侯琛

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)生率和病死率[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因[2]，其中以骨轉(zhuǎn)移最為常見，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與形成[3]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[4-5]，其高表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）作為RUNX2的靶基因，可以降解多種ECM底物[7]，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用[8]。

早期研究發(fā)現(xiàn)RUNX2可調(diào)節(jié)MMP家族成員的表達(dá)，如MMP-9、MMP-13[9-10]，但有關(guān)RUNX2調(diào)節(jié)乳腺癌中MMP-3表達(dá)的研究非常有限。本研究將進(jìn)一步探討RUNX2表達(dá)水平對(duì)MMP-3基因轉(zhuǎn)錄的影響及其機(jī)制，為乳腺癌的靶向治療研究提供潛在的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、BT-549和人胚胎腎上皮細(xì)胞293T購于ATCC細(xì)胞庫；Opti-MEM、胎牛血清、RPMI-1640以及DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Platinum Quantitative PCRSuperMix-UDG試劑盒購于美國Invitrogen公司；氨芐青霉素購自上海生工公司；RUNX2、MMP-3抗體購于Santa Cruz公司，β-actin抗體購于美國Abcam公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Hind III酶、Xho I酶、GeneJETPlasmid Miniprep Kit試劑盒和GeneJETGel Extraction試劑盒購于美國Thermo公司；感受態(tài)細(xì)胞DH-5α、PrimeSTARMax DNA Polymerase、DNA Marker購自日本TaKaRa公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 RUNX2 和MMP-3 基因靶向關(guān)系以及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存（DMFS）的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org）根據(jù)Breast Cancer（METABRIC,Nature 2012 &Nat Commun 2016）數(shù)據(jù)集分析1902例乳腺癌患者組織中RUNX2和MMP-3 mRNA水平間相關(guān)性；在Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis）中下載乳腺癌患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)及生存信息，分析基因表達(dá)譜與預(yù)后間關(guān)系（http://kmplot.com/analysis）；生物信息學(xué)方法（http://www.cbioportal.org；http://jaspar.genereg.net；http://kmplot.com/analysis）預(yù)測(cè)乳腺癌中RUNX2與MMP-3的相關(guān)性和啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的保守序列以及其在乳腺癌患者中與DMFS的相關(guān)性[11]。

1.3 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶有His標(biāo)簽的RUNX2過表達(dá)質(zhì)粒，并用His抗體特異性結(jié)合于RUNX2結(jié)合的基因啟動(dòng)子序列。收集ChIP-DNA產(chǎn)物并利用GeneJETPCRPurification Kit試劑盒純化。引物設(shè)計(jì)軟件（NCBI中Primer Blast）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物序列（MMP-3 基因啟動(dòng)子區(qū)），引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳分析RUNX2 對(duì)MMP-3啟動(dòng)子DNA 片段的結(jié)合。C h IP 引物上游序列：5'-ATAGGGATCTTATTGC-3'，下游序列：5'-GAACATCTTGGGAGTA-3'；空白對(duì)照引物上游序列：5'-GAATGTTTGGAAATGGTCCT-3'，下游序列：5'-TCTCTATGCCTTGCTGTC-3'。PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板即ChIPDNA。反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP（25 mmol/L）2 μL，其中，上下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，DNA2 μL，Taq酶2.5U，補(bǔ)充水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，最適退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，共37個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，在成像儀中觀察RUNX2在MMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)序列是否存在結(jié)合。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、qRT-RCR 和Western blot

分別收集轉(zhuǎn)染了siRUNX2、RUNX2過表達(dá)質(zhì)粒的MB-MDA-231及BT549細(xì)胞并提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA；隨后，通過qRT-PCR檢測(cè)干擾RUNX2處理后的MMP-3的mRNA表達(dá)水平。RUNX2的上游引物序列：5'-CTCTGCACCAAGTCCTTTTAATC-3'，下游引物序列：5'-AGGAGGGGTAAGACTGGTCATAG-3'，探針序列：5'-TGCCTGGGGTCTGTAATCTGAC-3'；MMP-3 上游引物序列：5'-TGCCCACTTTGATGATGAG-3'，下游引物序列：5'-GTTGGCTGAGTGAAAGAGACC-3'，探針序列：5'-GACAAAGGATACAACAGG GACCAAT-3'。TaqMan PCR反應(yīng)體系：10 μLSuperMix，0.4 μLRox，0.6 μL上下游引物，1 μL模板cDNA，加水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，65 ℃（RUNX2）或57 ℃（MMP-3）延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

