孫 樂，劉瑞鑫，許春榮，許 鵬，石德順，李湘萍

1. 廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室， 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站， 南寧 530001

種公牛精液品質(zhì)的好壞會直接影響到精液的生產(chǎn)、 種公牛的繁殖性能以及畜禽品改站的經(jīng)濟效益． 影響精液品質(zhì)的因素有很多， 包括溫度、 品種、 營養(yǎng)條件、 飼養(yǎng)管理等． 有研究報道精液生產(chǎn)能力主要取決于環(huán)境， 其中最主要的是飼養(yǎng)管理條件[1-3]． 目前， 有關(guān)營養(yǎng)條件的研究集中于飼養(yǎng)后生理和生化指標(biāo)的檢測， 通過這些指標(biāo)來反映營養(yǎng)條件改變給動物機體帶來的影響． 有研究在飼料中添加Penergetic-T后分析其對瘤胃液和血液生化指標(biāo)的影響， 以反映飼料添加劑對延邊黃牛育肥的促進(jìn)作用[4]． 改善日糧比例， 如在飼料中添加益生菌可降低肉雞料肉比[5]， 提高斷奶仔豬生長性能[6]， 促進(jìn)0～8月齡犢牛日增質(zhì)量[7]， 提高和牛種公牛的精液品質(zhì)[8]， 此外， 有學(xué)者在研究不同日糧對冬季摩拉、 尼里/拉菲種公牛凍精的影響時， 提出青綠飼料對提高種公牛的精液品質(zhì)有重要作用[9-10]．

代謝組學(xué)可以對某一生物體組份或細(xì)胞在特定生理時期或條件下所有代謝產(chǎn)物同時進(jìn)行定性和定量分析， 以尋找目標(biāo)差異代謝物、 進(jìn)而研究機體代謝特征． 代謝組研究在動物健康評估、 疾病診斷、 生物產(chǎn)品質(zhì)量方面發(fā)揮了重大作用[11-13]． Beauclercq等[14]通過代謝組學(xué)找出了15種可能影響雞肉品質(zhì)的標(biāo)志代謝物． 朱坤等[15]指出飼喂發(fā)酵飼料影響了育肥豬血清中L-焦谷氨酸、 黃嘌呤、 丙烯酰胺等代謝物的含量， 揭示了飼喂不同飼料會造成育肥豬血清代謝水平的改變． 趙文華等[16]通過代謝組學(xué)研究揭示了γ-氨基丁酸、 組氨酸和甜菜堿對茶花雞胸肌和腿肌的特殊風(fēng)味具有決定作用． Li等[17]利用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同泌乳期的牦牛乳腺組織代謝變化， 發(fā)現(xiàn)受影響的代謝途徑是甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸； 三羧酸循環(huán)(TCA)等代謝途徑， 為牛乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的代謝研究提供了重要的支撐． 目前有關(guān)精漿代謝組學(xué)分析較少， 羅芳等[18]在篩選表征種公牛精液活力生物標(biāo)志物的實驗中， 采集24頭西門塔爾種公牛的精液進(jìn)行超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測， 發(fā)現(xiàn)精漿中的鞘氨醇、 環(huán)己胺、 戊酸等6個代謝物可作為表征種公牛精液活力的潛在生物標(biāo)志物． Ugur等[19]使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對不同冷凍性荷斯坦種公牛精漿中的氨基酸含量進(jìn)行了定量分析， 發(fā)現(xiàn)牛精漿中谷氨酸、 丙氨酸和甘氨酸是主要代謝產(chǎn)物， 同時發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸可以作為一種可冷凍的生物標(biāo)志物．

意大利地中海奶水牛是產(chǎn)奶性能最好的河流型水牛品種， 同時也是目前世界上針對乳用性能選育程度較高的一個品種． 隨著奶水牛市場需求的不斷擴大， 為提高本地水牛的產(chǎn)奶量和奶質(zhì)量， 廣西壯族自治區(qū)引進(jìn)了意大利地中海種公牛， 以期對廣西本地水牛進(jìn)行品種改良． 基于營養(yǎng)條件可能會影響種公牛精液品質(zhì)， 同時有關(guān)水牛精漿代謝成分研究尚為空白的前提， 本研究主要分析不同飼養(yǎng)條件下種公牛精液質(zhì)量、 生化指標(biāo)及精漿代謝物， 并篩選出不同營養(yǎng)條件下的差異代謝物， 以期為進(jìn)一步選擇優(yōu)質(zhì)飼料飼喂種公牛， 提高精液產(chǎn)量和質(zhì)量提供一定的科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗用意大利地中海種公牛， 飼養(yǎng)在廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站種公牛站． 試驗動物按照廣西畜禽品種改良站種公牛飼養(yǎng)與管理的相關(guān)條例進(jìn)行飼養(yǎng)． 根據(jù)采精和凍精生產(chǎn)記錄， 選擇采精正常、 體況良好的種公牛為試驗牛． 分為飼喂青綠飼料GF組、 青貯飼料S組． 采集不同飼養(yǎng)條件下的精液樣本， 取回的精液進(jìn)行離心， 分離后的精子和精漿進(jìn)行分裝， 冷凍于液氮中， 隨后放入-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 主要試劑

