顏穎慧,楊夢婕,王 梅,杜 嬈,朱增燕

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸會經(jīng)歷突觸強度的雙向變化，這一過程被稱為突觸可塑性。這些變化在長時程增強(long-term potentiation，LTP)或長時程抑制(long-term depression，LTD)期間發(fā)生在個別突觸的局部，統(tǒng)稱為Hebbian可塑性[1]。目前普遍認(rèn)為，通過Hebbian可塑性改變突觸強度是學(xué)習(xí)和記憶的細胞基礎(chǔ)，在可塑性過程中控制突觸強度的一個主要機制是改變突觸后膜上AMPA受體的數(shù)量、組成和生物物理性質(zhì)[1]。

AMPA受體為離子型谷氨酸受體，介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞，正在成為諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研發(fā)的作用靶點[2]，其有4種高度同源的亞基GluA1-4，由GluA1/2組成的四聚體是海馬組織中最主要的AMPA受體亞型。GluA2決定了天然受體的生物物理屬性，包含GluA2的離子通道是不通透Ca2+的。很多證據(jù)表明，在LTP初始階段突觸部位的Ca2+通透的AMPA受體(calcium permeable AMPARs，CP-AMPARs)是必需的，但在維持階段則非必要。在記憶檢索過程中，不通透Ca2+的AMPA受體(calcium impermeable AMPARs，CI-AMPARs)會被CP-AMPAR所替換[3]；但未經(jīng)調(diào)節(jié)的CP-AMPARs引起的Ca2+內(nèi)流被認(rèn)為是一些疾病中神經(jīng)功能紊亂和死亡的基礎(chǔ)[4-5]。可見，GluA2是否參與AMPA受體的構(gòu)成與組裝對受體功能發(fā)揮及突觸可塑性進程至關(guān)重要。

突觸后致密區(qū)(postsynaptic density，PSD)是興奮性突觸樹突棘內(nèi)致密的局部區(qū)域，可作為興奮性突觸的標(biāo)記，其由突觸可塑性相關(guān)的受體、激酶、結(jié)構(gòu)蛋白和信號分子組成。而突觸后密度蛋白-95(PSD95)是PSD最豐富的蛋白[6]，它是膜相關(guān)鳥苷酸激酶 (membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族的成員，是一種位于興奮性突觸的支架蛋白，參與N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體和AMPA受體向突觸后膜的穩(wěn)定、募集和運輸[6]。PSD95是神經(jīng)發(fā)育過程中參與谷氨酸傳遞、突觸可塑性和樹突棘形態(tài)形成的重要成分[7]。

來自嚙齒動物的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物被廣泛用于研究神經(jīng)元的基本生理特性。在體外神經(jīng)元發(fā)育和成熟的過程中，研究興奮性突觸傳遞與突觸可塑性的最佳培養(yǎng)時間如何確定；介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞的AMPA受體功能亞基GluA2的胞內(nèi)分布以及與作為興奮性突觸標(biāo)記的PSD95的定位之間是否存在聯(lián)系，目前尚未見報道。因此，本研究旨在對這些問題做一個初步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料新生24 h Sprague-Dawley大鼠用于體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元，培養(yǎng)液采用含B27(17504044，Gibco，USA)和Neurobasal(21103049，Gibco，USA)的血清培養(yǎng)基。細胞免疫熒光實驗中所用一抗為Anti-GluR2 (GluA2) (extracellular) Antibody(rabbit，alomone labs，Israel)和 PSD95 Antibody[7E3-1B8](mouse，abcam，USA)，二抗為驢抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor?594)和驢抗兔IgG H&L (Alexa Fluor?488)，均購買于Abcam公司。細胞免疫熒光實驗的觀察記錄使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡(Olympus Microsystems，Japan)。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)新生24 h大鼠以酒精棉球消毒、斷頸。取出半月形海馬，仔細剝離血管膜和其他附帶腦組織，加入含木瓜蛋白酶的消化液，37 ℃放置15 min，終止液終止消化，吹打15-20次使細胞分散。靜置2 min，將上清移入離心管，1 200-1 500 r·min-1離心5 min。傾去上清，加入貼壁液將沉淀吹打松散混勻。顯微鏡下計數(shù)后將1×106細胞種于多聚賴氨酸包被的共聚焦小皿中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。4-5 h后更換培養(yǎng)液仍為貼壁液，12 h后更換培養(yǎng)液為含B27的神經(jīng)元培養(yǎng)液(含五氟尿嘧啶)。以后每隔5-7 d 1/4換液，維持五氟尿嘧啶的濃度。實驗中涉及到動物的使用已經(jīng)過蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.3 細胞免疫熒光為測定GluA2與PSD95的共定位，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元至4、7、14及20 d，在4%多聚甲醛中室溫固定15 min，用PBS漂洗并以含0.3%Triton X-100及10%驢血清的PBS室溫封閉通透1 h。在0.5%BSA中分別與兔抗GluA2抗體(1 ∶250)和小鼠抗PSD95抗體(1 ∶200) 4 ℃搖動過夜，然后分別與驢抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor?594)和驢抗兔IgG H&L (Alexa Fluor?488)室溫孵育1 h。