分別收集轉(zhuǎn)染了siRUNX2、RUNX2過表達(dá)質(zhì)粒的MB-MDA-231及BT549細(xì)胞，PBS沖洗2次后置于裂解液中冰上裂解30 min，隨后，4 ℃，12000r/min離心15 min，吸取上清于新EP管中進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。10% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，按比例稀釋一抗，β-actin（1∶7000）、RUNX2（1∶1000）、MMP-3（1∶1000），4 ℃過夜孵育；TBST 洗膜3 次（7 min/次）后室溫孵育二抗1 h，再用TBST洗膜3次（7 min/次），加入ECL發(fā)光工作液后顯影觀察。

1.5 PCR 法擴(kuò)增目的DNA 片段及純化

以收取細(xì)胞基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR法擴(kuò)增MMP-3基因包含結(jié)合序列以及空白對(duì)照的兩個(gè)不同片段大小的啟動(dòng)子區(qū)目的基因。雙熒光引物空白對(duì)照上游序列：5'-GGAGGTACCCTATTCTGCCCATGAGGTTT-3'，下游序列：5'-GCAGATCTCTGCCTCCTTGTAGGTCCAA-3'；雙熒光包含RUNX2結(jié)合位點(diǎn)的引物上游序列5'-GGAGGTACCGGGCATCTTCAGTCATAGGG-3'下游序列5'-GCAGATCTCTGCCTCCTTGTAGGTCCAA-3'。PCR 的反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，共35 個(gè)循環(huán)。PCR 的反應(yīng)體系：2×PrimeSTARMax Premix 25 μL；DNA2 μL；上、下游引物各 1 μL；加水補(bǔ)至50 μL。

1.6 MMP-3 基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

應(yīng)用特異的限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III對(duì)PGL3-Basic質(zhì)粒以及合成的啟動(dòng)子基因片段進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)物37 ℃水浴過夜，瓊脂糖凝膠電泳切取回收目的片段進(jìn)行DNA純化，同時(shí)利用T4DNA連接酶在PGL3-Basic載體中插入DNA片段，并將所得反應(yīng)物置于4 ℃過夜連接。隨后將10 μL的連接產(chǎn)物加入120 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，冰上放置30 min后，42 ℃的水浴90 s，再次置于冰上10 min。隨后，復(fù)加（無氨芐霉素抗性）LB的培養(yǎng)基1 mL進(jìn)行混勻，并置于37 ℃輕搖1 h，吸取100 μL涂抹在含氨芐霉素抗性LB平板中（在37 ℃的環(huán)境平板倒置過夜培養(yǎng)）。從中選取單個(gè)菌落加入培養(yǎng)基中并在37 ℃的搖動(dòng)12 h，經(jīng)過菌液PCR鑒定（反應(yīng)體系同1.5），將實(shí)驗(yàn)所得的質(zhì)粒送達(dá)北京金唯智公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用UCSC基因組瀏覽器與NCBI軟件所獲的啟動(dòng)子區(qū)序列，從比對(duì)中確認(rèn)克隆片段序列的正確性。

1.7 雙熒光素酶活性測(cè)定

參照生產(chǎn)商說明書，通過24孔板轉(zhuǎn)染雙熒光質(zhì)粒24 h后，去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，每孔內(nèi)添加100 μL裂解液，室溫?fù)u動(dòng)20 min至充分裂解；隨后吸取10 μL裂解產(chǎn)物與50 μL底物進(jìn)行混合，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性隨后加入50 μL的Stop&Glo Reagent，檢測(cè)海腎熒光素酶活性，計(jì)算上述兩種熒光素酶活性的比值。

1.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)

