嗜麥芽窄食單胞菌的培養(yǎng)基優(yōu)化及其在煙葉發(fā)酵中的初步應(yīng)用研究

黃申，周利峰，呂喬，孫海峰，景天，李石頭，閆茗熠，毛多斌

1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州450001；

2.深圳煙草工業(yè)有限責任公司，廣東 深圳 518109；

3.浙江中煙工業(yè)有限責任公司 技術(shù)中心，浙江 杭州 310024

0 引言

西柏烯類化合物(Cembratrienes)是煙草中重要的大環(huán)二萜類物質(zhì).西柏烯類化合物在自然界中主要存在于新鮮煙葉、煙花的表面腺毛分泌物和海洋珊瑚生物中[1-4].煙葉表面腺毛分泌物隨新鮮煙葉成熟度的增加而增多，當煙葉完全成熟時其質(zhì)量分數(shù)達到最大值，而作為其主要成分的西柏烯類化合物也會逐步累積并達到質(zhì)量分數(shù)最大值.其中，新鮮煙葉中的西柏三烯-4,6-二醇質(zhì)量分數(shù)可達0.7%，同時具有α-CBD和β-CBD兩種差向異構(gòu)體[5-7].西柏三烯-4,6-二醇是一種重要的致香前體物，在一系列加工處理過程中，其發(fā)生氧化降解，生成多種重要的煙氣香氣物質(zhì)，而這些香氣物質(zhì)主要成分是茄酮及其衍生物，能與煙草本香相協(xié)調(diào)，是卷煙香氣成分的重要貢獻者[8-11].另外，西柏三烯-4,6-二醇對卷煙品質(zhì)也有一定影響，據(jù)報道，將西柏三烯-4,6-二醇加入卷煙中，可使吃味更豐滿，提高卷煙的吸食品質(zhì)[12].

然而，國內(nèi)外關(guān)于西柏烯類化合物生物降解的研究較少，僅有利用雷公藤植物、美花煙草植物細胞催化降解西柏三烯-4,6-二醇，使其11位、12位雙鍵被環(huán)氧化，10位、12位和13位雙鍵被羥基化，并無西柏烯開環(huán)類化合物生成[13-17].黃申等[18-20]從初烤后煙葉中篩選到一株新鞘氨醇桿菌，該菌可降解西柏三烯-4,6-二醇生成金合歡醛，但催化效率偏低.

近年來，利用微生物發(fā)酵提升煙葉的可用性及品質(zhì)已逐漸成為煙草行業(yè)的研究熱點.筆者前期從煙葉中篩選到一株嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1)，能以西柏三烯-4,6-二醇為唯一碳源生長，并檢測到中間代謝物金合歡醛[21].本研究擬以該嗜麥芽窄食單胞菌為實驗菌株，通過單因素試驗優(yōu)化其培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，將該菌株制備成菌制劑后初步應(yīng)用于煙葉發(fā)酵，并對比研究發(fā)酵前后煙葉的品質(zhì)，以期為嗜麥芽窄食單胞菌在發(fā)酵煙葉中的應(yīng)用提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonassp.H3-1)，保存于鄭州輕工業(yè)大學煙草行業(yè)生物技術(shù)重點實驗室；云煙87 B2F，產(chǎn)自云南玉溪.

主要試劑：西柏三烯-4,6-二醇標樣(純度99 %)，鄭州輕工業(yè)大學實驗室自制[22-23]；K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaNO3、KNO3、FeSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4、MnSO4、(NH4)2SO4、CaCl2·2H2O、Na2MoO4·2H2O、葡萄糖、蔗糖、乳糖、β-環(huán)糊精、麥芽糖、果糖、胰蛋白胨、尿素、酵母粉，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.

主要儀器：Agilent 6890a/5975c 型GC-MS聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)；J6-MI型冷凍離心機，美國Beckman公司產(chǎn)；2600 UC/VIS型紫外可見分光光度計，美國Unic公司產(chǎn)；KBF240型恒溫恒濕箱，德國 Binder公司產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 主要培養(yǎng)基的配制種子培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 L，pH值為7.

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)：K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.65 g，MnSO40.001 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.1g，Na2MoO4·2H2O 0.005 g，pH值為7，高溫滅菌20 min后加入西柏三烯-4,6-二醇水溶液，配制西柏三烯-4,6-二醇質(zhì)量濃度為0.3 g/L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基.