1.4 熒光顯微鏡和數(shù)據(jù)分析圖像由Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡以60倍的倍率拍攝。用ImageJ軟件的Coloc功能定量分析GluA2和PSD95在原代海馬神經(jīng)元的樹突部位共定位情況。Coloc函數(shù)通過比較兩個標(biāo)記的立體像素強度之間的相似性來提供Pearson相關(guān)系數(shù)。相似性越高，Pearson相關(guān)系數(shù)越高，則代表兩種標(biāo)記物的共定位程度越高[8]。Pearson相關(guān)系數(shù)>0.6被認(rèn)為是強烈共定位。為了計算Pearson相關(guān)系數(shù)，創(chuàng)建了綠色標(biāo)記的GluA2通道(通道A)用于定義感興趣區(qū)域(ROI)。然后在COLOC模塊中，獲取通道A和紅色標(biāo)記的PSD95通道B的感興趣區(qū)域的立體像素強度。對于≥3個條件的統(tǒng)計比較，在PRISM中使用了單因素方差分析和Tukey’s的后處理分析。

2 結(jié)果

2.1 在神經(jīng)元培養(yǎng)的不同階段,PSD95在神經(jīng)元不同部位的表達培養(yǎng)至4、7、14及20 d的神經(jīng)元，PSD95在神經(jīng)元胞體、軸突、樹突和樹突棘顯示出明顯的分布差異(Fig 1)：神經(jīng)細胞核無PSD95表達，4DIV神經(jīng)元PSD95分布較均一，胞體、軸突、樹突均有表達；7DIV神經(jīng)元胞體、軸突、樹突均有PSD95表達，樹突熒光較弱，其分布與神經(jīng)元形態(tài)較一致，表達較為均一；14 DIV神經(jīng)元已可見PSD95呈點狀分布，樹突密集處點狀表達較多；20 DIV神經(jīng)元PSD95在樹突位置呈點狀密集分布，且可見在樹突棘的表達增多。

Fig 1 Cell morphology of primary hippocampal neurons (4DIV,7DIV,14DIV and 20DIV) and distribution of PSD95 and GluA2 (Scale bars,10 μm)

2.2 在神經(jīng)元培養(yǎng)的不同階段,胞內(nèi)GluA2在神經(jīng)元不同部位的表達培養(yǎng)至4 d、7 d、14 d及20 d的神經(jīng)元，GluA2顯示出在細胞內(nèi)的均勻分布，其在神經(jīng)元胞體、軸突、樹突分布均一，20DIV神經(jīng)元的樹突棘也有GluA2表達，與神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生一致(Fig 1)。GluA2在細胞核無表達。

2.3 隨神經(jīng)細胞的成熟，PSD95與GluA2的共定位表達水平逐漸下降培養(yǎng)至4、7、14及20 d的神經(jīng)元PSD95和GluA2在樹突(棘)的共定位表達如Fig 2所示。通過Pearson相關(guān)系數(shù)對樹突圖像中的總GluA2/PSD95共定位進行量化，結(jié)果顯示，4DIV和7DIV神經(jīng)元樹突部位Pearson系數(shù)分別為0.830±0.033和0.734±0.019，顯示兩種蛋白具有強烈的共定位；而14DIV和20DIV神經(jīng)元樹突部位Pearson相關(guān)系數(shù)則為0.547±0.021和0.574±0.024，呈現(xiàn)中等程度相關(guān)。4DIV神經(jīng)元(n=21)樹突共定位系數(shù)高于14DIV(P<0.01)和20DIV(P<0.01);7DIV神經(jīng)元樹突共定位系數(shù)高于14DIV(P<0.01)和20DIV(P<0.01)。

Fig 2 A. Colocalization of PSD95 and GluA2 on dendrites of different stages of primary hippocampal neurons;B. Pearson correlation of PSD95 and GluA2 on primary hippocampal neuron dendrites of different stages