首先將Matrigel Invasion Chamber（BDBiosciences公司）從-20 °C冰箱放置4 ℃過夜，用50 mg/LMatrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃培養(yǎng)箱放置5 h使其凝固。之后分別在上室和下室中加入500 μL無血清培養(yǎng)基，然后放置于37 °C培養(yǎng)箱2 h。用移液器移除上下室中的培養(yǎng)基，下室中加入750 μL含20%血清的培養(yǎng)基。胰酶消化細(xì)胞，終止消化后1000r/min離心5 min棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1～2遍，用無血清培養(yǎng)基配制細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，取500 μL細(xì)胞懸液緩慢加入上室，輕輕混勻，定時(shí)觀察細(xì)胞穿過小室的侵襲情況。小室分別用棉簽小心擦去其上層的細(xì)胞。之后用配制好的4%甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，用Giemsa染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫30 min，清水沖洗，室溫風(fēng)干，用刀片將膜部分小心割下，中性樹膠固定封片。顯微鏡下觀察穿過孔的染色細(xì)胞，隨機(jī)選取的5個(gè)視野拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS21.0軟件用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Transwell實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RUNX2 與MMP-3 高表達(dá)乳腺癌患者DMFS降低

1902 例原發(fā)性乳腺癌患者腫瘤組織中，RUNX2與MMP-3的mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.3042，P<0.0001）（圖1A）。在Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫，RUNX2或MMP-3低表達(dá)患者的DMFS（黑色曲線）明顯高于RUNX2或MMP-3高表達(dá)患者（紅色曲線）（P=0.034，P=0.013（圖1B）。

圖1 數(shù)據(jù)庫資料分析 A：RUNX2 與 MMP-3 在乳腺癌中相關(guān)性分析；B：RUNX2 與MMP-3 在乳腺癌患者中與DMFS 相關(guān)性Figure 1 Database analysis A:Correlation analysis of the relationship between RUNX2 and MMP-3 in breast cancer;B:Correlation analysis of RUNX2 and MMP-3 with DMFS in breast cancer patients

2.2 RUNX2可調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-3表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，干擾RUNX2后，MDA-MB-231細(xì)胞MMP-3 mRNA水平下調(diào)（均P<0.05）（圖2A）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾RUNX2 后，MDA-MB-231與BT-549細(xì)胞中RUNX2和MMP-3蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而轉(zhuǎn)染RUNX2過表達(dá)質(zhì)粒后，MDA-MB-231與BT-549細(xì)胞中RUNX2與MMP-3蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)（均P<0.05）（圖2B）。以上結(jié)果證實(shí)，在MDA-MB-231細(xì)胞中RUNX2水平可以影響MMP-3表達(dá)。

圖2 RUNX2 對(duì)MMP-3 表達(dá)的影響 A：qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRUNX2 的MDA-MB-231 中RUNX2 與MMP-3 mRNA；B：Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRUNX2 及RUNX2 過表達(dá)質(zhì)粒后MDA-MB-231 與BT-549 細(xì)胞中RUNX2 與MMP-3 蛋白表達(dá)水平Figure 2 The effect of RUNX2 on MMP-3 expression A:The mRNA levels of RUNX2 and MMP-3 in MDA-MB-231 transfected with siRUNX2 detected by qRT-PCR;B:The protein levels of RUNX2 and MMP-3 in MDA-MB-231 and BT-549 cells transfected with siRUNX2 or RUNX2 over-expressed plasmid detected by Western blot

2.3 RUNX2 可以與MMP-3 基因啟動(dòng)子序列結(jié)合

通過生物信息學(xué)分析獲得MMP-3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb的啟動(dòng)子區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)MMP-3啟動(dòng)子序列中存在RUNX2結(jié)合位點(diǎn)（5'-ACCACA-3'）（圖3A）。利用ChIP實(shí)驗(yàn)在MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。采用脂質(zhì)體法用帶有His標(biāo)簽的RUNX2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，并用His抗體特異性結(jié)合于RUNX2結(jié)合的基因啟動(dòng)子序列，之后進(jìn)行PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，分析RUNX2對(duì)MMP-3啟動(dòng)子DNA片段的結(jié)合。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，RUNX2可以與MMP-3基因啟動(dòng)子序列結(jié)合（圖3B）。