1.2.2 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線的繪制將嗜麥芽窄食單胞菌接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h.在無菌條件下，配制14份等量的發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%接種種子菌液，以不接種種子菌液的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，于30 ℃、150 r/min條件下進行培養(yǎng).在培養(yǎng)6 h后，每隔6 h取樣1次，72 h后停止取樣.用移液槍取4 mL發(fā)酵菌液，采用紫外可見分光光度計檢測其OD600，以反映菌體生長量；然后立即將剩余的菌液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，用二氯甲烷溶劑萃取西柏三烯-4,6-二醇，采用GC-MS檢測其質(zhì)量分數(shù)，并計算其降解率[18].以培養(yǎng)時間為橫坐標，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600為縱坐標，利用Oringe軟件繪制菌株生長曲線和降解曲線.

1.2.3 單因素試驗1)碳源的選擇.選擇葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、β-環(huán)糊精6種碳源，以不添加碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照.分別在1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 g碳源，分裝后滅菌，在超凈工作臺中，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%接種種子菌液，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h.然后經(jīng)離心、溶劑萃取、GC-MS檢測確定西柏三烯-4,6-二醇的質(zhì)量分數(shù)，計算其降解率，從而選擇最佳碳源.改變最佳碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L 、16.0 g/L)，根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況，確定最佳質(zhì)量濃度.

2)氮源的選擇.在最佳碳源的基礎(chǔ)上，選擇硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、尿素6種氮源，最佳氮源的選擇方法同1).改變最佳氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度(0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L)，根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況，確定最佳質(zhì)量濃度.

3)初始pH值的選擇.pH值對蛋白酶的活性具有一定的影響，因此發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株的生長及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影響.在最佳碳源、氮源的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值(5、6、7、8、9、10)，根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況，確定最佳培養(yǎng)pH值.

4)培養(yǎng)溫度的選擇.溫度對蛋白酶的活性具有一定的影響，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度對菌株的生長及西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定的影響.在最佳pH值的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵液分別置于不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃)的搖床中進行培養(yǎng)，根據(jù)其對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響情況，確定最佳培養(yǎng)溫度.

1.2.4 菌制劑的制備于10 000 r/min條件下，將培養(yǎng)24 h的菌液離心20 min得到菌體，再將其溶于無菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，得到OD600為2.0的細胞懸液，即為菌制劑.

1.2.5 煙葉發(fā)酵實驗1)將菌制劑于35 ℃、pH值為7、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到嗜麥芽窄食單胞菌活化液，待用.

2)將嗜麥芽窄食單胞菌活化液按5.00%、2.50%、1.25%和1.00%的添加量均勻噴灑到回潮后的煙葉樣品(水分含量為15%)上，然后置于恒溫恒濕箱(溫度28 ℃，濕度80%)中進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，每2 d取樣一次.

3)取6 g煙葉樣品剪碎置于250 mL三角瓶中，加入150 mL二氯甲烷，于20 ℃、100 W條件下超聲萃取30 min，用100 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的磷酸酸洗3次，再用100 mL飽和食鹽水水洗，直至pH值為7.經(jīng)減壓濃縮，以2,6-二氯甲苯作為內(nèi)標，利用GC-MS聯(lián)用儀檢測煙葉樣品中的揮發(fā)性香味物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù).GC-MS的檢測條件如下.

GC條件：色譜柱為HP-5 MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；高純He作載氣，流速為1 mL/min；升溫程序設(shè)置為初始溫度50 ℃，停留4 min，然后以2 ℃/min的速率升溫至240 ℃時結(jié)束；不分流進樣，進樣量為1 μL；采用全掃描模式.

MS條件：傳輸線溫度為280 ℃；離子源溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃；電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量為70 eV；溶劑延遲時間為8 min；掃描質(zhì)量范圍(m/z)為35～550 amu.

