郝思達(dá)，馬健雄，顧 海，王業(yè)強(qiáng)，秦 勇

(浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院/杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院：1.泌尿外科 ；2.生殖科，杭州 31000)

前列腺癌是男性常見生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多見于中老年人群，致死率約占男性惡性腫瘤死亡總數(shù)的1.26%，且隨著年齡增長(zhǎng)而不斷升高[1]。外科手術(shù)是當(dāng)前治療前列腺癌最主要也是最有效的方法，但因其浸潤(rùn)性較強(qiáng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高，臨床預(yù)后仍不理想[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA，且無編碼蛋白質(zhì)功能，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要調(diào)節(jié)作用[3]。有研究顯示，LncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)可結(jié)合部分甲基化蛋白而參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，且被證實(shí)在結(jié)直腸癌[4]、肝細(xì)胞癌[5]等惡性腫瘤中明顯高表達(dá)，且可能導(dǎo)致部分抑癌基因如磷酸酶基因(PTEN)等丟失而參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[6]，但其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及確切分子機(jī)制仍缺乏充分研究。本研究檢測(cè)了前列腺癌患者癌組織中LncRNA TUG1表達(dá)水平，并探討其與患者臨床病理特征、臨床預(yù)后的關(guān)系，旨在為前列腺癌的早期診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月在本院住院治療的前列腺癌患者126例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理活檢及術(shù)后病理檢查確診為前列腺癌；(2)具有完整的臨床病理資料、隨訪資料；(3)獲得腫瘤組織及癌旁正常組織(與腫瘤邊緣距離大于5 cm)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性前列腺癌患者；(2)合并其他惡性腫瘤、合并自身免疫性疾病者；(3)術(shù)前接受新輔助化療、放療或其他抗腫瘤治療者；(4)組織反復(fù)凍存或污染者。入組患者和(或)其家屬均知情同意且簽署書面知情同意書，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核且批準(zhǔn)通過。納入患者年齡45～78歲，平均(66.21±6.43)歲；術(shù)前血清前列腺特異抗原(PSA)0.19～100 μg/L，平均(12.64±3.03)μg/L；腫瘤直徑：<3.0 cm者71例，≥3.0 cm者55例；美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期75例；腫瘤T分期：T1～2期者47例，T3～4期者79例；分化程度：中/高分化62例，低分化或未分化64例；術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。

1.2 方法

1.2.1主要儀器與試劑

(1)儀器：DS-11型微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)DeNovix公司；凝膠電泳分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Lonrmat公司；7500型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。(2)試劑：cDNA 合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-miga公司；2×Taq PCR MasterMix 試劑盒及2×SYBR Green Mix(With ROX)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Bio-miga公司；10%胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；亂序?qū)φ招「蓴_RNA(Si-NC)和TUG1小干擾RNA(si-TUG1)均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)組織LncRNA TUG1、PTEN表達(dá)

組織標(biāo)本采用10%甲醛液固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm。組織加入液氮并充分研磨，采用Trizol法分離、提取RNA。采用無RNase的DNaseⅠ去基因組進(jìn)行處理，37 ℃ 30 min，65 ℃滅活10 min，反應(yīng)體系包括3 020 μL DNaseⅠ、60 μL RNA、100 μL無RNase水、20 μL 10×buffer。取上述RNA樣本，稀釋60倍后以微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，分別測(cè)定波長(zhǎng)260 nm、280 nm處OD值，OD260/OD280>1.8判定為RNA純凈。取模板RNA及引物混合物加入PCR管中，加入無RNase水定容至12.0 μL，70 ℃處理10 min后立即置于冰面上放置2 min合成cDNA，反應(yīng)體系包括：4.0 μL 單蒸水、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、10 μL SYBR?Premix ExTaq TM(TliRNaseH Plus)(2×)及5.0 μL cDNA，啟動(dòng)PCR反應(yīng)測(cè)定組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平，內(nèi)參分別為GAPDH、β-actin。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次；72 ℃終延伸5 min。采用2-△△CT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，引物序列設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列設(shè)計(jì)

