■任 海 華智杰 靳曉敏 高桂生李明媛 王 旭 鄭佳瑞

（河北科技師范學院，河北秦皇島066600）

由于海水魚類養(yǎng)殖規(guī)模、集約化程度提高以及水環(huán)境污染等因素的影響，魚類病害頻繁發(fā)生，制約了海水魚類規(guī)?；B(yǎng)殖，其中主要以弧菌（Vibrio）引起的疾病最為嚴重，弧菌是海洋環(huán)境中最常見一類條件致病菌。由弧菌引起的疾病在世界各國海水養(yǎng)殖過程均有報道，且給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展帶來巨大的威脅[1-3]。目前國內(nèi)外已經(jīng)報道的弧菌病病原主要有鰻弧菌（V.anguillarum）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）等[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌能夠引起多種魚類發(fā)病，如在花鱸（Lateolabrax japonicus）[5]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[6]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[7]和半滑舌鰨（C.semilaevis）[8]等均有報道，主要癥狀表現(xiàn)為游泳緩慢、體表嚴重潰瘍和眼球突出等，該病原菌已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大障礙。目前養(yǎng)殖者主要利用抗生素作為該細菌性疾病的主要防治藥物，但是抗生素的頻繁使用，不僅使許多病原細菌產(chǎn)生了耐藥性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物產(chǎn)生一定毒害作用，而且抗生素的藥物殘留最終也會影響人類健康。

中草藥是天然藥物，具有成本低、不良作用小、無藥物殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，備受水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛關注，現(xiàn)已成為水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中常見的抑菌藥物[9-10]。目前從中草藥中篩選抗菌藥物越來越受到國內(nèi)外學者的廣泛重視，關于中草藥防治細菌性疾病的相關報道亦屢見不鮮，但是關于中草藥對半滑舌鰨源哈維氏弧菌研究鮮見報道。因此，本試驗通過38種水產(chǎn)常用中草藥對哈維氏弧菌的體外抑殺菌情況進行研究，篩選對哈維氏弧菌具有抑殺作用的中草藥。本研究結(jié)果對防治由哈維氏弧菌引起的水產(chǎn)病害具有一定的參考價值。

1 試驗材料

1.1 試驗菌株

試驗菌株分離于秦皇島某養(yǎng)殖場患病半滑舌鰨，并經(jīng)過形態(tài)特征、理化特點、16S rDNA鑒定為哈維氏弧菌，同時進行該菌的致病性檢測，具體操作為：將健康的半滑舌鰨[體重為（602.6±19.6）g]置于100 L方形玻璃水缸中暫養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和人工感染組，每組3個重復，每個重復5尾魚，將28℃培養(yǎng)24 h的待檢細菌用生理鹽水稀釋并計數(shù)，使菌液終濃度為2×106CFU/mL，其中人工感染組每尾肌肉注射0.3 mL該菌液，對照組注射等量的滅菌生理鹽水，注射12 h后半滑舌鰨出現(xiàn)食欲減退，游泳緩慢等癥狀，72 h出現(xiàn)嚴重皮膚潰瘍和陸續(xù)死亡等現(xiàn)象，與自然發(fā)病死亡癥狀極相似，進一步從病魚病灶處分離純化細菌，經(jīng)過鑒定證實為哈維氏弧菌。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、無水乙醇、96孔酶標板，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；魚腥草、黃芪、甘草、連翹、女貞子、川棘子、訶子、梔子、黃連、黃芩、黃柏、大黃、大青葉、穿心蓮、五倍子、柴胡、車前子、烏梅、白頭翁、石榴皮、紫錐菊、虎杖、地丁草、秦皮、貫眾、苦參、丁香、當歸、赤芍、蘇木、青蒿、淫羊藿、茵陳、益母草、地錦草、何首烏、地榆、郁金等38種中草藥，均購自昌黎縣百草堂藥店。

1.3 主要儀器設備

恒溫振蕩培養(yǎng)箱（型號：BSD-100）、電子萬用爐（型號：DK-98-II）、電子天平（型號：CP224C）、超凈工作臺（型號：ZHJH-C1112B）、高壓滅菌鍋（型號：YXQ-LS-18SI）、電熱鼓風干燥箱（型號：GZX-9076MBE）、電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號：HPX-9082MBE)、全溫振蕩培養(yǎng)箱(型號：BSD-100)。

