單菌或混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵對辣木莖稈粉營養(yǎng)成分和植酸變化的影響

■張玉鵬 李夢梅* 李家明 汪騰蛟 Chidvilaphone Saythong 鄂曉迪 左舒月 沙國新

（1.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧530005；2.廣西習緣辣木有限公司,廣西南寧530000）

辣木為辣木科辣木屬多年生植物，因其根有辛辣味，故而得名辣木[1]。辣木原產于印度，在我國的云南、廣東、廣西等地均有種植[2]，在廣東、福建等經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)在企業(yè)和科研機構的推動下，已經(jīng)形成大規(guī)模的種植基地，目前以云南省種植最多，占中國辣木市場的三分之二，并且隨著人們對辣木的了解，受到了越來越多農業(yè)從事者的青睞。辣木被視為“熱帶的天然營養(yǎng)素”，整棵樹幾乎所有部分都具有很高的營養(yǎng)價值。研究表明，辣木除了富含蛋白質、膳食纖維、多種維生素和礦物質外[3]，還富含多糖類、多酚類等抗氧化活性成分[4]，是很好的天然抗氧化劑，攝入后可增強機體對抗自由基的能力，也可預防或延緩疾病發(fā)生,具有抗腫瘤、降血脂、降血糖的作用，因此，辣木也被譽為“奇跡之樹”[2]。辣木的根、葉、皮、種子、花和豆莢都是可食用的[5]，但是不同部位的營養(yǎng)成分不同，其中蛋白質含量最高的部位是辣木葉，膳食纖維在莖稈中含量最高；葉酸在果實中含量最高，根中的碳水化合物含量均高于其余部位[6]。我國傳統(tǒng)蛋白質原料匱乏，嚴重制約著畜牧業(yè)的發(fā)展，辣木葉粉具有高蛋白質、低纖維的特點，符合優(yōu)質蛋白質飼料的標準，因此是一種極具開發(fā)利用價值的植物性蛋白源，并且已經(jīng)有大量報道表明辣木葉代替部分魚粉、菜籽粕、豆粕飼喂動物可以取得理想的效果。而辣木的莖稈因粗纖維含量較多、蛋白含量不高等原因，國內外對于將辣木莖稈作為新型飼料的開發(fā)報道不多。固態(tài)發(fā)酵是指利用微生物在潮濕的沒有自由流動水的固體基質上生長代謝的技術[5]。近幾年來采用多菌種復合協(xié)同發(fā)酵方式是研究的熱點，通過微生物之間的共生關系，充分發(fā)揮微生物之間協(xié)同和互補作用，提高畜禽對秸稈的適口性及消化率，減少飼料成本及環(huán)境污染[7]。為了改善辣木莖稈的營養(yǎng)價值，本試驗采用菌酶聯(lián)合對其進行固態(tài)發(fā)酵。目前在固態(tài)發(fā)酵蛋白飼料上面應用黑曲霉、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、植酸酶等比較廣泛。研究表明，黑曲霉可產生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、糖化酶、果膠酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多種酶[8]；枯草芽孢桿菌不僅自身能夠分泌α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶，同時也能刺激宿主分泌消化酶并增強其活性[9]；酵母菌細胞不僅富含畜禽生長需要的蛋白質、脂肪、維生素等多種營養(yǎng)物質，而且還可以產生多種酶類，降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，提高飼料利用率[10]；植酸酶可以催化植物中的植酸及其鹽類，將植酸或其鹽類降解為能被畜禽利用的肌醇和無機磷[11]。本試驗以辣木莖稈粉為基質，探討黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植酸酶單獨或菌酶協(xié)同發(fā)酵時對辣木莖稈營養(yǎng)成分變化的影響，旨在為開發(fā)新型辣木飼料提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 辣木莖稈粉

辣木莖稈粉由廣西習緣辣木有限公司提供。

1.1.2 菌株和酶

黑曲霉(FCCC 114002)、釀酒酵母(ATCC 26603)為實驗室保存菌種；枯草芽孢桿菌（FSCC 115037）與植酸酶（5 U/mg）均購自上海谷研生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、丙酮、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、四硼酸鈉、三甘醇、無水亞硫酸鈉、十六烷三甲基溴化銨等均為分析純，均購自北京索萊寶科技有限公司。PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自南寧五棵松生物試劑經(jīng)營部。

電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；A200i半自動纖維分析儀,美國ANKOM-上海瑞望儀器設備有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2），常州普天儀器制造有限公司。紫外分光光度計（SP-756P），上海光譜儀器有限公司；Centrifuge 5804R離心機,德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