伊紅染液、 磷酸鹽緩沖液(PBS)、 生育酚乙酸酯、 甲醇、 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒牛甘油三酯(TG)、 牛睪酮(T)、 牛堿性磷酸酶(ALP)、 牛酸性磷酸酶(ACP)、 牛果糖(fructose)、 牛α葡萄糖苷酶(α-Glu)、 牛乳酸脫氫同工酶(LDH)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司； 鉀(K)測定試劑盒、 鎂(Mg)測定試劑盒、 鈉(Na)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所．

1.3 主要儀器、 設(shè)備

精子分析儀WLJY-9000型(富士平工業(yè)株式會社)， 0.22 μm離心過濾柱， C18色譜柱， 液相色譜儀器UltiMate3000(Dionex)， 包括液相泵(HPG-3400 SD)、 柱溫箱(TCC-3000 SD)和自動進(jìn)樣器(WPS-3000SL)， 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(Thermo Scientific)．

1.4 實驗方法

1.4.1 精液品質(zhì)常規(guī)檢測

精子活力檢測： 在顯微鏡下用精液質(zhì)量檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析， 每個樣本重復(fù)計數(shù)3次并記錄結(jié)果． 精子畸形率檢測： 采用伊紅染色法進(jìn)行精子畸形觀察． 采精量檢測： 利用電子分析天平記錄射精量． 精液pH值檢測： 利用pH試紙與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對比得出pH值． 計算機輔助精子分析儀檢測： 取2 μL精液， 8 μL PBS洗液， 混勻后上機檢測， 利用精子分析儀對種公牛精子進(jìn)行運動參數(shù)分析．

1.4.2 意大利地中海種公牛精漿生化指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書方法測定意大利地中海種公牛精漿的生化指標(biāo)．

1.4.3 意大利地中海種公牛精漿非靶向代謝組學(xué)檢測

(1) 精漿代謝物的提取

取50 μL分離得到的精漿樣本， 加入148 μL甲醇， 2 μL內(nèi)標(biāo)(生育酚乙酸酯)至1.5 mL 離心過濾器， 渦旋30 s， 沉淀蛋白， 4 ℃離心12 000 r/min， 15 min， 取出過濾柱．

(2) QC樣品制備

質(zhì)量控制樣本(QC)為精漿提取物的混合液， 每6個檢測的樣本插入一個QC樣本， 用來校正儀器的穩(wěn)定性．

(3) 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測

液相色譜條件如下： 色譜柱柱溫30 ℃， 自動進(jìn)樣器4 ℃， 正離子(ESI+)模式下流動相A為0.1%的甲酸水溶液， 流動相B為甲醇， 進(jìn)樣體積為1 μL， 負(fù)離子模式其他條件不變， 只改變模式為負(fù)離子(ESI-)． 樣品梯度洗脫程序參考實驗平臺方法． 質(zhì)譜條件： 離子源為Q-Exactive質(zhì)譜儀， 加熱型電噴霧， 溫度300 ℃， 正、 負(fù)離子模式下噴霧電壓均為3.0 kV， 傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃， 鞘氣和輔助氣流壓力分別為30 psi(206.84 kPa)， 10 psi(68.95 kPa)； 質(zhì)譜掃描范圍為80～1 200 m/z(質(zhì)子與電荷數(shù)的比值)， 掃描模式： Full MS/dd-MS2．

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

對數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示， 利用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行圖片整理并進(jìn)行差異顯著性分析， **表示p<0.05差異顯著， ***表示p<0.01差異極顯著．

2 結(jié)果與分析

2.1 種公牛精液常規(guī)檢測

與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精子活力和采精量顯著升高， 畸形率顯著下降(p<0.05)， 精液pH值和密度沒有顯著差異(p>0.05)． 青綠飼料組精子直線速度(VSL)、 曲線速度(VCL)、 平均速度(VAP)、 鞭打頻率(BCF)均顯著升高(p<0.05)， 精子直進(jìn)性(LIN)和直線性(STR)極顯著升高(p<0.01)， 頭部振幅(ALH)沒有顯著差異(p>0.05)(表1)．

