王 音，張喜峰，羅光宏,*

（1.山西師范大學(xué)臨汾學(xué)院自然科學(xué)系，山西臨汾 041000；2.河西學(xué)院，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖 734000）

螺旋藻是一種生活在堿性淡水環(huán)境中單細(xì)胞的藍(lán)藻，富含多種色素，如藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、葉綠素和類胡蘿卜素等[1-2]。β-胡蘿卜素占總含量的67%～79%[3]。類胡蘿卜素的含量相當(dāng)于視黃醇當(dāng)量的53%[4]。β-胡蘿卜素是一種具有生色團(tuán)特征的類胡蘿卜素，在其結(jié)構(gòu)中存在十一個(gè)共軛雙鍵[3]。作為植物、藻類和光合微生物的合成途徑中的重要中間體物質(zhì)[5]，對(duì)癌癥、糖尿病、心血管疾病等具有一定預(yù)防和保護(hù)作用[6-7]。

近年來(lái)，β-胡蘿卜素提取主要采用有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取、加壓流體萃取、雙水相萃取等方法[8-10]；但上述方法存在溶劑用量大、提取時(shí)間長(zhǎng)、提取得率低或設(shè)備昂貴及生產(chǎn)成本高或產(chǎn)生大量高鹽廢水等缺陷。有機(jī)溶劑/糖雙水相體系是采用糖代替鹽與一定量有機(jī)溶劑按照一定濃度混合后，由于糖析作用，從而形成不互溶的兩相體系，利用目標(biāo)物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同形成的一種萃取技術(shù)[11]；該體系采用糖為中性化合物，不會(huì)影響體系pH 和目標(biāo)物質(zhì)活性[12]，已成功應(yīng)用于糠醛、5-羥甲基糠醛（HMF）、阿魏酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、酚類和香蘭素的提取[13-16]。非酶糖基化是指蛋白質(zhì)或氨基酸游離氨基端與糖之間經(jīng)脫水、環(huán)化、氧化和重排等一系列步驟形成的不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs），其與動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默?。ˋD）、衰老等多種疾病有關(guān)[17-18]；目前有關(guān)有機(jī)溶劑/糖雙水相體系萃取螺旋藻β-胡蘿卜素的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，尤其對(duì)抗糖基化能力缺乏基礎(chǔ)研究。

本試驗(yàn)采用超聲波輔助有機(jī)溶劑/糖雙水相體系萃取分離螺旋藻β-胡蘿卜素，在確定有機(jī)溶劑/糖雙水相體系組成基礎(chǔ)上，利用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化螺旋藻β-胡蘿卜素提取條件，并對(duì)其抑制晚期糖基化終產(chǎn)物抑制效果進(jìn)行分析，以期為β-胡蘿卜素資源利用及新型AGES 抑制劑深度開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉 由甘肅凱源生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心提供；正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、乙腈、果糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、氨基胍 上海源葉科技有限公司；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）成都德思特生物技術(shù)有限公司。

PL-203 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DL-820E 智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；DKB-501 數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；OD-5M 立式大容量離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；722 型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；F9700 熒光分光光度計(jì) 北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有機(jī)溶劑/糖體系萃取螺旋藻中β-胡蘿卜素將一定量有機(jī)溶劑、糖和蒸餾水充分混勻后，加入一定量螺旋藻粉末，在一定超聲功率和超聲時(shí)間下進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，靜置一段時(shí)間，量取上相體積，測(cè)定β-胡蘿卜素含量。

1.2.2β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及其含量測(cè)定 準(zhǔn)確配制濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 棕色容量瓶中[8]，以石油醚定容，在450 nm 處測(cè)定其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=3.5482x-0.052，R2=0.994。式中x為450 nm 處測(cè)得的吸光度值，y 為β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

取萃取后有機(jī)溶劑相測(cè)定β-胡蘿卜素吸光值，代入線性回歸方程計(jì)算其濃度，按下式計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