1.2.6 感官質(zhì)量評吸將菌制劑發(fā)酵前后的煙葉樣品制絲并添加到待評吸的卷煙中，由河南中煙技術(shù)中心組建11人評吸小組，采用對比評吸法進行感官質(zhì)量評吸[24].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線分析

菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線如圖1所示.由圖1可以看出，在0～20 h，嗜麥芽窄食單胞菌生長遲緩，西柏三烯-4,6-二醇的降解率變化不明顯.從20 h開始，嗜麥芽窄食單胞菌進入快速增長期，西柏三烯-4,6-二醇的降解率顯著下降，這主要是因為西柏三烯-4,6-二醇作為碳源開始被菌株大量利用以維持自身的繁殖生長.隨著代謝產(chǎn)物的累積，嗜麥芽窄食單胞菌的生長率與死亡率在培養(yǎng)36 h后達到平衡，表現(xiàn)為其菌株數(shù)量總體不變并保持穩(wěn)定；之后，隨著嗜麥芽窄食單胞菌死亡率的增加，逐步進入衰亡期，西柏三烯-4,6-二醇的降解率基本不再變化.因此，在后期培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，以36 h作為最佳培養(yǎng)周期.

圖1 菌株生長曲線和西柏三烯-4,6-二醇降解曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 碳源碳源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖2所示.由圖2可以看出，在不添加任何外加碳源的情況下，發(fā)酵菌液的OD600只有0.24，表明菌株未達到旺盛生長期，而西柏三烯-4,6-二醇的降解率也只有73.4%.在培養(yǎng)基中添加不同碳源后，西柏三烯-4,6-二醇的降解率表現(xiàn)為：添加麥芽糖時的降解率最高，可達84.0%，明顯優(yōu)于其他碳源，發(fā)酵菌液OD600為0.65，表明菌株達到旺盛生長期；而添加乳糖時的降解率最低，僅為38.2%.故最佳碳源為麥芽糖.

圖2 碳源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖3所示.由圖3可以看出，不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇的降解率有較為明顯的差異.在0～2.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，西柏三烯-4,6-二醇的降解率隨麥芽糖質(zhì)量濃度的增加而增加；在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600達到最高值，分別為85.9%和0.69，表明菌體生長較好；但隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的不斷增加，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均迅速下降，這可能是因為隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的增加，培養(yǎng)基的滲透壓隨之升高，而滲透壓過高會抑制菌體的生長及降解酶的合成.因此，選擇麥芽糖質(zhì)量濃度為2.0 g/L較適宜.

圖3 不同質(zhì)量濃度的麥芽糖對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

2.2.2 氮源氮源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖4所示.由圖4可以看出，在培養(yǎng)基中添加無機氮源時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率明顯高于添加有機氮源時的降解率.其中，當以硫酸銨為氮源時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率最高，達到88.6%，明顯優(yōu)于其他氮源，發(fā)酵菌液OD600為0.73，表明菌株生長旺盛；當以尿素為氮源時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均最低.故最佳氮源為硫酸銨.

圖4 氮源對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

不同質(zhì)量濃度的硫酸銨對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖5所示.由圖5可以看出，在0～2.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，西柏三烯-4,6-二醇的降解率隨硫酸銨質(zhì)量濃度的增加而增加，發(fā)酵菌液OD600總體也呈增加的趨勢；當質(zhì)量濃度大于2.0 g/L時，由于培養(yǎng)基pH值的升高，菌體繁殖加速，導致代謝產(chǎn)物的生成量較少.因此，選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為2.0 g/L較適宜.

圖5 不同質(zhì)量濃度的硫酸銨對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

2.2.3 初始pH值不同初始pH值對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖6所示.由圖6可以看出，當初始pH值為5時，菌體基本不生長，這導致西柏三烯-4,6-二醇的降解率也很低；當初始pH值范圍為5～8時，發(fā)酵菌液OD600隨pH值的升高也逐漸增加，菌體開始旺盛生長，西柏三烯-4,6-二醇的降解率也隨之增加；當初始pH值為8時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率和發(fā)酵菌液OD600均達到最大值，分別為87.0%和0.73；當初始pH值大于8時，培養(yǎng)基的堿性過強，不適合菌株的生長及降解產(chǎn)物的積累，從而導致發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率的下降.因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為8較適宜.

2.2.4 培養(yǎng)溫度不同培養(yǎng)溫度對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響如圖7所示.由圖7可以看出，當培養(yǎng)溫度為 25 ℃ 時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率只有57.6%；隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌體旺盛生長，發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇降解率隨之增加；當培養(yǎng)溫度為40 ℃時，西柏三烯-4,6-二醇降解率達到88.7%，發(fā)酵菌液OD600也最大，為0.73；當培養(yǎng)溫度超過40 ℃時，由于溫度過高，菌株體內(nèi)蛋白酶的活性下降，致使發(fā)酵菌液OD600和西柏三烯-4,6-二醇的降解率均有一定程度的下降.因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度為40 ℃較適宜.