表1 種公牛精液質(zhì)量參數(shù)

2.2 種公牛精漿生化指標(biāo)分析

與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精漿中鎂(Mg2+)、 果糖(Fructose)含量均顯著升高(p<0.05)， 鉀(K+)、 睪酮(T)、 α-葡萄糖苷酶(α-Glu)、 酸性磷酸酶(ACP)、 堿性磷酸酶(ALP)、 乳酸脫氫同工酶(LDH)含量極顯著升高(p<0.01)， 鈉(Na+)含量差異不顯著(圖1)．

圖1 精漿生化指標(biāo)在兩組中的含量

2.3 精漿非靶向代謝組學(xué)分析

在正離子模式和負(fù)離子模式下， 本次實驗共檢測到2 434個峰值． 代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)采用Compound discover 3.0軟件進(jìn)行峰對齊、 保留時間校正以及提取代謝物峰面積計算， 同時去除相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)大于30%的代謝物． 通過代謝物數(shù)據(jù)庫mzCloud，HMBD和KEGG匹配檢索， 一共匹配出677個不同的代謝物．

2.3.1 精漿代謝物分析

從主成分分析(PCA)得分圖可知， 本次實驗QC樣品分布良好， 說明所用儀器重復(fù)性及穩(wěn)定性均好， 同時不同組間有明顯的分布趨勢(圖2)．

t[1]是針對預(yù)測主成分的回歸系數(shù)權(quán)重大小， t[2]是針對正交主成分的回歸系數(shù)權(quán)重大?。?/p>

對代謝物進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以區(qū)分組， 在正、 負(fù)離子模式下的模型示意圖說明模型穩(wěn)定可靠性． 對所建立的OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗， 也表明本文所建立的模型有效并且未發(fā)生過擬合(圖3)．

t[1]是第一預(yù)測主成分， to[1]是第一正交主成分．

2.3.2 精漿差異代謝物的篩選及代謝途徑分析

根據(jù)p<0.05，VIP>1且差異倍數(shù)FC值大于1.3或者差異倍數(shù)FC值小于0.7， 共篩選出10個差異代謝物： 左旋乙酰肉堿、 甘油磷酸膽堿、 3-丁酸巰基己酯、 3-氧戊二酸、 甜菜堿、 5-甲基胞苷、 2， 5-呋喃二甲酸、 檸檬酸、 磷脂酰膽堿和檸康酸． 對差異代謝物進(jìn)行代謝途徑分析， 發(fā)現(xiàn)差異代謝物參與9條代謝途徑： 甘油磷脂代謝， 亞油酸代謝， α-亞麻酸代謝， 醚脂質(zhì)代謝， 三羧酸循環(huán)， 丙氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸代謝， 乙醛酸和二羧酸酯代謝， 甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸代謝， 花生四烯酸代謝．

3 討論與結(jié)論

本文的目的是了解在不同飼養(yǎng)條件下種公牛精液質(zhì)量和精漿代謝的差異． 研究發(fā)現(xiàn)， 與青貯飼料組相比， 青綠飼料組種公牛精子畸形率低、 活力高， 精液品質(zhì)好． 同時， 本實驗對青綠飼料組和青貯飼料組種公牛的精漿樣本進(jìn)行了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析， 通過差異分析和代謝途徑分析， 篩選出了10種差異代謝物， 富集到9個代謝途徑．

精漿中包含糖類、 脂類、 蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)． 在不同生理狀態(tài)下， 能量、 蛋白質(zhì)、 礦物質(zhì)和維生素等對公畜生殖能力的維持起到重要作用． 精漿內(nèi)的微量元素與精子功能有關(guān)， 鈉、 鈣、 鎂和鉀水平與精子活動率呈正相關(guān)． 在本研究中， 與青貯飼料組相比， 青綠飼料組精漿中Mg離子顯著升高， K離子變化極顯著升高， Na離子差異不顯著， 這一點與之前的研究一致[20-21]． 睪酮影響精子形成并促進(jìn)附睪中的精子成熟[22]． 種公牛精漿中睪酮含量極顯著升高， 也說明睪酮含量對于精子成熟十分重要． 精漿中的糖類是精子能量代謝的重要底物， 尤其果糖是精子能量代謝的主要來源， 其代謝能為精子運動供應(yīng)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)， 同時經(jīng)糖酵解和線粒體呼吸作用產(chǎn)生的ATP為精子的運動提供能量[23]． 果糖水平升高， 意味著供能物質(zhì)充足， 有利于代謝． 哺乳動物精液中中性α-葡萄糖苷酶幾乎完全來源于附睪， 與獲得受精能力相關(guān)， 同時作為附睪精子成熟的調(diào)節(jié)劑[24-25]． 中性α-葡萄糖苷酶活性與常規(guī)精子參數(shù)呈正相關(guān)， 在本研究測得的指標(biāo)中睪酮、 果糖和α-葡萄糖苷酶在青綠飼料組極顯著升高， 可以發(fā)現(xiàn)不同飼料對精子的成熟和能量代謝產(chǎn)生了一定的影響．