β-胡蘿卜素得率（μg/g）=萃取液中β-胡蘿卜素質(zhì)量（μg）/螺旋藻粉末的質(zhì)量（g）

1.2.3 有機(jī)溶劑/糖體系組成對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 分別稱取不同種類的有機(jī)溶劑（叔丁醇、乙腈、乙酸乙酯、正丁醇）各3.2 g，加入0.05 g螺旋藻粉末，繼續(xù)加入不同種類的單糖或雙糖（果糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖）各2 g，補(bǔ)足蒸餾水至10 g，充分混勻后，在超聲波功率70 W 條件下，超聲處理5 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.4 叔丁醇加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 在叔丁醇/麥芽糖體系中，固定麥芽糖加入量為2 g，螺旋藻粉末0.05 g，分別加入3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 g 叔丁醇，補(bǔ)足蒸餾水至10 g，充分混勻后，在超聲波功率70 W 條件下，超聲處理5 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2 方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.5 麥芽糖加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 在叔丁醇/麥芽糖體系中，固定叔丁醇加入量為3.4 g，螺旋藻粉末0.05 g，分別加入1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 g 麥芽糖，補(bǔ)足蒸餾水至10 g，充分混勻后，在超聲波功率70 W 條件下，超聲處理5 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2 方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.6 螺旋藻粉末加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 在確定叔丁醇/麥芽糖體系基礎(chǔ)上，固定叔丁醇和麥芽糖加入量分別為3.4 和2.4 g，分別加入0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 g 螺旋藻粉末，補(bǔ)足蒸餾水至10 g，充分混勻后，在超聲波功率70 W 條件下，超聲處理5 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2 方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.7 超聲功率對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 固定叔丁醇和麥芽糖加入量分別為3.4 和2.4 g，螺旋藻粉末0.05 g，補(bǔ)足蒸餾水至10 g。充分混勻后，分別在超聲功率為60、70、80、90、100 W 條件下超聲處理5 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.8 超聲時(shí)間對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 超聲時(shí)間對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 固定叔丁醇和麥芽糖加入量分別為3.4 和2.4 g，螺旋藻粉末0.05 g，補(bǔ)足蒸餾水至10 g。充分混勻后，在超聲功率為90 W 條件下，分別超聲處理2、5、8、11、14 min，靜置至分層，量取上層體積，按照1.2.2方法計(jì)算β-胡蘿卜素得率。

1.2.9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在確定叔丁醇/麥芽糖體系組成基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)螺旋藻粉末加入量（A）、超聲功率（B）、和超聲時(shí)間（C）三因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定有機(jī)溶劑/糖體系萃取螺旋藻中β-胡蘿卜素最佳工藝條件，因素水平如表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels

1.2.10 不同提取方法制備β-胡蘿卜比較研究 將正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后最佳萃取條件與超聲輔助提取法、有機(jī)溶劑/鹽雙水相提取法進(jìn)行比較，比較不同提取方法的優(yōu)劣性。

1.2.11 萃取后β-胡蘿卜素抗糖基化能力評(píng)價(jià) 采用賴氨酸-乳糖模擬體系評(píng)價(jià)非酶促反應(yīng)過(guò)程中AGEs 形成情況[19]，取濃度為0.2 mol/L 的賴氨酸溶液和乳糖溶液各1mL，加入1 mLβ-胡蘿卜素叔丁醇溶液（50～450 μg/mL）充分混勻，采用不同濃度的氨基胍（AG）代替β-胡蘿卜素作為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃條件下水浴10 d 后，采用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)440 nm 下測(cè)定不同濃度β-胡蘿卜素對(duì)賴氨酸-乳糖模擬體系中AGEs 抑制效果。按以下公式計(jì)算β-胡蘿卜素對(duì)賴氨酸-乳糖模擬體系A(chǔ)GEs 相對(duì)抑制率。

式中：F樣品為加入樣品提取液且水浴的反應(yīng)液的熒光值；F對(duì)照為不添加樣品但水浴的賴氨酸-乳糖模擬體系的熒光值；F空白為不添加樣品也不水浴的賴氨酸-乳糖模擬體系的熒光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表 示。采用 SPSS 軟件包（SPSS25.0S，Chicago，IL）分析其顯著性和正交試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑/糖雙水相體系組成對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響

2.1.1 有機(jī)溶劑的選擇 四種有機(jī)溶劑與糖組成的萃取體系對(duì)螺旋藻β-胡蘿卜素萃取效果影響如圖1，蔗糖、果糖、乳糖與有機(jī)溶劑形成萃取體系對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果差異不顯著（P＞0.05）；葡萄糖、麥芽糖與有機(jī)溶劑形成萃取體系對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果顯著（P＜0.05），且叔丁醇/麥芽糖組成糖析體系對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果最佳。叔丁醇是一種獨(dú)特的一元醇，可與水互溶，在糖存在的條件下，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，其作為有機(jī)溶劑可溶解非極性物質(zhì)，同時(shí)具有浮選作用，形成三相[20]；麥芽糖對(duì)萃取后β-胡蘿卜素具有一定保護(hù)作用[15]。確定有機(jī)溶劑/糖體系組成為叔丁醇/麥芽糖。

