勵 炯,江 海,吳 瓊,扈明潔,趙琪奇,金朦娜,邱紅鈺

(杭州市食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310017)

畜禽類肉制品是人們蛋白質(zhì)攝入的主要來源,中國居民平均每日肉類攝入量為50～75 g[1]。畜禽類肉制品一般以整只或者切割方式進行銷售,消費者可以通過感官進行鑒別,但經(jīng)過粉碎、煙熏、腌制或者制成罐頭等處理的肉制品,會改變其原有的性狀特征[2],再加上不同肉類的價格差異,一些不法商家就用低經(jīng)濟價值肉類部分或者全部摻混到高經(jīng)濟價值的肉制品中,通過添加香精香料或者其他佐料,使得消費者只能通過外包裝的標簽信息購買其所需的肉制品[3]。2016年,Kane和Hellberg[4]的一項研究發(fā)現(xiàn),抽查的肉制品中有將近20%的畜禽類肉制品所標示的成分與實際檢驗結(jié)果不符。其他一些研究也表明有20%～70%的肉制品,包括碎肉、熟肉制品、寵物食品以及肉干,檢驗結(jié)果與其所標示的肉類品種不符合[5-6]。自從出現(xiàn)大規(guī)模的摻假肉制品事件后,歐洲各國已經(jīng)采取各種積極措施,避免肉類摻假事件的發(fā)生,以保障消費者的權(quán)益[7]。在美國,雖然各政府部門嚴令禁止銷售摻假肉制品,但仍有研究發(fā)現(xiàn)將近有17%的碎肉制品種類與標簽的標示不一致[8-9]。

經(jīng)過深加工處理的熟肉制品的摻假鑒別,一般采用DNA或者基于蛋白質(zhì)的分子生物學方法進行檢測[10-12],包括ELISA[13-14]、PCR[15-17]、RFLP[18-19]和DNA測序[20]等方法。近年來有研究用質(zhì)譜手段來分析蛋白質(zhì)和多肽,但是由于質(zhì)譜設備的昂貴以及操作的復雜性,并未被廣泛應用于肉類摻假鑒別中[21-22]。

2003年加拿大生物學家Paul Hebert首次提出了DNA條形碼的概念,其原理就是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段,這個片段在物種內(nèi)具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性,能夠?qū)崿F(xiàn)對物種進行快速、準確識別和鑒定,類似于超市里識別商品的條形碼[23]。很多研究表明線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因是肉類制品DNA條形碼技術(shù)較為理想的目的基因,一般采用全片段DNA條形碼技術(shù)(full-length DNA barcoding)來對保存完好的新鮮樣本進行鑒別,全片段DNA條形碼技術(shù)是以大約650 bp大小的COI基因片段為基礎來進行鑒定[24]。但是熟肉制品經(jīng)過高溫、高壓等加工處理,大量的DNA在深加工過程中會被降解,導致一些肉罐頭之類的肉制品在鑒別過程中,很難獲得全片段DNA條形碼[25]。2008年Meusnier等[26]報道了對DNA小片段的擴增的DNA微條形碼技術(shù)(mini-DNA barcoding),設計了專門針對全片段DNA條形碼中部分小片段DNA的通用型引物。雖然肉類的深加工會導致DNA片段的分解,但是可以利用DNA微條形碼技術(shù)實現(xiàn)對各種熟肉制品的COI基因片段的小片段(100～300 bp)的擴增,然后進行熟肉制品的肉的種類的鑒別。

本文采用基于COI序列的DNA微條形碼技術(shù)(mini-barcoding),通過優(yōu)化樣品前處理方法,利用通用引物COI-A對11種熟肉的DNA進行擴增,將擴增后的片段經(jīng)克隆測序并將結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫Blast比對,成功的對熟肉制品中11種肉類進行摻假鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究所用的11種肉類(包括豬、牛、羊、雞、鴨、鴿子、馬、驢、鵝、兔、鼠等)為了保證其沒有摻假,購買沒有加工過的完整的生鮮肉,作為本研究用的純?nèi)?研究所用的熟肉制品 部分來自2019年杭州市市場監(jiān)管局監(jiān)督抽樣,部分采購于超市,包括牛肉、羊肉、鴿子肉、鵝肉、兔肉等共5種熟肉制品,共計30批次,其產(chǎn)品包括肉干、肉罐頭、肉串、肉丸、肉醬、肉餡、肉粒等;血液與組織DNA提取試劑盒 德國QIAGEN公司;PCR產(chǎn)物及DNA片段回收試劑盒、T4連接試劑盒、pGEM-T載體、DH5α感受態(tài)細胞 天根生化科技有限公司;即用PCR擴增試劑 上海生工公司。