精漿中的肉堿主要由附睪分泌， 精漿中肉堿分為游離肉堿和乙酰肉堿兩種． 左旋肉堿為精子的運動提供能量， 并且可以幫助細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)和支持細(xì)胞的新陳代謝[26]． 左旋肉堿和乙酰左旋肉堿對弱精子癥具有輔助治療效果， 能提高患者的精液質(zhì)量[27]． 還有研究發(fā)現(xiàn)， 乙酰肉堿含量與總運動形態(tài)正常的精子數(shù)呈正相關(guān)， 口服左旋肉堿的種馬可改善精子的動力學(xué)和形態(tài)學(xué)特征[28]， 可見左旋乙酰肉堿對保持精子的正常形態(tài)和活力有一定的影響． 在實驗中的質(zhì)譜分析可以發(fā)現(xiàn)， 左旋乙酰肉堿在青綠飼料組中含量高， 同時青綠飼料組精子活力也高， 這表明左旋乙酰肉堿與精子的活力有一定的關(guān)系．

甘油磷酸膽堿(GPC)是存在于雄性生殖系統(tǒng)中的一種主要成分， 絕大部分由附睪上皮合成與分泌， 有研究指出精漿GPC量約占人體內(nèi)GPC總量的70%以上， 是檢驗雄性生殖能力的指標(biāo)之一， 并且GPC參與精子運動的調(diào)節(jié)及吸呼活動， 精子膜GPC含量與附睪功能具有密切的聯(lián)系[29-30]． 磷脂酰膽堿屬于卵磷脂的一種， 卵磷脂經(jīng)常用于冷凍精液保存． 甜菜堿是一種生物堿， 與葉酸一起參與碳代謝， 它可以通過清除超氧化物來提高睪丸組織的抗氧化能力， 并且可以通過甜菜堿循環(huán)產(chǎn)生S-腺苷甲硫氨酸來提高精子運動能力和精子功能． 于炎巧[31]研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿能夠提高精子數(shù)量， 改善精子活力， 且不會改變精子的畸形率． 此外， 其他代謝物如5-甲基胞苷常存在于細(xì)胞的RNA中， 是一種稀有核苷． 2， 5-呋喃二甲酸可進(jìn)行糖醛降解， 產(chǎn)生能量和生成α-酮戊二酸， 為TCA循環(huán)增加底物． 3-丁酸巰基己酯是脂肪酸酯類有機化合物， 它是脂肪酸的羧酸酯衍生物． 在實驗中的質(zhì)譜分析可以發(fā)現(xiàn)， 上述的甘油磷酸膽堿、 磷脂酰膽堿、 甜菜堿、 5-甲基胞苷、 2，5-呋喃二甲酸和3-丁酸巰基己酯， 在青綠飼料組中的含量高．

檸檬酸是三羧酸循環(huán)過程中的重要物質(zhì)， 三羧酸循環(huán)是基本的代謝途徑， 為相關(guān)代謝提供能量和前體， 保證各種生物功能正常進(jìn)行， 同時在精子激活和運動期間產(chǎn)生能量[32-33]， 如精子在附睪內(nèi)的成熟過程中主要是通過代謝來提供能量， 精漿內(nèi)的檸檬酸含量可以在一定程度上反映精子的活力． 檸檬酸是精漿中重要的生化成分， 不僅能夠恢復(fù)前列腺的狀態(tài)， 在精子活力中還起著至關(guān)重要的作用[34]． 精漿中的檸檬酸主要來自前列腺， 可以調(diào)節(jié)酸堿度， 同時影響精液質(zhì)量． Kumar等[35]利用質(zhì)子核磁共振技術(shù)對高繁殖力和低繁殖力種公牛精漿和血清中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)精漿中的檸檬酸與種公牛生育能力有關(guān)． 在實驗中的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)， 檸檬酸在青綠飼料組中的含量較高， 這可能與精漿中的能量代謝相關(guān)．

本研究結(jié)果說明， 營養(yǎng)條件的改變會對意大利地中海種公牛精液質(zhì)量和生理代謝產(chǎn)生影響， 并影響精漿代謝水平．