2 試驗方法

2.1 中草藥藥液的制備

將38種中草藥粉碎后，分別稱取10 g加入到500 mL燒杯中，用純化水浸泡3 h后用電子萬用爐大火煮至沸騰，小火煎1 h，第一次煎煮藥物時需要加入400 mL純化水，然后再用8層紗布過濾，過濾后的藥渣中再加入200 mL的純化水用小火煮1 h，消毒紗布過濾后，將兩次所得藥液混合定容至50 mL，制成200 mg/mL(W/V)的中草藥原藥液[11]，裝瓶高壓滅菌后置于冰箱4℃冷藏備用。

2.2 打孔培養(yǎng)基的制備

將滅菌營養(yǎng)瓊脂放到無菌超凈工作臺內(nèi)，當溫度降到60～70℃時，在平板內(nèi)倒入薄薄的一層培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基上均勻放置5個牛津杯，然后再次倒入培養(yǎng)基，注意不要倒入牛津杯孔中。第二層培養(yǎng)基的高度約占這個平板高度的2/3，等培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，放到4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 菌種的活化

將保存的哈維氏弧菌菌液融化后接種到普通營養(yǎng)瓊脂平板上，將平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，整個過程在無菌超凈工作臺內(nèi)進行。

2.4 菌液的制備

在無菌超凈工作臺上將活化的哈維氏弧菌用滅菌接種環(huán)挑取菌落，使哈維氏弧菌與滅菌生理鹽水混合均勻后制成的菌懸液，與麥氏比濁管對比后使菌液的終濃度達到108CFU/mL。

2.5 抑菌效果測定

使用牛津杯打孔培養(yǎng)基進行體外抑菌效果測定，每種中草藥重復測定3次，取其平均值作為最終抑菌直徑。具體為：首先在無菌超凈工作臺內(nèi)，用消毒棉簽在打孔培養(yǎng)基上均勻涂上菌懸液，然后在每種中草藥的藥液中分別抽取150μL中草藥放到相對應的培養(yǎng)基的孔中，注意不要使藥液溢出孔外。待藥液加完后置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑。敏感性判定標準以抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感（HS）；抑菌圈直徑10～19mm判定為敏感（S）；抑菌圈直徑＜10mm的判定為耐藥（R）；無抑菌圈形成記作0。

2.6 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

利用96孔酶標板，采用菌液涂布法和改良微量二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），具體操作方法參考任海等[11]的方法進行。

3 結(jié)果與分析

3.1 38種中草藥對半滑舌鰨源哈維氏弧菌的抑菌作用（見表1）

表1 38種中草藥對哈維氏弧菌的抑菌圈直徑

由表1可知：五倍子、訶子、烏梅、黃連、石榴皮、蘇木、黃芩、黃柏、連翹9種中草藥對哈維氏弧菌表現(xiàn)為高度敏感，其抑菌圈直徑為22～27 mm。秦皮、丁香、青蒿、地丁、女貞子、甘草、大黃、虎杖、地榆、苦參10種中草藥對哈維氏弧菌較為敏感，其抑菌圈直徑為12～19mm。而紫錐菊、地錦草、茵陳、柴胡、車前子、益母草、何首烏、貫眾、白頭翁、淫羊藿、魚腥草、大青葉、穿心蓮、赤芍、黃芪、川棘子、郁金、當歸、梔子對該菌無抑菌作用，部分中草藥藥敏試驗結(jié)果如圖1所示。

3.2 19種中草藥的MIC和MBC

選取具有抑菌效果的19種中草藥，測定其對半滑舌鰨源哈維氏弧菌的MIC和MBC。由表2可知，五倍子的抑菌和殺菌效果最強，其MIC、MBC分別為1.5 mg/mL和3.1mg/mL；而烏梅、訶子、黃連、石榴皮、蘇木、甘草的抑菌效果較強，其MIC、MBC分別為3.1～12.5mg/mL和6.3～25.0 mg/mL。再有女貞子、地丁、黃柏、秦皮、地榆、青蒿、丁香、苦參、大黃、虎杖、黃芩、連翹也具有抑菌作用，其MIC和MBC分別在12.5～50.0mg/mL和50.0～100.0mg/mL。

