中紅外光譜技術(shù)對(duì)臨澤小棗中多糖的定量分析

于喆源，楊璽文*，王曉霞，馮穎，梁磊

甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（張掖 734000）

中國有非常長的栽培棗的歷史，黃河流域一帶是其主要產(chǎn)地，也被認(rèn)為是中國比較特有的一個(gè)果樹資源[1]。臨澤小棗（Linze jujube）主產(chǎn)甘肅省張掖市臨澤縣和甘州區(qū)，具有1 400多年的種植栽培歷史，2008年臨澤小棗通過了國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局組織的專家審查會(huì)的評(píng)審，獲得了國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)，是我國著名的加工型優(yōu)質(zhì)棗品種之一[2]。多糖作為臨澤小棗一種主要成分，能有效清除人體內(nèi)氧自由基，具有提高機(jī)體免疫力的生理活性，在天然食品及藥品方面有著廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。目前，棗中多糖的測(cè)定方法主要以傳統(tǒng)可見光-紫外分光光度法為主，在實(shí)際操作過程中存在周期長、操作復(fù)雜、需要消耗大量的化學(xué)試劑等缺點(diǎn)，且容易產(chǎn)生偶然誤差，難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速經(jīng)濟(jì)的目標(biāo)。

紅外光譜技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種現(xiàn)代分析新技術(shù)，因其分析快速、操作簡單、不需要任何化學(xué)試劑、對(duì)樣品無損傷等特點(diǎn)，已經(jīng)在諸多領(lǐng)域發(fā)揮出重要的作用[5-6]。其中，中紅外光譜（MIR）可以依據(jù)化合物基團(tuán)振動(dòng)峰，快速鑒別其結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法構(gòu)建相關(guān)定量模型，克服近紅外光譜靈敏度低、無法直觀給出特征基團(tuán)信息等缺點(diǎn)，其靈敏度相比近紅外光譜會(huì)有明顯提高[7]。

因此基于中紅外漫反射光譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法以及多種波譜預(yù)處理方法，建立臨澤小棗中多糖的定量檢測(cè)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)臨澤小棗多糖的快速檢測(cè)，為進(jìn)一步建立全面的臨澤小棗質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和擴(kuò)大市場(chǎng)潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用到的36批臨澤小棗樣品采集自甘肅張掖臨澤小棗主要產(chǎn)區(qū)和成規(guī)模引種區(qū)域，經(jīng)甘肅張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院藥品檢驗(yàn)中心楊璽文工程師鑒定為鼠李科棗屬植物棗（Jujube）的干燥成熟果實(shí)。在采集樣品之后將其放置于陰凉的位置，采取自然保存的方式逐步晾干，在60 ℃下進(jìn)行24 h的干燥處理，然后將其粉碎，以粒徑0.075 mm的規(guī)格進(jìn)行過篩處理，再封袋以備后續(xù)使用。

D-葡萄糖（優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

IRSPirit傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；GL224i-1SCN萬分之一電子天平（賽多利斯上海貿(mào)易有限公司）；GL323-2SCN千分之一電子天平（賽多利斯上海貿(mào)易有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紅棗多糖的測(cè)定

紅棗多糖的測(cè)定，參考相關(guān)學(xué)者的優(yōu)化后方法[8-9]。精密稱取1 g樣品，采用石油醚除去脂，80%乙醇除去可溶性糖后水提多糖，精密最終定容體積50 mL，按《中華人民共和國藥典》（2015年版）第一部正文“枸杞子”下“多糖含量”項(xiàng)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸苯酚法，吸取0.2 mL樣品提取液，依法測(cè)定[10]。

1.3.2 紅外光譜的采集

利用IRSPirit傅里葉變換紅外光譜儀配備的漫反射附件采集樣品光譜。紅外光譜測(cè)定范圍7 900～400cm-1，掃描次數(shù)20次，分辨率4 cm-1，測(cè)量環(huán)境的濕度小于30%，溫度保持在25 ℃。以環(huán)境空氣作為背景，光譜數(shù)據(jù)以log（1/R）形式表示。

1.3.3 模型的建立

采用TQ Analyst光譜分析軟件對(duì)所得的紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理及模型的構(gòu)建。選取24個(gè)樣品作為校正集，其余12個(gè)樣品作為驗(yàn)證集，分別采用PLS、PCR、CLS和SMLR 4種方式進(jìn)行定量建模。波譜的預(yù)處理工作主要通過二階導(dǎo)數(shù)（SD）方法、一階導(dǎo)數(shù)（FD）方法、多元散射校正（MSC）方法以及矢量標(biāo)準(zhǔn)歸一化（SNV）方法，然后進(jìn)行效果的比較，以進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)的模型。所采用的驗(yàn)證指標(biāo)包括預(yù)測(cè)均方差（RMSEP），校正均方差（RMSEC）以及校正相關(guān)系數(shù)（R）等。模型的效果越好，R越接近1，而RMSECRMSEP的值越小[11]。

1.3.4 模型驗(yàn)證

對(duì)建好的模型進(jìn)行評(píng)估，取12個(gè)驗(yàn)證集進(jìn)行模型擬合，查看獨(dú)立驗(yàn)證集各樣品中模型預(yù)測(cè)多糖含量是否與實(shí)測(cè)多糖含量相符，如相符則證明模型良好。偏差越小，說明模型預(yù)測(cè)效果越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量

采用隨機(jī)的方法來分配臨澤小棗樣品（總數(shù)共計(jì)36個(gè)），形成所需的驗(yàn)證集與校正集，二者比例為1：2。具體樣品多糖含量分布見表1。由36個(gè)臨澤小棗樣品多糖含量的測(cè)定可以發(fā)現(xiàn)，所得的多糖含量數(shù)據(jù)中具有比較大的變化范圍，其中的最小及最大值都處于校正集之中，校正集和驗(yàn)證集具有比較相近的均值。