圖3 RUNX2 與MMP-3 相關(guān)性驗(yàn)證 A：Jaspar 預(yù)測(cè)RUNX2 在MMP-3 基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)；B：ChIP 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RUNX2 與含有或缺乏RUNX2 結(jié)合序列的MMP-3 基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用Figure 3 Verification of the correlation between RUNX2 and MMP-3 A:Predicting the binding site of RUNX2 in the MMP-3 gene promoter using Jaspar;B:The binding of RUNX2 to the MMP-3 promoters containing or lacking RUNX2-binding sequences assessed by ChIP assays

2.4 啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證，構(gòu)建含有或缺乏RUNX2結(jié)合位點(diǎn)的MMP-3啟動(dòng)子區(qū)雙熒光報(bào)告質(zhì)粒。以293T細(xì)胞基因組DNA為模板，通過PCR法獲得MMP-3啟動(dòng)子區(qū)DNA片段，隨后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，可見擴(kuò)增出兩條條帶的狀態(tài)呈單一性，分別位于601 bp和1346 bp處，根據(jù)條帶位置可初步判斷出擴(kuò)增所得的DNA片段為所需的目的DNA片段（圖4）。

圖4 MMP-3 基因包含RUNX2 結(jié)合序列啟動(dòng)子區(qū)及其空白對(duì)照PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M：DL2000DNAMarker；1：不含RUNX2 結(jié)合位點(diǎn)MMP-3 基因啟動(dòng)子PCR 產(chǎn)物；2：含RUNX2 結(jié)合位點(diǎn)MMP-3 基因啟動(dòng)子PCR 產(chǎn)物Figure 4 Electrophoretogram of PCR amplification product of the promoter region of MMP-3 gene containing RUNX2 binding sequence and its blank control M:DL2000DNAMarker;1:PCR products of MMP-3 gene promoter containing no Runx2 binding site;2:PCR products of MMP-3 gene promoter containing Runx2 binding site

2.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，克隆片段與目的序列的理論序列大小一致，初步判斷質(zhì)粒構(gòu)建正確（圖5）。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳雙酶切鑒定 M：DL5000DNA marker；1：空白對(duì)照質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2：含RUNX2結(jié)合位點(diǎn)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物Figure 5 DNA plasmid identified by restriction endonucleases digestion M:DL5000DNA marker;1:Double digestion products of the empty control plasmids;2:Double digestion products of the plasmids containing RUNX2 binding site

2.6 RUNX2 可調(diào)節(jié)MMP-3 雙熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性

將含有RUNX2 結(jié)合位點(diǎn)的MMP-3 啟動(dòng)子序列克隆到pGL3-Basic質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-MMP-3及其空白對(duì)照熒光報(bào)告質(zhì)粒。通過siRNA沉默MDAMB-231 細(xì)胞中RUNX2 后，再分別轉(zhuǎn)染p GL3-MMP-3 質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒作為對(duì)照，雙熒光報(bào)告素酶系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。在沉默RUNX2表達(dá)的細(xì)胞中pGL3-MMP-3轉(zhuǎn)錄活性低于對(duì)照組（圖6），證實(shí)RUNX2能夠促進(jìn)MMP-3啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

圖6 RUNX2 對(duì)MMP-3 啟動(dòng)子雙熒光報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性影響Figure 6 Effects of RUNX2 on transcriptional activity of MMP-3 promoter luciferase reporter plasmids

2.7 RUNX2 和MMP-3 過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲

Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，RUNX2過表達(dá)的MDA-MB-231、BT-549與對(duì)照細(xì)胞相比侵襲能力增加，而同時(shí)沉默MMP-3表達(dá)之后，過表達(dá)RUNX2的兩種細(xì)胞侵襲能力降低（均P<0.05）（圖7）。

圖7 RUNX2 和MMP-3 過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 7 Effect of overexpression of RUNX2 and MMP-3 on the invasion ability of breast cancer cells