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取正常組織細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞PC-3(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)分別接種到RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2環(huán)境(37 ℃恒溫)培養(yǎng)細(xì)胞。按照1∶5傳代，培養(yǎng)5～7 d經(jīng)顯微鏡觀察顯示生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%左右，選取穩(wěn)定生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞采用含10% FBS的RPMI-164培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)。消化后以3×105個(gè)/孔在6孔細(xì)胞板中種植，設(shè)計(jì)空白組、陰性轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組，分別加入無血清培養(yǎng)基、50 nmol/L Si-NC、50 nmol/L si-TUG1，按照Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。溫育24 h后，提取PTEN總RNA進(jìn)行RT-PCR法檢測(cè)，操作同1.2.2。

1.2.4治療與隨訪

所有患者均根據(jù)《前列腺癌診斷治療指南》(2014年)[7]推薦的前列腺癌治療方案進(jìn)行術(shù)后對(duì)癥治療，包括化療、放療及不良反應(yīng)防控等。隨訪統(tǒng)計(jì)術(shù)后3年復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移率及癌因性病死率，隨訪截止日期為2020年4月1日或死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 癌組織及癌旁正常組織中LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

前列腺組織中LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，約為正常組織的3.54倍；而PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.001)，見表2。相關(guān)性分析顯示，癌灶組織中LncRNA TUG1與PTEN mRNA表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.689，P<0.001)。

表2 兩組標(biāo)本組織中LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 3組PC-3細(xì)胞LncRNA TUG1和PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)染組PC-3細(xì)胞中的LncRNA TUG1的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于空白組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于空白組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，約為轉(zhuǎn)染前的1.29倍；空白組和陰性轉(zhuǎn)染組兩指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組PC-3細(xì)胞LncRNA TUG1和PTEN mRNA表達(dá)水平比較

2.3 LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

不同年齡、腫瘤大小患者的癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但不同T分期、AJCC分期、分化程度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 不同臨床轉(zhuǎn)歸患者癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

126例患者術(shù)后隨訪1～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為36.5個(gè)月。1、3年存活率分別為80.95%(102/126)、69.05%(87/126)，復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移率為40.48%(51/126)。復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的癌組織中LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于無復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者，且在死亡患者中LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高生存患者(P<0.001)；復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的癌組織中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于無復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者，且在死亡患者中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于生存患者(P<0.001)，見表5。

表5 不同臨床轉(zhuǎn)歸患者癌組織中LncRNA TUG1、PTEN mRNA表達(dá)水平比較

2.5 前列腺癌患者生存影響因素的Cox回歸分析

Cox回歸分析顯示，AJCC分期、T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA TUG1表達(dá)水平均是影響前列腺癌患者生存狀況的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，PTEN mRNA表達(dá)水平是其保護(hù)性因素(P<0.05)，見表6。

表6 前列腺癌患者生存影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

LncRNA是非編碼RNA的重要構(gòu)成，廣泛分布于人體各個(gè)臟器及細(xì)胞中，參與多種復(fù)雜基因表達(dá)的調(diào)控。目前，已有諸多研究證實(shí)，LncRNA參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程，可能作為腫瘤進(jìn)展過程中的抑癌或致癌基因而存在[8]。有研究顯示，LncRNA能夠內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)miRNA而參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控，從而影響EMT進(jìn)程，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程[9]。LncRNA中TUG1是廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞中的基因，最早發(fā)現(xiàn)于發(fā)育中視網(wǎng)膜及神經(jīng)組織中，近年有不少研究發(fā)現(xiàn)LncRNA TUG1參與了膀胱癌、腎癌等泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[10-11]。然而，有關(guān)LncRNA TUG1表達(dá)在前列腺癌中的作用、可能機(jī)制及與臨床預(yù)后的關(guān)系方面尚缺乏充分研究報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平相較于癌旁正常組織明顯升高，約為正常組織的3.54倍，提示LncRNA TUG1過表達(dá)可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步檢測(cè)抑癌基因PTEN的表達(dá)顯示，前列腺癌組織中PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于正常組織(P<0.05)，與陸巍等[12]報(bào)道相符，提示PTEN功能缺失可能參與前列腺癌的發(fā)病過程。鑒于LncRNA TUG1與PTEN在前列腺癌中分別發(fā)揮促癌與抑癌作用，推測(cè)LncRNA TUG1過表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)抑癌基因PTEN表達(dá)而參與前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展。為此，本研究通過在PC-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-TUG1抑制LncRNA TUG1表達(dá)后顯示，轉(zhuǎn)染組的PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，表達(dá)水平約為轉(zhuǎn)染前的1.29倍，提示在前列腺癌中LncRNA TUG1可能抑制PTEN的表達(dá)，從而影響其抑癌作用，而PTEN的丟失進(jìn)一步誘發(fā)前列腺癌或引起癌癥進(jìn)展。DU等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)，IncRNA TUG1可調(diào)節(jié)前列腺癌中PTEN表達(dá)而參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，這與本研究結(jié)論相符。進(jìn)一步Pearson相關(guān)性分析顯示，本組前列腺癌組織中LncRNA TUG1與PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.689,P<0.001)，表明前列腺癌組織中LncRNA TUG1過表達(dá)增強(qiáng)了其對(duì)PTEN表達(dá)的抑制作用，導(dǎo)致PTEN功能丟失而引起前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展。但前列腺癌組中LncRNA TUG1過表達(dá)是否與PTEN丟失直接相關(guān)或存在濃度依賴關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