高速離心機 德國sigma公司;干式恒溫器 杭州奧盛儀器有限公司;Veriti 96孔梯度PCR儀 美國ABI公司;EYELA FDU-1100真空冷凍干燥器 日本東京理化公司;PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;NanoDrop 1000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 生鮮肉:經(jīng)過高溫煮沸20 min,將煮熟的純?nèi)饬栏珊蠓湃肓侠頇C粉碎處理后備用。

熟肉制品:取30批次的熟肉制品的肉部分,用料理機處理后,將打碎的樣品置于250 mL燒杯中,加入150 mL去離子水,超聲處理30 min,去掉水溶液,肉沫殘渣備用。將經(jīng)料理機粉碎處理后的11種純熟肉以及30批次經(jīng)處理的殘渣肉沫放于-40 ℃冰箱進行預冷4 h,將預冷后的樣品放在真空冷凍干燥箱中,在真空度低于1×10-4Pa,溫度-50 ℃條件下真空冷凍干燥24 h,真空冷凍干燥后的樣品經(jīng)中藥粉碎機粉碎后,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取 本文采用DNeasy血液與組織提取試劑盒對經(jīng)1.2.1預處理的熟肉制品進行DNA提取和純化。取真空冷凍干燥后的樣品粉末0.5 g置于10 mL離心管中,加入2 mL ATL緩沖溶液和200 μL蛋白酶K,漩渦振蕩30 s,經(jīng)56 ℃裂解3 h,每隔30 min進行漩渦振蕩一次。取裂解液250 μL上柱,DNA經(jīng)AW1和AW2緩沖液洗柱膜后,用37 ℃預熱的AE緩沖液洗脫DNA,并將其儲存在-20 ℃。同時做試劑空白。

凍融作用對土工程性質(zhì)的影響是由于分凝冰的出現(xiàn)改變了土骨架的結(jié)構(gòu)所造成的, 因此影響分凝冰或者分凝勢的因素也必然影響凍融后土的工程性質(zhì)，如孔隙率和干密度。Chamberlain等[6]認為,凍融通過改變土的結(jié)構(gòu)性，如土中產(chǎn)生大孔隙、縱向微裂隙等, 從而使其垂直方向的滲透性增大。反復凍融不僅破壞了土顆粒間的聯(lián)結(jié)力, 同時使土顆粒得以重新排列。目前，廣泛認為凍融循環(huán)可以從多方面改變土的工程性狀,而這些都是通過改變土的結(jié)構(gòu)性實現(xiàn)的。一些研究還發(fā)現(xiàn)土的滲透性和密度經(jīng)3～5次凍融循環(huán)后趨于穩(wěn)定[1，6-7]。

1.2.3 COI基因的擴增 本文選用王爽等[27]公開發(fā)表的一對引物(COI-A,詳細序列見表4),引物上連接M13,引物合成由杭州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

從每批樣品中提取的DNA模板進行微型片段的PCR擴增。每個PCR擴增反應管包含以下試劑(25 μL體系):12.5 μL即用PCR擴增試劑,9.5 μL ddH2O,0.5 μL 10 μmol/L正向引物,0.5 μL 10 μmol/L反向引物,2 μL DNA模板。DNA微條形碼片段擴增程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 1 min,46 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,循環(huán)5次;95 ℃ 1 min,53 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,循環(huán)35次;最后72 ℃保持10 min。將擴增片段儲存于-20 ℃。