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，盡管在診斷、治療及預(yù)后評(píng)估方面已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但病死率仍然沒有明顯改善。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因激活與抑癌基因失活密切相關(guān)。因此，篩選出與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子遺傳學(xué)改變，對(duì)于早期診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后分層至關(guān)重要。本研究采用多種生物信息學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織中RUNX2和MMP-3 mRNA水平呈正相關(guān)，且高表達(dá)RUNX2或MMP-3患者具有更短的DMFS。進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RUNX2表達(dá)水平可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中MMP-3基因的轉(zhuǎn)錄水平，且兩者過表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，上述結(jié)果為乳腺癌的臨床研究提供了潛在的理論基礎(chǔ)。

RUNX2 屬于RUNX 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過調(diào)控下游基因表達(dá)參與細(xì)胞增殖分化等過程。RUNX2通過維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生成，調(diào)節(jié)骨發(fā)育[12-14]。早期研究發(fā)現(xiàn)，RUNX2可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，包括乳腺癌、胰腺癌、肝癌等[15-18]，其中越來越多的證據(jù)支持RUNX2在浸潤性乳腺癌中發(fā)揮重要作用。與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，RUNX2在浸潤性乳腺癌細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)上調(diào)[19]，是浸潤性和非浸潤性乳腺癌細(xì)胞比較篩選中確定的基因之一[20]。RUNX2過表達(dá)與乳腺癌的侵襲以及骨轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。

侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展及患者死亡的主要原因[21-22]。腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)轉(zhuǎn)移時(shí)，細(xì)胞首先要失去黏附力，運(yùn)動(dòng)并侵入ECM，隨后進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終在遠(yuǎn)處的組織和器官中定植形成轉(zhuǎn)移灶[23-24]。ECM的蛋白水解是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，也是是血管生成和腫瘤細(xì)胞浸潤的重要因素。研究[26-28]表明MMP在負(fù)責(zé)ECM的降解中起到關(guān)鍵作用[25]，MMP-1，-2，-3，-7，-9，-13和-14的上調(diào)與乳腺癌細(xì)胞的侵襲有關(guān)。早期研究[26]發(fā)現(xiàn)MMP-3過表達(dá)可導(dǎo)致小鼠乳腺腫瘤的形成。此外，據(jù)報(bào)道[27]MMP-3的表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)并與乳腺癌存活率相關(guān)。

盡管RUNX2 和MMP-3 在乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，但有關(guān)兩者間相互作用關(guān)系的研究非常有限。本研究聯(lián)合數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織RUNX2 mRNA與MMP-3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，高表達(dá)RUNX2 或MMP-3 的乳腺癌患者的DMFS均顯著降低，提示RUNX2和MMP-3能提高乳腺癌患者的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。RUNX2能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MMP-3 表達(dá)，提示RUNX2 很可能通過調(diào)節(jié)MMP-3表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力。經(jīng)過Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)RUNX2可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，若在過表達(dá)RUNX2的乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)MMP-3表達(dá)，則可以抑制細(xì)胞侵襲。由此，筆者推測(cè)RUNX2很可能通過調(diào)節(jié)MMP-3的表達(dá)參與乳腺癌細(xì)胞的侵襲。早期研究發(fā)現(xiàn)，RUNX2還可調(diào)節(jié)MMP2、MMP9和MMP13表達(dá)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[29-30]。由于MMP-3可以激活多種MMP，包括proMMP-1、-3、-7、-8、-9和-13[28]，因此，RUNX2 除了結(jié)合到MMP9、MMP13 啟動(dòng)子區(qū)并直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，還可能間接通過促進(jìn)MMP-3 的表達(dá)進(jìn)而激活MMP9 以及MMP13。因此，盡管單個(gè)金屬蛋白酶的表達(dá)雖然不足以使乳腺腺癌進(jìn)展為侵襲性和轉(zhuǎn)移性表型，但是可以通過多種基質(zhì)金屬酶的協(xié)作促進(jìn)乳腺癌侵襲過程，而這個(gè)階段正是針對(duì)乳腺癌疾病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應(yīng)引起足夠重視。

總之，本研究首次報(bào)道了RUNX2可以通過調(diào)節(jié)MMP-3表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞侵襲能力，為乳腺癌治療的臨床及基礎(chǔ)研究提供了潛在的理論基礎(chǔ)。