本研究進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA TUG1表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系顯示，T3～4分期、Ⅲ～Ⅳ期患者具有更高的LncRNA TUG1表達(dá)，且在未、低分化患者中其相對(duì)表達(dá)水平高于中、高分化患者，T3～4期者的LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于T1～2期患者，在伴發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中具有更高的LncRNA TUG1表達(dá)。提示LncRNA TUG1表達(dá)可能與前列腺癌患者的腫瘤侵襲性、惡性程度有關(guān)，LncRNA TUG1過表達(dá)可能增強(qiáng)其遷移、侵襲行為，而腫瘤遷移、侵襲能力的增強(qiáng)可能增加遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致遠(yuǎn)期預(yù)后不良，文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道也驗(yàn)證了本研究結(jié)論。同時(shí)，PTEN表達(dá)顯示出了與LncRNA TUG1相反的變化特征，PTEN低表達(dá)或缺失與腫瘤侵襲性、惡性程度有關(guān)。推測(cè)LncRNA TUG1高表達(dá)及PTEN丟失可能與前列腺癌患者的不良生物學(xué)行為密切相關(guān)，二者相互影響均可能增加遠(yuǎn)期不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。隨訪結(jié)果顯示，前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移率為40.48%，3年生存率為69.05%，高于楊勇等[16]報(bào)道的3年生存率29.8%，可能與樣本差異及病情程度不一等有關(guān)。比較存活與死亡患者的LncRNA TUG1、PTEN mRNA表達(dá)水平顯示，死亡患者的LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)水平明顯高于存活者，PTEN mRNA明顯低于存活患者(P<0.001)，提示LncRNA TUG1高表達(dá)及PTEN丟失與前列腺癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后存在一定的關(guān)系，這與董云益等[17]研究結(jié)論相符。進(jìn)一步Cox分析顯示，AJCC分期(Ⅲ～Ⅳ期)、T3～4期、分化程度(未、低分化)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA TUG1、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)水平均是影響前列腺癌患者生存狀況的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。考慮為L(zhǎng)ncRNA TUG1過表達(dá)可能影響抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖遷移，加速癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增加其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，故可能增加不良預(yù)后發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究通過檢測(cè)前列腺癌癌灶組織中LncRNA TUG1及抑癌基因PTEN表達(dá)并分析其與前列腺癌臨床病理特征、預(yù)后間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TUG1過表達(dá)參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，且可能通過抑制PTEN表達(dá)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，且過表達(dá)TUG1可能促進(jìn)前列腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響臨床預(yù)后。因此，TUG1有望作為前列腺癌的潛在分子標(biāo)志物，對(duì)前列腺癌的診治及預(yù)后預(yù)測(cè)均具有參考意義。但本研究樣本較小，且缺乏對(duì)其可能機(jī)制的研究，還需進(jìn)一步深入研究加以完善。