圖1 部分中草藥對哈維氏弧菌的抑菌情況

表2 19種中草藥對哈維氏弧菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（mg/mL）

4 討論與分析

近年來，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，由弧菌引起的水產(chǎn)動物疾病時有發(fā)生，其中針對哈維氏弧菌的報道也越來越多。研究發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌能夠感染多種海水養(yǎng)殖動物發(fā)病，如魚、蝦、蟹和貝類等，嚴重阻礙了我國海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[12-18]。目前防治水產(chǎn)細菌性疾病主要依靠各種抗生素，其結(jié)果不僅污染了水體養(yǎng)殖環(huán)境，而且也導致了一些藥殘事件的發(fā)生，比如“孔雀石綠事件”和“多寶魚事件”等對人類健康構(gòu)成了極大的威脅。由于中草藥在水產(chǎn)動物疾病預防和治療過程中無藥物殘留，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，近年來被廣泛用于水產(chǎn)動物細菌性疾病的防治中。王洪彬等[19]在中草藥對哈維氏弧菌體外抑菌試驗的研究中發(fā)現(xiàn)，烏梅、蘇木、黃芩、夏枯草、連翹、女貞子的抑菌效果較好。王玉娥等[20]測定了10種常用中草藥對5種海洋致病弧菌的抑菌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五倍子抑菌效果最強，其次為黃連，這兩種中草藥可作為防治水產(chǎn)動物弧菌病的首選藥物，本次試驗結(jié)果與上述研究者的結(jié)果相似。本試驗通過牛津杯打孔法測定了38種水產(chǎn)常用中草藥對哈維氏弧菌敏感性，試驗結(jié)果表明，五倍子、蘇木、烏梅和黃連等9種中草藥對哈維氏弧菌表現(xiàn)為高度敏感，其抑菌圈直徑為22～27 mm，秦皮、丁香、女貞子和大黃等10種中草藥對哈維氏弧菌也較為敏感，其抑菌圈直徑為12～19 mm，其中抑菌效果最強的為五倍子，其抑菌直徑達27 mm。這與張曉君等[21]研究的20種中草藥對分離于長鰭真鯊的病原菌（哈維氏弧菌）進行了藥物敏感性檢驗結(jié)果中地錦草能夠有效抑制哈維氏弧菌的結(jié)果不一致，分析其原因可能是由于中草藥和供試菌株的來源不同最終導致藥物對其敏感性有差異[22]。

另外，試驗利用微量二倍稀釋法以及液體涂布法測定了具有較好抑菌作用的19種中草藥對半滑舌鰨源哈維氏弧菌的MIC和MBC，試驗結(jié)果顯示：五倍子、烏梅、訶子等9種中草藥的抑菌效果較強，其MIC和MBC分別為1.5～25.0 mg/mL和3.1～50.0 mg/mL。該結(jié)果與張永剛等[23]報道的中草藥對大菱鲆源哈維氏弧菌的體外抑菌效果中五倍子、石榴皮和烏梅等具有很強的抑菌作用結(jié)果相似；本試驗還發(fā)現(xiàn)所選中草藥中抑菌作用最強的是五倍子，其MIC和MBC分別為1.5 mg/mL和3.1 mg/mL。該研究結(jié)果與王玉娥等[20]研究的5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性的測定中五倍子的MIC和MBC均為3.125 mg/mL的結(jié)果較一致，但與張曉君等報道的五倍子對哈維氏弧菌的MIC小于0.195 mg/mL不同[21]，其原因可能與供試菌株的分離源、菌株的毒力大小、中草藥的采集地區(qū)、藥用部位以及炮制方法等有關[11]，但是中草藥抑菌的具體作用機理還有待進一步研究。

5 結(jié)論

本研究測定了38種中草藥對哈維氏弧菌的體外抑菌情況。試驗表明，訶子、五倍子、石榴皮、黃連、蘇木和連翹等對哈維氏弧菌高度敏感，上述中草藥的MIC和MBC范圍為1.5～25.0 mg/mL和3.1～50.0 mg/mL，其中抑菌效果最強的是五倍子，其MIC為1.5 mg/mL，MBC為3.1mg/mL。