枯草芽孢桿菌LB液體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24 h。黑曲霉和釀酒酵母接種于PDA固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.3.2 種子液的制備

將釀酒酵母菌和黑曲霉接種于PDA固體培養(yǎng)基中，30℃無菌恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 d，待其長滿整個培養(yǎng)基，用無菌純水沖洗，將其濃度調節(jié)為1×108CFU/mL?？莶菅挎邨U菌接種于LB液體培養(yǎng)基35℃，250 r/min條件下恒溫培養(yǎng)48 h，用無菌水稀釋至濃度為1×108CFU/mL。

1.3.3 辣木莖稈粉發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵的制備

稱取120 g辣木莖稈粉作為發(fā)酵基質，植酸酶（Z）的添加量為180 U/g，黑曲霉(H)、枯草芽孢桿菌（K）、釀酒酵母（N）按10%添加量（接種比例為1∶1和1∶1∶1）與植酸酶（添加量為180 U/g）組成雙菌加酶組和三菌加酶組。對照組則添加等量的無菌水，其他發(fā)酵條件保持一致，以70%含水量在無菌恒溫培養(yǎng)箱中30℃恒溫發(fā)酵10 d，分別在第1、2、4、6、8、10 d取樣。菌種和植酸酶的組合方式見表1。

表1 菌種和植酸酶的組合方式

1.4 成分的測定

1.4.1 營養(yǎng)成分的測定粗脂肪(EE)含量的測定采用GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》；粗蛋白(CP)含量的測定參考GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維參考Van Soest法[12]測定。

1.4.2 植酸的測定

參考李鎮(zhèn)剛等[13]的方法測定植酸含量。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 24.0進行差異顯著性分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05為差異顯著標準。

2 結果與分析

2.1 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗蛋白含量的影響（見表2、圖1）

表2 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗蛋白含量的影響（干物質,%）

如表2和圖1所示，在整個固態(tài)發(fā)酵過程中，各組的粗蛋白含量都呈增加的趨勢。從表2中可以看出，從發(fā)酵的第6 d開始，除T1組外，單菌或混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵時辣木莖稈粉中的粗蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；在發(fā)酵的第8 d開始T5、T6、T7、T8組粗蛋白含量要顯著高于CK、T1、T2、T3、T4組，這說明混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵要優(yōu)于單菌與植酸酶發(fā)酵；單獨添加植酸酶對粗蛋白含量變化與對照組差異不顯著（P＞0.05），這說明植酸酶對粗蛋白含量的提升沒有太大的影響；從整個發(fā)酵過程來看，發(fā)酵的前8 d，各個處理組粗蛋白含量呈上升趨勢，到第10 d時，上升趨勢下降，這說明在發(fā)酵的第8 d基本已達到最佳發(fā)酵時間。

2.2 酶菌協(xié)同發(fā)酵對酸性洗滌纖維含量的影響（見表3、圖2）

圖1 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗蛋白質含量的影響

表3 酶菌協(xié)同發(fā)酵對酸性洗滌纖維含量的影響（干物質,%）

圖2 酶菌協(xié)同發(fā)酵對酸性洗滌纖維含量的影響

由表3和圖2可知，所有試驗組的酸性洗滌纖維都呈下降趨勢。在整個發(fā)酵過程T1、T4組和對照組相比差異不顯著（P＞0.05），這說明植酸酶和釀酒酵母單獨或協(xié)同添加對酸性洗滌纖維含量的降低無明顯作用。在發(fā)酵的第6 d開始，T2、T3、T5、T6、T7、T8組酸性洗滌纖維含量均顯著低于對照組（P＜0.05），這說明黑曲霉、枯草芽孢桿菌單菌或混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵時能很好地降低酸性洗滌纖維的含量。在發(fā)酵的前8 d酸性洗滌纖維的含量呈快速下降趨勢，在第10 d時，下降趨勢變得緩慢，這說明在發(fā)酵的第8 d時達到了很好的發(fā)酵效果。

2.3 酶菌協(xié)同發(fā)酵對中性洗滌纖維含量的影響（見表4、圖3）

表4 酶菌協(xié)同發(fā)酵對中性洗滌纖維含量的影響（干物質，%）

圖3 酶菌協(xié)同發(fā)酵對中性洗滌纖維含量的影響

如表4和圖3所示，在整個發(fā)酵過程T1、T4組和對照組相比差異不顯著（P＞0.05），這說明植酸酶和釀酒酵母單獨或協(xié)同添加對中性洗滌纖維含量的降低無明顯作用。在發(fā)酵的第8 d開始，T2、T3、T5、T6、T7、T8組中性洗滌纖維含量均顯著低于對照組（P＜0.05），這說明黑曲霉、枯草芽孢桿菌單菌或混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵時能很好地降低中性洗滌纖維的含量。在發(fā)酵的前8 d中性洗滌纖維的含量呈快速下降趨勢，在第10 d時，下降趨勢變得緩慢，這說明在發(fā)酵的第8 d時達到了最佳狀態(tài)。