3 討論

3.1 PSD95的功能定位依賴于樹突棘狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生PSD95在成熟的神經(jīng)細胞中主要表達于興奮性突觸后，為興奮性突觸上谷氨酸受體的聚集和穩(wěn)定提供支架,在大鼠出生后早期發(fā)育過程中，棘突不穩(wěn)定并且突觸不成熟，此時PSD95的表達很低，只有在成年后才增加到最高水平[9]。表達PSD95熒光標(biāo)記物的體外研究表明，大多數(shù)新的樹突棘最初缺乏PSD95[10-11]；在分離的神經(jīng)元培養(yǎng)中，新生樹突棘接收突觸前信號傳遞的數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)，PSD95-GFP在樹突棘中積累[10-12]。在這些研究中，已經(jīng)證明PSD95-GFP的招募依賴于突觸的活動[10-11]。體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的成熟過程中，PSD95蛋白始終表達于神經(jīng)元細胞內(nèi)，其分布卻不盡相同，且與神經(jīng)元形態(tài)密切相關(guān)。4DIV 的神經(jīng)元細胞形態(tài)單一、樹突稀少，7DIV的神經(jīng)元細胞可見較多無刺突樹突，14DIV神經(jīng)元細胞仍未見明顯樹突棘，至20DIV原代海馬神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)出較多棘狀結(jié)構(gòu)，這與成年小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生實驗中對新生神經(jīng)元進行的形態(tài)學(xué)分析結(jié)果相一致[13]，與此相對應(yīng)的，PSD95隨著細胞成熟逐漸呈點狀分布于樹突及樹突棘，棘狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生為突觸活動提供基礎(chǔ)，PSD95在棘部的定位標(biāo)志著成熟、穩(wěn)定突觸的存在。

3.2 GluA2與PSD95在樹突棘的共定位提示該樹突棘存在著包含AMPA受體的穩(wěn)定突觸成年小鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生實驗中對逆轉(zhuǎn)錄病毒標(biāo)記的神經(jīng)元進行的形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明，樹突棘形成的起點時間為16 d[13]，這也標(biāo)志著谷氨酸能突觸的發(fā)生，電生理結(jié)果也顯示到第3周，新生神經(jīng)元開始接受功能性谷氨酸能傳入，并顯示高頻適應(yīng)的重復(fù)動作電位?？梢娕d奮性谷氨酸受體的功能性表達依賴于神經(jīng)元的成熟。那么作為谷氨酸受體支架的PSD95表達對AMPA受體與NMDA受體功能影響是否相同呢？已有研究表明，PSD95在切片培養(yǎng)中的過表達導(dǎo)致AMPA受體介導(dǎo)的傳遞增加，并且可以模仿和阻斷LTP[14-15]。在體外培養(yǎng)神經(jīng)元中敲除PSD95會導(dǎo)致AMPAR介導(dǎo)的興奮性突觸后電流減少，并阻止具有功能性AMPA受體突觸的正常發(fā)育[16]。在PSD95基因敲除的小鼠中，興奮性突觸后電流的AMPA/NMDA介導(dǎo)比率也降低，這表明PSD95在興奮性突觸群體的成熟過程中發(fā)揮了作用，且在AMPA受體的功能發(fā)揮中扮演重要角色[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元過程中，20DIV原代海馬神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)出較多棘狀結(jié)構(gòu)，提示體外培養(yǎng)細胞表現(xiàn)為成熟神經(jīng)元狀態(tài)；隨著神經(jīng)元的成熟，PSD95與GluA2在樹突的共定位水平下降，尤其20DIV神經(jīng)元樹突部位GluA2與PSD95僅呈現(xiàn)中等程度共定位。研究結(jié)果提示，在樹突棘結(jié)構(gòu)出現(xiàn)之前，GluA2與PSD95在神經(jīng)元細胞的共定位意義不大，谷氨酸受體作為神經(jīng)元的固有屬性最初即表達于神經(jīng)元細胞內(nèi)，而PSD95依賴于突觸活動的招募方能發(fā)揮功能，兩種蛋白在神經(jīng)元棘狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生后才依賴于突觸活動發(fā)生有意義的功能定位。同時并非所有表達AMPA受體的棘狀結(jié)構(gòu)均表達PSD95，缺乏PSD95不一定能否定突觸的存在，而是表明缺乏包含穩(wěn)定的AMPA受體的成熟突觸。因此，體外培養(yǎng)神經(jīng)元至少應(yīng)在16-19 d以上才視為成熟的神經(jīng)元，能夠開展突觸可塑性等相關(guān)功能性研究。

綜上所述，GluA2蛋白在原代海馬神經(jīng)元成熟過程中胞內(nèi)分布無特異性，PSD95的胞內(nèi)功能定位依賴于樹突棘狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；而GluA2與PSD95在成熟神經(jīng)元樹突棘的共定位提示在該樹突棘部位存在著包含AMPA受體的穩(wěn)定突觸。