HPLC法測(cè)定熟肉制品中山梨酸的不確定度評(píng)估

◎ 龐皓元

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021）

熟肉制品是指以新鮮禽畜肉為原料，經(jīng)醬鹵、腌制、熏烤、蒸煮和干制等一種或多種熱加工方式熟化成可直接食用的肉類加工制品[1-2]，生活中常見的預(yù)包裝食品椒鹽雞翅、黑椒鴨掌、麻辣小魚仔、發(fā)酵肉制品類等都屬于熟肉制品，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。由于肉制品含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)，在加工、儲(chǔ)藏和銷售過程中，都極易受微生物和環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，失去食用價(jià)值，故添加防腐劑是有效延長(zhǎng)肉制品產(chǎn)品保質(zhì)期的有效方式[3-4]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定[5]，熟肉制品中可添加0.075 g·kg-1的山梨酸及其鉀鹽，以延長(zhǎng)熟肉制品的貨架期和保質(zhì)期。山梨酸具有低毒性，安全性較好，能較好地發(fā)揮抑菌作用[4,6]。不確定度是表征合理的賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[7]。由于測(cè)量結(jié)果的不確定度由多種原因引起，故不確定度分為A類不確定度和B類不確定度[7-9]。不確定度數(shù)值的大小反應(yīng)了測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。評(píng)定不確定度能提高分析檢測(cè)質(zhì)量的需要，也是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果互不可缺少的內(nèi)容[7-9]。本文通過《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中山梨酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 500.28—2016）第一法液相色譜法測(cè)定熟肉制品中山梨酸的不確定度，以期為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、能力驗(yàn)證等提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熟肉制品，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院提供的能力驗(yàn)證樣品；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；甲醇（色譜純），德國Merck公司；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量99.99%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度0.3%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸銨（色譜純），德國Merck公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Water 2695高效液相色譜儀（配2998PDA檢測(cè)器），美國waters公司；S180H超聲波發(fā)生器，德國Elma公司；3-30K離心機(jī)，德國Sigma公司；Vortexgenie渦旋混勻器，美國Scientific Industries公司；梅特勒XS205DU電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中山梨酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色譜法測(cè)定肉制品中山梨酸的含量。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)25.01 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度1.000 mg·mL-1）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制。精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL，置于50 mL量瓶中，用水定容至刻度，濃度為100.0 μg·mL-1。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。精密量取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.00 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和7.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用水定容，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線L1～L7，濃度分別為1.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1和75.00 μg·mL-1。

1.3.2 樣品處理

精密稱取樣品粉末置于50 mL比色管中，加3倍蒸餾水?dāng)嚢?5 min混勻，即為復(fù)原樣品。于復(fù)原樣品中加水25 mL，渦旋均勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后加2 mL（92 g·L-1）的亞鐵氰化鉀溶液，再加入2 mL（183 g·L-1）的乙酸鋅溶液渦旋混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析，稀釋倍數(shù)為50倍。

1.3.3 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸銨溶液（5+95)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL；色譜柱：ECHWAY太瑋科技JADE-PAK?ODS-AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.4 不確定度來源分析

1.4.1 不確定度模型

熟肉制品中山梨酸含量的計(jì)算公式如式（1）：

式中：X為熟肉制品中山梨酸的含量，mg·kg-1；C為樣品中山梨酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.2 不確定度來源

從測(cè)定過程和數(shù)學(xué)模型分析，熟肉制品中山梨酸測(cè)定的測(cè)量不確定度來源主要有以下幾個(gè)方面：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度U(標(biāo)純)。②標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度U(標(biāo)稱)。③標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度U(標(biāo)配)。④標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度U(標(biāo)曲擬合)。⑤樣品的質(zhì)量引入的相對(duì)不確定度u(樣稱)。⑥樣品定容體積的不確定度分量U（樣品定容）。⑦樣品測(cè)量重復(fù)性的不確定度分量U(樣品重復(fù))。⑧高效液相色譜儀測(cè)得峰面積的不確定度u（儀器）[11-12]。高效液相色譜法測(cè)定熟肉制品中山梨酸的不確定度來源見圖1。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定熟肉制品中山梨酸的不確定度來源圖

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度U(標(biāo)純)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書中可知，標(biāo)準(zhǔn)含量值為99.99%，標(biāo)準(zhǔn)值的相對(duì)不確定度為±0.3%，

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)不確定度U(標(biāo)稱)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量質(zhì)量山梨酸為25.00 mg，用梅特勒XSE205DU電子天平（d=0.01 mg），電子天平稱量樣品，在稱量程范圍內(nèi)，誤差主要有以下兩方面。

（1）天平示值的不確定度。使用的電子天平依據(jù)《電子天平計(jì)量檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）檢定合格[13]，本次使用梅特勒XSE205DU電子天平（d=0.01 mg），e=10×0.01=0.1 mg，最大允許誤差的絕對(duì)值為MPEV=0.5e=0.5×0.1=0.05 mg，按均勻分布計(jì)算稱量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量時(shí)由天平的最大允許誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）按單次測(cè)量計(jì)，則稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量時(shí)由天平的最大允許誤差引起的相對(duì)不確定度為：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對(duì)不確定度U(標(biāo)配)