表1 校正集和驗(yàn)證集樣品含量分布

2.2 臨澤小棗中外光譜分析及建模方法的確立

多糖通常指10個(gè)以上單糖分子通過糖苷鍵連在一起的長鏈聚合物，各樣品的中紅外漫反射光譜如圖1所示?？梢钥闯觯R澤小棗樣品的紅外吸收峰主要集中在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，因此在后續(xù)的建模過程中以4 000～400 cm-1作為建模的全波段。3 600 cm-1處為—OH的伸縮吸收段，3 100～2 800 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，D-葡萄糖C==O伸縮振動(dòng)峰的位置處于1 600 cm-1周圍，而α-(1, 4)-糖苷鍵所對(duì)應(yīng)的伸縮振動(dòng)位置則處于 930 cm-1附近，處于1 100 cm-1周圍區(qū)域的通常為多糖O—H與C—C彎曲振動(dòng)以及C—O伸縮振動(dòng)所分別對(duì)應(yīng)的峰[12-13]。

基于臨澤小棗的紅外波譜特性，分別用PLS、PCR、CLS和SMLR構(gòu)建其多糖定量模型。各模型相應(yīng)的穩(wěn)定性如表2所示?？梢钥闯觯cPCR、CLS、SMLR相比，基于PLS構(gòu)建的多糖定量模型效果最優(yōu)，其相關(guān)系數(shù)R為0.951 8，校正集（RMESC）為2.87，驗(yàn)證集（RMSEP）為3.51。因此，選用PLS作為構(gòu)建臨澤小棗多糖中紅外定量模型的建模方法。

圖1 36批臨澤小棗的中紅外漫反射光譜圖

表2 4種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)多糖定量模型穩(wěn)定性的影響

2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇

在采集紅外光譜的相關(guān)信息過程中，所提取的有效信息將會(huì)受到一系列因素的影響，包括背景、散射光以及噪聲等方面，從而引起紅外光譜基線出現(xiàn)一定的漂移現(xiàn)象，所以有必要預(yù)處理原始的光譜信息。采用多元散射校正方法（MSC）可將漫反射所致光譜不重復(fù)性和鏡面反射等現(xiàn)象予以顯著的消除；而采用矢量標(biāo)準(zhǔn)歸一化的方法（SNV）則可使樣品不均勻所引起的各類噪聲予以有效的消除，此外還能夠消除光程變換的影響和散射作用等；導(dǎo)數(shù)處理可消除基線漂移、背景干擾并且忽略譜線重疊，主要用于基線校正與提高光譜分辨率[14-16]。當(dāng)前的研究工作對(duì)比了MSC，SNV，F(xiàn)D以及SD等預(yù)處理過程所獲得的結(jié)果，具體如表3所示。

表3 不同預(yù)處理方法對(duì)定量模型性能的影響

比較發(fā)現(xiàn)，采用FD+MSC對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，R2最大，RMSECV和RMSEP最小。因此，最終確定FD+MSC為試驗(yàn)最佳預(yù)處理方法，結(jié)果見圖2。

圖2 臨澤小棗多糖含量的MIR模型預(yù)測(cè)值與參考值相關(guān)圖

2.4 多糖定量模型的驗(yàn)證

在多糖定量分析模型中導(dǎo)入了驗(yàn)證集樣品（其數(shù)量共計(jì)12個(gè)）的紅外圖譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行多糖含量的預(yù)測(cè)，MIR預(yù)測(cè)值與真實(shí)值比較見表4，偏差圖見圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)，所得結(jié)果和預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)十分接近，絕對(duì)誤差范圍為-2.94～5.23，相對(duì)誤差范圍為2.79%～5.05%，說明建模效果較好，所建立的模型預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，其預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率較高，能夠滿足臨澤小棗關(guān)于多糖含量快速檢測(cè)任務(wù)。

表4 12份驗(yàn)證集樣品的真實(shí)值和預(yù)測(cè)值

圖3 臨澤小棗多糖含量的MIR預(yù)測(cè)值與參考值的偏差圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)基于中紅外漫反射光譜技術(shù)，采用現(xiàn)行主流分光光度法測(cè)定臨澤小棗中多糖含量，并與其光譜對(duì)應(yīng)，通過對(duì)比不同建模方式和光譜預(yù)處理方法處理后的結(jié)果，最終采用PLS方式，光譜預(yù)處理采用一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正，建立臨澤小棗中多糖含量模型。所建立的模型R2為0.965 5，RMSEC為2.71，RESEP為2.93。建立的模型效果較好，可用于臨澤小棗中多糖快速定量，達(dá)到快速、無損檢測(cè)的目的。研究所建立的基于中紅外漫反射光譜技術(shù)對(duì)臨澤小棗中多糖快速定量的方法，具有操作簡單、檢測(cè)效率高，不耗費(fèi)試劑等優(yōu)點(diǎn)，可為臨澤小棗的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開發(fā)潛在價(jià)值奠定一定基礎(chǔ)。

此次用于建模的臨澤小棗樣品數(shù)量為36批，覆蓋其主要產(chǎn)地甘肅張掖臨澤縣各個(gè)種植鄉(xiāng)鎮(zhèn)以及甘肅酒泉玉門市引種地區(qū)，但對(duì)其他地域引種樣本幾乎沒有涉及。在今后的研究中，將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，廣泛收集其他引種地域樣本，優(yōu)化模型，以期使模型更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。