圖7 不同培養(yǎng)溫度對西柏三烯-4,6-二醇降解率和發(fā)酵菌液OD600的影響

2.3 菌制劑發(fā)酵煙葉前后香味成分變化分析

對比發(fā)酵前后煙葉中的香味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)約有15種煙葉香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了明顯變化.經(jīng)過仔細甄別，上述發(fā)生變化的香味物質(zhì)中共有5種確定了分子式，分別為茄酮、5-異丙基-6-甲基-庚-3,5-二烯-2-醇、9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、葉綠醇和2,2′-(1,2-乙二基)雙[6,6-二甲基]-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯.這5種變化明顯的香味物質(zhì)在發(fā)酵前后煙葉中質(zhì)量濃度的變化見表1.由表1可知，葉綠醇的質(zhì)量濃度下降，其他4種香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度增加.其中，對香氣組成影響較大的茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮的質(zhì)量濃度增加較明顯.

表1 5種變化明顯的香味物質(zhì)在發(fā)酵前后煙葉中質(zhì)量濃度的變化

煙葉發(fā)酵過程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的變化見表2.由表2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，西柏三烯-4,6-二醇的降解率逐漸增加，當菌制劑添加量為5.00%時，在發(fā)酵第 4 d，西柏三烯-4,6-二醇的降解率達到80%，在發(fā)酵第8 d達到87%.隨著菌制劑添加量的減少，西柏三烯-4,6-二醇的降解率迅速下降，例如，在添加量為1.00%，發(fā)酵4 d時，西柏三烯-4,6-二醇的降解率為50%.在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵到第6 d時有部分煙葉發(fā)生了霉變及顏色明顯加深，這可能是由于水分含量較大所致.綜上所述,選擇發(fā)酵時間為4 d，菌制劑的添加量為5.00%.

表2 煙葉發(fā)酵過程中西柏三烯-4,6-二醇降解率的變化

2.4 感官質(zhì)量評吸結(jié)果分析

發(fā)酵前后煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果見表3.由表3可知，與發(fā)酵前煙葉相比，菌制劑發(fā)酵后的煙葉總評分提高了1分，其中，在香氣質(zhì)、香氣量及香氣濃度這3個方面的評分提高較明顯，分別提高了0.3分、0.3分和0.4分.這與發(fā)酵后煙葉香味成分中茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮這兩種煙葉中重要香味物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加有關(guān).因此,初步推測可能是由于嗜麥芽窄食單胞菌制成的菌制劑在發(fā)酵煙葉時，將煙葉中的西柏烯類物質(zhì)降解，生成了茄酮類的重要香味物質(zhì)，使發(fā)酵后煙葉的吸味品質(zhì)得到提升.

表3 發(fā)酵前后煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗對嗜麥芽窄食單胞菌的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基中適宜的碳源為質(zhì)量濃度為2.0 g/L的麥芽糖，氮源為質(zhì)量濃度為2.0 g/L的硫酸銨，初始pH值為8，培養(yǎng)溫度為40 ℃.將能高效降解西柏三烯-4,6-二醇的嗜麥芽窄食單胞菌制成菌制劑后用于發(fā)酵煙葉，經(jīng)GC-MS檢測分析發(fā)現(xiàn)煙葉發(fā)酵后有5種香味物質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了明顯變化，其中對香氣組成影響較大的茄酮和9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮的質(zhì)量濃度均有不同程度的增加.將經(jīng)菌制劑發(fā)酵的煙葉制成卷煙進行評吸，發(fā)現(xiàn)總分較發(fā)酵前提高了1分，其中香氣質(zhì)、香氣量和香氣濃度分別提高了0.3分、0.3分和0.4分.

本文利用嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)酵煙葉可提升卷煙的香氣量和香氣質(zhì)，理論上證明了利用微生物發(fā)酵煙葉以提升其品質(zhì)的可行性，并為該類研究奠定了基礎(chǔ).后期擬繼續(xù)優(yōu)化煙葉發(fā)酵參數(shù)及研究發(fā)酵機制，以期縮短發(fā)酵時間，提升發(fā)酵效果，為利用微生物發(fā)酵煙葉的實際應(yīng)用打下基礎(chǔ).