圖1 有機(jī)溶劑/糖體系組成對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.1 Effect of organic solvent/sugar system composition on extraction of β-carotene from Spirulina platensis

2.1.2 叔丁醇加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 由圖2 可知，隨著叔丁醇加入量逐漸增加，叔丁醇/麥芽糖體系對(duì)螺旋藻β-胡蘿卜素萃取得率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定；與叔丁醇加入量為3.2 g相比，當(dāng)叔丁醇加入量為3.4 g 時(shí)，得率達(dá)到最大值，β-胡蘿卜素得率顯著（P＜0.05）高于其他加入量；原因可能是叔丁醇加入量增大后，增加了β-胡蘿卜素在物料和叔丁醇之間的濃度梯度，有利于傳質(zhì)進(jìn)行；當(dāng)叔丁醇加入量超過(guò)3.4 g 后，β-胡蘿卜素得率基本趨于不變（P＞0.05），說(shuō)明螺旋藻中大部分β-胡蘿卜素已被萃取溶出，從經(jīng)濟(jì)成本考慮，確定叔丁醇加入量為3.4 g。

圖2 叔丁醇加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.2 Effect of tert butyl alcohol on the extraction of βcarotene from Spirulina platensis

2.1.3 麥芽糖加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響 由圖3 可知，在叔丁醇/麥芽糖體系中，當(dāng)麥芽糖加入量為2.4 g 時(shí)，該體系對(duì)螺旋藻β-胡蘿卜素萃取得率達(dá)到最大值（2.93 mg/g），顯著（P＜0.05）高于其他加入量；原因可能是隨著麥芽糖加入量逐漸增加，糖與水分子結(jié)合能力較強(qiáng)，使萃取體系中上相部分水分子轉(zhuǎn)移至下相，上相非極性環(huán)境更加有利于β-胡蘿卜素萃取，從而提高了萃取效果；當(dāng)麥芽糖加入量過(guò)大時(shí)，水分子大量轉(zhuǎn)移至下相，導(dǎo)致上相體積減小，萃取不完全[21]；因此，確定麥芽糖加入量為2.4 g。

圖3 麥芽糖加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.3 Effect of maltose addition on extraction of β-carotene from Spirulina platensis

2.2 萃取因素對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響

2.2.1 螺旋藻粉末加入量對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果的影響 物料加入量也是影響有機(jī)溶劑/糖體系萃取效果的因素之一，由圖4 可知，在叔丁醇/麥芽糖體系中，隨著螺旋藻粉末加入量不斷增加，β-胡蘿卜素得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，顯著（P＜0.05）高于其他加入量；原因可能是當(dāng)加入量較小時(shí)，該萃取體系對(duì)β-胡蘿卜素萃取的得率具有顯著（P＜0.05）效果；但是，隨著螺旋藻粉末加入量繼續(xù)增加，該體系萃取量達(dá)到飽和，會(huì)導(dǎo)致其得率下降；因此，確定螺旋藻粉末加入量在0.025～0.075 g 范圍內(nèi)，作為后續(xù)優(yōu)化梯度。

圖4 螺旋藻粉末加入量對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.4 Effect of Spirulina powder addition on the extraction of β-carotene from Spirulina platensis

2.2.2 超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果的影響 超聲功率是影響超聲輔助有機(jī)溶劑/糖體系萃取目標(biāo)產(chǎn)物重要因素之一，由圖5 可知，在超聲功率為60～90 W范圍內(nèi)，該體系對(duì)β-胡蘿卜素萃取得率隨超聲功率增加而增大（P＜0.05），這可能是由于超聲波的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和空穴作用，促使螺旋藻細(xì)胞壁發(fā)生破裂，增加β-胡蘿卜素傳質(zhì)速率，快速進(jìn)入提取溶劑中[22-23]；當(dāng)功率超過(guò)90 W 后，超聲波作用可能導(dǎo)致β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)受到一定程度破壞，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)其它有效成分的溶出，影響其萃取得率。因此，確定超聲功率在80～100 W 范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 超聲功率對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction of β-carotene from Spirulina platensis