1.2.4 PCR擴增片段的確認及DNA測序 采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離進行電泳PCR擴增產(chǎn)物,將所需的目標片段經(jīng)切膠回收純化后,送公司(杭州擎科生物技術(shù)有限公司)進行測序。

1.2.5 PCR產(chǎn)物克隆測序 PCR產(chǎn)物中挑選不同陽性克隆進行測序分析。純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后,導入DH5α感受態(tài)細胞。36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,經(jīng)過藍-白篩選后,挑取10個不同的白色菌落接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜(36 ℃,150 r/min搖床),取菌液1 mL提取質(zhì)粒DNA,送杭州擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.6 測序結(jié)果分析 將1.2.3和1.2.4所得的測序結(jié)果經(jīng)刪除兩端引物和質(zhì)粒序列后,提交GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對,同時利用NCBI數(shù)據(jù)庫對樣品的COI序列進行鑒定和相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預處理方式的選擇

肉摻假樣品的前處理方式非常關(guān)鍵,特別是混合預處理,如果處理方式選擇不當,會引起漏檢或者誤檢,所以選擇一種能使所得樣品具有可靠性和代表性的預處理方式非常重要。一般的預處理方式是用料理機或者粉碎機,將樣品打碎混合均一,或者采用液氮研磨法進行處理,本文采用真空冷凍干燥法,即取200 g的樣品組織,進行冷凍干燥,將干燥后的樣品經(jīng)粉碎機粉碎均勻。本文采用牛肉摻假豬肉模式(其中豬肉的摻假比例為10%,經(jīng)煮沸20 min處理),對料理機粉碎處理、液氮研磨法以及真空冷凍干燥法三種預處理方式進行可靠性考察,各選用20份摻假樣品,每份樣品取0.5 g,分別經(jīng)上述三種預處理方式進行處理后,進行摻假檢測,結(jié)果見表1。

表1 3種預處理方式對牛肉摻假 豬肉模式(10%)的檢出情況Table 1 Detection of beef adulterated pork model(10%)by three pretreatment methods

從表1可以看出,三種預處理方式中,真空冷凍干燥法的可靠性最高,在20份摻假模式中均檢出豬肉成分;而料理機粉碎處理的可靠性最低,檢出率僅為25%,說明該預處理方式?jīng)]有把樣品充分混勻;而液氮研磨法,其檢出率只有60%,經(jīng)液氮研磨后的樣品,雖然已經(jīng)粉碎,但是還是含有一定量的水分,造成樣品的不均一性。所以本文采用真空冷凍干燥法作為熟肉制品中摻假鑒定的預處理方式。

2.2 DNA提取方式的選擇

樣品取樣的可靠性和代表性在熟肉制品摻假檢測中也非常關(guān)鍵,其中如果樣品取樣量太少,代表性不足,也會引起漏檢,并且在肉制品加工過程中,設備中殘留的上一批次的其他肉類會帶入下面一批次的肉制品中,沒有代表性的取樣也會引起實驗結(jié)果誤判。DNeasy血液與組織提取試劑盒建議取樣量為10～25 mg,但這個取樣量是針對純的樣品,如果要提取摻混樣品,顯然這個取樣量太小。本文采用牛肉摻假豬肉模式(其中豬肉的摻假比例為10%,經(jīng)開水煮沸20 min),對摻假樣品的取樣量的可靠性進行研究。樣品經(jīng)真空冷凍干燥處理后,取樣品粉末分別為25 mg、0.1 g和0.5 g,分別取20份,經(jīng)過前處理和檢測結(jié)果見表2,當取樣量為25 mg時,陽性檢出率只有45%,但取樣量為0.1 g時,檢出率提高至85%,但還是會有漏檢的比例,所以當取樣量增至0.5 g時,檢出率達到100%。所以本文最終選取樣量0.5 g對肉制品樣品DNA進行提取。

表2 3種取樣量對牛肉摻假豬肉模式(10%)的檢出情況Table 2 Detection of beef adulterated pork model(10%)by three sample weights

表3 11種純的熟肉DNA提取純度Table 3 Purification of 11 cooked samples found to contain one species