2.4 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗脂肪含量的影響（見表5、圖4）

表5 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗脂肪含量的影響（干物質，%）

圖4 酶菌協(xié)同發(fā)酵對粗脂肪含量的影響

由表5和圖4可以看出，隨著發(fā)酵的進行粗脂肪的含量呈上升趨勢。在發(fā)酵的前6 d各處理組粗脂肪含量和對照組粗脂肪含量無顯著差異（P＞0.05），第8 d時T6、T7、T8組粗脂肪的含量顯著高于CK、T1、T2、T3、T4、T5組（P＜0.05）。在發(fā)酵到第10 d時各試驗組粗脂肪含量增加幅度變得緩慢，并且有的組粗脂肪含量還有略微下降趨勢，這可以說明在發(fā)酵的第8 d粗脂肪的含量提高處于一個比較佳的時間。

2.5 酶菌協(xié)同發(fā)酵對植酸含量的影響（見表6、圖5）

由表6和圖5可知，植酸的含量呈下降趨勢，自發(fā)酵的第6 d開始各處理組植酸的含量均顯著低于對照組（P＜0.05）；在發(fā)酵的10 d時，T5、T6、T7、T8組植酸的含量顯著低于CK、T1、T2、T3、T4組，這說明混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵要優(yōu)于單菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵；在發(fā)酵的前8 d植酸含量的下降趨勢比較明顯，到第10 d時植酸含量的下降趨勢呈緩慢狀態(tài)，這說明發(fā)酵的第8 d是最佳發(fā)酵時間。

3 討論

3.1 多菌聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢

用微生物固態(tài)發(fā)酵技術提高飼料品質是近幾年來飼料行業(yè)研究的熱點[14]。有大量報道多菌優(yōu)于單一菌種發(fā)酵，這是因為單菌發(fā)酵時微生物的代謝產物大量積累會反饋阻遏相關酶類的合成，而多菌混合發(fā)酵時，各種微生物間大多具有代謝協(xié)調作用，從而解除反饋阻遏作用[5]。孫旸等[15]采用混菌將玉米秸稈發(fā)酵后粗蛋白的含量從3%～5%提高到15.471%；陳慶森等[16]用多菌種發(fā)酵玉米秸稈后粗蛋白利用率達23%以上，粗纖維利用率達70%；白春艷[17]混菌發(fā)酵高粱秸稈后濾紙酶活性達到了389.89 U/mL，比單一菌提高了14.30%；劉紀成等[7]對花生秸稈多菌混合固態(tài)發(fā)酵后，粗蛋白含量提高了53.39%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別下降了14.66%和21.53%；侯敏等[18]采用菌酶協(xié)同發(fā)酵棉稈后中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別下降了4.61%、8.01%，纖維素降解率達到了25.62%；石鴻輝等[5]對辣木莖葉粉混菌固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白從19.84%提高到29.29%，植酸的含量從55.15mg/g降低到46.91mg/g。