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果的影響 由圖6可知，隨著超聲時(shí)間的增加，叔丁醇/麥芽糖體系對(duì)螺旋藻β-胡蘿卜素萃取得率逐漸增加（P＜0.05），根據(jù)Fick 擴(kuò)散定律[24-25]可知，超聲時(shí)間與萃取得率在一定范圍內(nèi)成正比；當(dāng)超聲時(shí)間為8 min 時(shí)，萃取得率達(dá)到最大值，可能是由于時(shí)間延長(zhǎng)后，細(xì)胞破碎完全，促使β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)移至有機(jī)溶劑中；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)伴隨著超聲溫度升高，熱效應(yīng)加劇，影響β-胡蘿卜素穩(wěn)定性，從而影響其得率；因此，超聲時(shí)間為5～11 min 作為后續(xù)優(yōu)化條件。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取效果的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction of β-carotene from Spirulina platensis

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

基于單因素研究結(jié)果，確定萃取體系組成為叔丁醇/麥芽糖，在此基礎(chǔ)上，對(duì)螺旋藻粉末加入量（A）、超聲功率（B）和超聲時(shí)間（C）三因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and result analysis

由表2、表3 可知，C 對(duì)β-胡蘿卜素萃取效果的影響顯著（P＜0.05），A 和B 影響不明顯；三個(gè)因素對(duì)β-胡蘿卜素萃取得率的影響大小順序?yàn)槌晻r(shí)間＞螺旋藻粉末加入量＞超聲功率，此結(jié)果與表2 中極差分析(R)結(jié)果一致；確定最佳萃取條件為A2B2C1，即螺旋藻粉末加入量為0.05 g，超聲功率90 W，超聲時(shí)間5 min，在此條件下，進(jìn)行三組重復(fù)試驗(yàn)，螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取平均得率為3.19±0.089 mg/g。

表3 SPSS 方差分析數(shù)據(jù)表Table 3 SPSS ANOVA data table

2.4 不同提取方法的比較研究

由表4 可知，本試驗(yàn)方法制備的β-胡蘿卜素為3.19 mg/g，與有機(jī)溶劑/鹽雙水相體系制備的β-胡蘿卜素得率相當(dāng)，但該法采用為中性鹽，導(dǎo)致產(chǎn)生高鹽廢水；超聲輔助提取與有機(jī)溶劑提取法對(duì)胡蘿卜素提取得率相對(duì)較低，因此，本試驗(yàn)方法是一種高效制備β-胡蘿卜素方法之一。

表4 不同提取方法比較研究Table 4 Comparative study on different extraction methods

2.5 β-胡蘿卜素對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物抑制效果

天然活性物質(zhì)可有效抑制模擬體系形成的晚期糖基化終產(chǎn)物，圖7 可知，在β-胡蘿卜素濃度為50～450 μg/mL 范圍內(nèi)，AG 和β-胡蘿卜素均對(duì)模擬體系中形成AGEs 抑制率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，最高實(shí)驗(yàn)濃度下的抑制率為47.28%±1.68%，但β-胡蘿卜素抑制效果不如AG 顯著。原因可能是經(jīng)有機(jī)溶劑/糖萃取后，樣品中除主要成分β-胡蘿卜素外，可能會(huì)有部分脂溶性分子的存在，影響其對(duì)AGEs 抑制效果。有待于對(duì)萃取后β-胡蘿卜素進(jìn)一步純化。

圖7 β-胡蘿卜素及陽(yáng)性對(duì)照組AG 在模擬反應(yīng)體系下的糖基化抑制率Fig.7 Glycation inhibition rates of positive control group (AG)and β-carotene in model system

3 結(jié)論

通過(guò)單因素結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲波輔助叔丁醇/麥芽糖體系萃取螺旋藻中β-胡蘿卜素工藝條件，確定影響β-胡蘿卜素萃取因素大小順序?yàn)槌晻r(shí)間＞螺旋藻粉末＞超聲功率；即螺旋藻粉末加入量為0.05 g，超聲功率90 W，超聲時(shí)間5 min，螺旋藻中β-胡蘿卜素萃取得率為3.19±0.089 mg/g。萃取后β-胡蘿卜素對(duì)模擬體系中形成AGEs 具有一定的抑制效果。此法可為天然產(chǎn)物脂溶性小分子活性成分提取提供較好的借鑒作用。