高氨基酸含量的茶樹品種加工γ-氨基丁酸茶具有一定優(yōu)勢(shì)。由于本試驗(yàn)其他工序處理選用的鮮葉均采自夏季，氨基酸含量明顯下降，這是由于山東地區(qū)夏季日照強(qiáng)，茶園通常都會(huì)做遮蔭處理，而“御金香”茶樹的另一特征是遮蔭處理后氨基酸含量明顯下降，從而造成其結(jié)果的出現(xiàn)。

本次研究發(fā)現(xiàn)，鮮葉采摘季節(jié)與加工工藝均會(huì)對(duì)成品黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量產(chǎn)生不同程度的影響。引入搖青工藝、選擇適當(dāng)?shù)膼烖S時(shí)間和悶黃溫度都有利于黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量的增加。在本研究的基礎(chǔ)上，如何進(jìn)行高γ-氨基丁酸（GABA）含量黃茶的生產(chǎn)是值得進(jìn)一步研究的內(nèi)容，但本研究的試驗(yàn)結(jié)果也為高γ-氨基丁酸（GABA）含量黃茶的生產(chǎn)提供了一定理論基礎(chǔ)。