表6 酶菌協(xié)同發(fā)酵對植酸含量的影響（干物質，mg/g）

圖5 酶菌協(xié)同發(fā)酵對植酸含量的影響

3.2 菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵的優(yōu)勢和必要性

添加菌和酶均可改善飼料發(fā)酵品質。微生物發(fā)酵依靠各種菌所產生的代謝產物在合成酶的作用下來提高飼料的營養(yǎng)價值；酶作為一種具有特殊作用蛋白質，可直接添加到飼料中來降低飼料中的抗營養(yǎng)因子，而且在發(fā)酵過程中可以以一種催化劑的形式優(yōu)化發(fā)酵工藝。本試驗用黑曲霉、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌單菌或混菌與植酸酶對辣木莖稈粉進行固態(tài)發(fā)酵后，測定辣木莖稈粉營養(yǎng)成分和植酸含量的變化。結果表明隨著發(fā)酵時間的延長粗蛋白含量呈上升趨勢，并且從發(fā)酵的結果來看T5、T6、T7、T8組兩菌或三菌和植酸酶協(xié)同發(fā)酵的處理組要明顯的優(yōu)于其他試驗組，這與曾李等[19]的研究結果相似，這是因為混菌組合發(fā)酵時自身不僅可以產生豐富的蛋白酶系，而且自身還可以產生更多的菌體蛋白，從而達到飼料原料中粗蛋白含量的提高。ADF、NDF的含量隨著發(fā)酵時間的延長也不斷的下降，并且T5、T6、T7、T8組效果優(yōu)于其他組，這是因為黑曲霉和枯草芽孢桿菌都能產生大量的纖維素酶，并且當黑曲霉和枯草芽孢桿菌共同和釀酒酵母培養(yǎng)后可以生成更加完整的纖維素酶系統(tǒng)，這一結果與Kalyani等[20]研究結果相似。在所有處理組中植酸的含量隨著發(fā)酵時間的延長都呈下降趨勢，這是因為植酸酶可以催化植物中的植酸[12]，從而降低植酸的含量，在本試驗中兩菌或者三菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵降解植酸時效果更佳，這可能是因為植酸酶與黑曲霉、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母產生的酶系有疊加作用。粗脂肪的含量隨發(fā)酵時間的延長升高，且在發(fā)酵第8 d時T6、T7、T8組要顯著高于CK、T1、T2、T3、T4、T5組；在發(fā)酵第10 d時，T5、T6、T7、T8組顯著高于CK、T2組，和T1、T3、T4組比較，粗脂肪含量也有升高，但差異不顯著。這是因為黑曲霉和枯草芽孢桿菌都能分泌大量的脂肪酶，這也與張熙等[21]、Feng等[22]的研究結果一致。

3.3 菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

在發(fā)酵過程中不同微生物最適宜的生長環(huán)境也是不盡相同的(如接種量、含水量、溫度、pH及發(fā)酵時間等)。菌種接種量直接影響菌種的多項生物學特性，當接種量過大時，菌體生長速度過快，營養(yǎng)物質消耗過快，釋放大量熱量，溫度升高；當接種量過小時，發(fā)酵靜止時間長，感染細菌概率增加，最終影響發(fā)酵品質。水是微生物生長代謝的必需養(yǎng)分，為微生物生長提供營養(yǎng)和代謝的水環(huán)境，含水量過低，不利于菌體的生長、產酶；含水量過高，將增加氧的傳質阻力和雜菌污染的可能性。邱鑫等[23]以溫度、時間相同，用50%、80%、100%不同的含水量的條件下發(fā)酵菜籽餅，結果表明100%含水量效果最佳。每種微生物都有適宜的生長溫度，過高或過低都會影響微生物生長，其次溫度能夠直接影響微生物源蛋白酶和纖維素酶活性，從而影響發(fā)酵效果，微生物發(fā)酵還是一個代謝產熱過程，溫度過高時還會導致發(fā)酵飼料內部產熱過快，熱量聚集，不利于微生物生長。固態(tài)發(fā)酵中，發(fā)酵時間也是一個重要的參數(shù)，發(fā)酵時間過短，微生物不能充分利用碳源生長，微生物代謝不能達到最佳值；發(fā)酵時間過長，菌體易發(fā)生自溶，且易造成雜菌污染。莫重文[24]研究用米曲霉和啤酒酵母混合發(fā)酵豆粕24～84 h，結果表明隨發(fā)酵時間延長，蛋白質含量顯著增加，但是在72 h時增加速度變慢。pH值直接影響菌體細胞膜上的電荷性質，正常細胞質上的電荷有助于營養(yǎng)物質的吸收，當細胞膜上電荷性質受到外界氫離子濃度影響發(fā)生改變時，微生物吸收基質營養(yǎng)物質機能則發(fā)生改變[25]。微生物發(fā)酵是一個復雜的生物反應過程，除受微生物自身的生物學特性影響外，接種量、含水量、溫度、pH及發(fā)酵時間等對發(fā)酵都有很大的影響。

在本試驗中黑曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母按10%添加量（接種為1∶1和1∶1∶1）與植酸酶（添加量為180 U/g）混合添加，70%含水量，30℃恒溫發(fā)酵10 d的發(fā)酵條件下得到在發(fā)酵第8 d時效果最佳。隨著將來研究的深入和發(fā)酵條件的優(yōu)化，還可再縮短發(fā)酵時間，提高生產效益。

4 結論

本試驗從發(fā)酵后辣木莖稈粉營養(yǎng)成分與植酸含量的變化來評價單菌或混菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵的最佳組合和最佳發(fā)酵天數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)兩菌或三菌與植酸酶協(xié)同發(fā)酵時效果優(yōu)于單菌。綜合考慮最佳的組合方式是植酸酶+枯草芽孢桿菌+黑曲霉+釀酒酵母，發(fā)酵時間是8 d。