由表1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程共使用了25 mL容量瓶（A級(jí)）1個(gè)，50 mL容量瓶（A級(jí)）1個(gè)，10 mL容量瓶（A級(jí)）7個(gè)，使用了3次5.0 mL移液器（分別移取5.00 mL 2次，2.50 mL 1次），1次10.00 mL移液器（移取7.50 mL），1次200 μL移液器（移取100 μL），1次1.00 mL移液器（移取0.25 mL 1次，0.50 mL1次，1.00 mL1次）。

由使用的器皿因定值引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及定容溶劑因溫差產(chǎn)生的體積膨脹引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度詳見表1，可知U（標(biāo)配）為0.059 48。其中，玻璃器皿和移液器體積定值準(zhǔn)確性引入的不確定度以及定容溶劑因溫差（實(shí)驗(yàn)室溫度25 ℃）產(chǎn)生的體積膨脹帶來不確定度均服從均勻分布，包含因子

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度U(標(biāo)曲擬合)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，根據(jù)公式（2）（3）計(jì)算：

式中，SR-標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；n1-樣品溶液的測(cè)量次數(shù)；n2-標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量次數(shù)；cj-樣品濃度均值；c標(biāo)j-第j次測(cè)量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；-標(biāo)準(zhǔn)溶液理論濃度平均值；A標(biāo)j-第j次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所得峰面積；B0標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；B1標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；U（標(biāo)曲）標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；U（標(biāo)曲）-標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，由表2可知U（標(biāo)曲擬合）為0.009 18。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度表

2.5 樣品的質(zhì)量引入的相對(duì)不確定度U(樣稱)

稱取2.00 g 樣品10份，結(jié)果如表2所示，平均值2.089 3 g。使用的梅特勒XS205DU電子天平（d=0.1 mg），檢定分度值e=10d=1 mg，在本次測(cè)量使用的量程范圍內(nèi)，誤差主要有以下3方面。

（1）天平示值的不確定度。使用的梅特勒XS205DU電子天平（d=0.1 mg），根據(jù)檢定證書，當(dāng)0≤m≤50 g時(shí)，天平示值誤差為0.1 mg，按均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）天平稱量重復(fù)性的不確定度。根據(jù)檢定證書，天平重復(fù)性誤差0.2 mg，按均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）樣品稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

樣品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.6 樣品定容體積的不確定度分量U（樣品定容）

定容的不確定度來源于容量瓶允差和溫度效應(yīng)兩個(gè)方面。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度表

（1）量瓶允差的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），50 mLA級(jí)容量瓶的最大允許差為±0.05 mL，服從三角分布，則有：

（2）溫度效應(yīng)的不確定度。實(shí)驗(yàn)室溫度（25 ℃）與容量瓶校正時(shí)的溫度（20 ℃)不相同引起的體積不確定度，水體積膨脹系數(shù)為2.08×10-4mL·℃-1，在95%置信概率下，按矩形分布，屬B類不確定度，因此產(chǎn)生的體積膨脹不確定度照均勻分布計(jì)算為；

則樣品溶液定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.7 樣品測(cè)量重復(fù)性的不確定度分量U(樣品重復(fù))

重復(fù)10次檢測(cè)山梨酸含量，其測(cè)定結(jié)果如表3所示，10份試樣平均含量為52.678 mg·kg-1，所引起的不確定度，主要考慮A類不確定度。根據(jù)JJF 1135—2005的公式（4）～（7）合并計(jì)算，公式如（4）所示：

式中：X-單個(gè)試樣中山梨酸的含量，單位為mg·kg-1；Xi-試樣中山梨酸的含量平均值，單位為mg·kg-1；n1-樣品溶液的測(cè)量次數(shù)，本試驗(yàn)n1=10；n2-單個(gè)樣品檢測(cè)次數(shù)，本試驗(yàn)n2=2。

由式（4）求得U(樣品重復(fù))=0.004 992 75 mg·kg-1。

2.8 高效液相色譜儀測(cè)得峰面積的不確定度U（儀器）

由校準(zhǔn)證書上可知，Waters 2695高效液相色譜儀的定量重復(fù)性為1.8%，按均勻分布計(jì)算，則液相色譜儀的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.9 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

由于各參數(shù)之間相互獨(dú)立，各不確定度分量詳細(xì)情況見表4，故相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表3 10份平行試樣峰面積及含量測(cè)定結(jié)果表

表4 不確定度一覽表

2.10 擴(kuò)展不確定度

選擇95%置信概率，取包含因子k=2，測(cè)量結(jié)果不確定度：U=k×U（合成），取k=2，則U=k×U（合成）=2×3.260＝6.519 mg·kg-1。

2.11 結(jié)果表示

根據(jù)JJF 1135—2005標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，擴(kuò)展不確定度的有效數(shù)字不超過2位，本次肉制品中山梨酸的測(cè)定平均結(jié)果為：52.678 mg·kg-1，測(cè)定結(jié)果表示為：X=（52.678±6.519）mg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

在高效液相色譜法測(cè)量熟肉制品中山梨酸含量的實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)熟肉制品重復(fù)測(cè)定10次，平均含量為52.678 mg·kg-1，其擴(kuò)展不確定度為6.519 mg·kg-1。熟肉制品中山梨酸測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的B類不確定度和儀器定量重復(fù)性引入的A類不確定度。在實(shí)際操作中，應(yīng)盡量減小這兩部分的影響，有效降低結(jié)果的擴(kuò)展不確定度。