2.3 DNA微條形碼序列片段的擴增條件優(yōu)化

通過查閱文獻,參考了三對通用引物COI-A,COI-B和COI-C(具體引物序列詳見表4),并分別考察了三對通用引物對11種熟肉的擴增效率。11種經(jīng)煮沸處理的肉DNA經(jīng)柱膜法提取后,分別加入三對通用引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),通用引物COI-B雖然能擴增出大部分的熟肉類的DNA,但是雞肉和鼠肉的條帶非常淺,擴增效率非常低;而通用引物COI-C在熟羊肉、馬肉和驢肉三種肉DNA擴增失敗,沒有條帶;而引物COI-A擴增目標片段為130 bp左右,能成功擴增出11種熟肉的微條形碼DNA片段,三種引物的擴增結(jié)果圖詳見圖1。所以本文最終采用COI-A作為熟肉制品中11種肉摻混研究的通用引物。

圖1 11種純的熟肉DNA微條形碼的PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis images of DNA mini-barcoding fragments amplified by PCR from 11 species of cooked meat 注:A:COI-A;B:COI-B;C:COI-C;M:Marker:100～600 bp;0:陰性對照;1:PCR產(chǎn)物(豬);2:PCR產(chǎn)物(牛);3:PCR產(chǎn)物(羊);4:PCR產(chǎn)物(鴨);5:PCR產(chǎn)物(雞);6:PCR產(chǎn)物(馬);7:PCR產(chǎn)物(鴿子);8:PCR產(chǎn)物(驢);9:PCR產(chǎn)物(鵝);10:PCR產(chǎn)物(兔);11:PCR產(chǎn)物(鼠)。

確定11種熟肉DNA微條形碼序列擴增用的通用引物之后,本文對PCR的擴增體系和擴增程序進行優(yōu)化。本文的目的是在高經(jīng)濟價值的肉類(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)中檢出摻假的低經(jīng)濟價值的肉類(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等),所以擴增條件優(yōu)化的目的是:在該擴增條件下,使低經(jīng)濟價值肉類的擴增效率相對較高,而高經(jīng)濟價值肉類的擴增效率相對低,這樣有利于提高檢測靈敏度。

在PCR擴增體系中,DNA模板的濃度會影響擴增效率,濃度過高過低均會降低其效率,在25 μL擴增體系中,本文考察DNA模板的不同使用量(1、2、3 μL),當DNA模板的加入量為2 μL時,11種熟肉的DNA條帶均比較明顯,而且低經(jīng)濟價值的肉類(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等)的條帶比高經(jīng)濟價值的肉類(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)的條帶明顯,擴增效率高。

PCR擴增程序中的退火溫度對DNA微條形碼序列的擴增效率影響非常大,本文考察了三個退火溫度(50、53以及57 ℃)對11種熟肉的DNA微條形碼序列的擴增效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當退火溫度為53 ℃時,11種熟肉的擴增效率較好,電泳跑膠條帶較明顯,低經(jīng)濟價值的肉類(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等)的條帶比高經(jīng)濟價值的肉類(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)的條帶明顯,擴增效率高,能滿足本研究摻假模式的建立以及目標摻假肉類的檢測,擴增產(chǎn)物電泳跑膠結(jié)果見圖1。從圖1A中可以看出,11種肉在100～200 bp之間均有一條較明顯的擴增條帶。然后將11種肉的PCR擴增產(chǎn)物送至生物公司進行克隆測序,測序結(jié)果見表5。

表5 11種純的熟肉DNA微條形碼檢測結(jié)果Table 5 DNA mini-barcoding results for 11 cooked samples found to contain one species

2.4 熟肉摻假模式建立

本研究主要設定兩種肉的摻假模式,采用高經(jīng)濟價值的肉類(牛、羊、鴿子、鵝、兔)與低經(jīng)濟價值肉類(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠)的摻混模式,具體見表6。

表6 熟肉類摻假模式Table 6 Cooked meat adulteration model

本文考察了5種高經(jīng)濟價值熟肉類的摻假的可能性,一共建立18個摻假模式,然后分別加入5%、10%、15%和20%的摻假比例來考察本方法的最低檢出比例(檢測靈敏度),結(jié)果發(fā)現(xiàn),本方法在牛肉和羊肉的熟肉制品中的摻假的檢出靈敏度較高,除了雞肉,其他5種摻假肉類的檢出靈敏度為5%,牛肉和羊肉中的雞肉摻假的最低檢出比例為10%;而鴿子肉、鵝肉、兔肉的摻假模式中,各種肉類的最低檢出比例均為10%,本方法能滿足日常的檢測要求。

2.5 實際樣品檢測

熟肉制品加工過程中,經(jīng)過粉碎、煙熏、腌制或者制成罐頭食品等處理,可能會加入高含量的食用油和鹽,會改變原有的性狀以及感官特征,除此之外,可能會加入一些香精香料色素等添加劑,以來掩飾其摻入的其他低經(jīng)濟價值的肉類。按照本文建立的方法,對30批次熟肉制品進行摻假鑒別,具體結(jié)果詳見表7。

表7 實際樣品檢測結(jié)果Table 7 Results of samples

本文利用建立的DNA微條形碼技術(shù),對30批次的高經(jīng)濟價值的熟肉制品進行摻假鑒定,其中包括18批次的牛肉制品、8批次的羊肉制品、2批次的兔肉制品、1批次的鴿子肉制品和1批次的鵝肉制品。樣品經(jīng)DNA提取和擴增,除了2批次的牛肉丸和2批次的羊肉丸,經(jīng)凝膠電泳分離后均能得到清晰的條帶,4個批次的肉丸沒有條帶,未檢出肉或者羊肉成分。將PCR擴增產(chǎn)物送至生物公司進行克隆測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1批次的牛肉干、1批次的牛肉串、1批次的牛肉醬以及1批次的羊肉串均檢出鴨肉成分,而1批次的牛肉罐頭、2批次的牛肉餅的餡料均檢出豬肉成分。18批次牛肉制品中,有6批次為摻假豬肉或者鴨肉成分,2批次為未檢出牛肉成分,不合格率為44%;8批次的羊肉制品中,有一批次檢出鴨肉成分,2批次未檢出羊肉成分,不合格率為38%;2批次的兔肉制品、1批次的鴿子肉制品以及1批次的鵝肉制品均未檢測出摻假肉類;30批次的熟肉制品中,一共有7批次有摻假情況,4批次沒有添加其所宣稱的肉類,不合格率為37%。同時,為了驗證本檢測方法的可靠性,對上述7批次的摻假樣品和4批次的肉丸產(chǎn)品采用農(nóng)業(yè)部標準NY/T 3309-2018《肉類源性成分鑒定 實時熒光定性PCR法》進行驗證,結(jié)果與本方法一致。從上述結(jié)果可以看到,兩類高經(jīng)濟價值熟肉制品(牛肉和羊肉)的摻假率比較高,會摻入豬肉成分或鴨肉成分,由于在深加工過程中改變了其原有的肉的感官性狀和添加食用油和鹽等調(diào)料,不法商家還會加入一些添加劑(色素、香精香料等)等手段來掩飾摻入的其他低經(jīng)濟價值肉類,消費者很難用憑感官來辨別,也導致市售熟肉制品的摻假率居高不下。

3 結(jié)論

本文建立了基于COI的DNA微條形碼技術(shù)對熟肉制品中的11種肉摻假鑒定方法,采用真空冷凍干燥技術(shù)對肉制品進行前處理,并優(yōu)化了DNA提取和PCR擴增條件。樣品經(jīng)超聲、-40 ℃冰箱進行預冷4 h處理后,于真空度低于1×10-4Pa,溫度-50 ℃條件下真空冷凍干燥24 h。預處理后的樣品經(jīng)DNeasy血液與組織提取試劑盒提取和純化后的DNA模板,采用引物COI-A 進行PCR擴增,目標擴增物經(jīng)切膠純化后進行克隆測序,并將測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫Blast比對。與其他檢測技術(shù)相比,本方法更加簡便、經(jīng)濟、高效,能夠滿足日常熟肉質(zhì)量監(jiān)督檢測的需求。