李天柱 崔鳳姬 王文濤 斯日古楞 劉澤宇

摘 要：目的：探討索拉菲尼與ELK-3和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及肝纖維化的關(guān)系及其作用機(jī)制。方法：Western blot檢測(cè)索拉菲尼對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT細(xì)胞模型中EMT標(biāo)志蛋白、ELK-3蛋白表達(dá)以及p38 MAPK蛋白的表達(dá)的影響。Masson′s trichrome染色檢測(cè)索拉菲尼對(duì)肝纖維化動(dòng)物組織中膠原沉積水平以及對(duì)EMT標(biāo)志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：索拉菲尼組處理的EMT組與EMT組相比，E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Vimentin、ELK-3蛋白表達(dá)和p38磷酸化水平均顯著降低（P<0.05）。索拉菲尼灌胃的肝纖維化組與肝纖維化組相比，E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：索拉菲尼通過下調(diào)p38 MAPK/ELK-3抑制肝細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制肝纖維化的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：索拉菲尼;ELK-3;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;肝纖維化;p38

中圖分類號(hào)：R575.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1673-260X（2021）04-0044-03

肝纖維化是肝炎病毒、寄生蟲、酒精、藥物與毒物等致病因子長(zhǎng)期刺激導(dǎo)致的肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積的各種慢性疾病共同的病理變化，影響肝臟的正常生理功能，它可以發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1，2]。近年來(lái)，研究表明受損傷的肝細(xì)胞可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition， EMT）獲得肌成纖維細(xì)胞的表現(xiàn)型產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)肝纖維化[3，4]。

索拉菲尼（sorafenib）是抑制多種癌基因激酶活性的抗癌藥物，是一種新型多靶點(diǎn)的激酶抑制劑。索拉菲尼可以通過受體酪氨酸激酶FLT-3和KIT以及Raf/MEK/ERK信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)索拉菲尼能夠顯著抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞EMT[6]。而且，索拉菲尼通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路減輕肝纖維化的進(jìn)程[7]。

轉(zhuǎn)錄因子ELK-3（又稱Net）是Ras-MAPK信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，在傷口愈合、血管生成和細(xì)胞遷移等過程中起著重要的作用[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT模型中， TGF-β1/p38 MAPK信號(hào)通路通過調(diào)控ELK-3誘導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)行[9]。而且，索拉菲尼通過調(diào)控ELK-3抑制人肝癌細(xì)胞的EMT[10]。但是，在肝纖維化過程中ELK-3與索拉菲尼相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本研究檢測(cè)索拉菲尼對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT細(xì)胞模型中EMT標(biāo)志蛋白、ELK-3蛋白表達(dá)以及p38 MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)的影響，探討索拉菲尼與ELK-3以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系及其作用機(jī)制。同時(shí)，索拉菲尼對(duì)肝纖維化動(dòng)物組織中膠原沉積水平，EMT標(biāo)志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)的影響，探討索拉菲尼對(duì)肝纖維化進(jìn)展的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 耗材和試劑

小鼠正常肝細(xì)胞株AML12細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液和FBS胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）購(gòu)自上海麥克林生化公司;索拉菲尼購(gòu)自德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠，共60只，體重180～200g，購(gòu)自北京維通利華公司。大鼠在濕度60%、溫度（23±2）℃、光照12h/12h明暗交替條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠正常肝細(xì)胞株AML12細(xì)胞復(fù)蘇后，用DMEM/F12培養(yǎng)液（含青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL）加入10%FBS胎牛血清培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3.2 TGF-β1誘導(dǎo)的EMT細(xì)胞模型制備及索拉菲尼處理

FL83B細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，在TGF-β1處理前，F(xiàn)L83B細(xì)胞與含insulin-transferrin-selenium（ITS）的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。然后，用含有3ng/mL TGF-β1、ITS和0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液處理48h，可獲得EMT細(xì)胞模型。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組，正常對(duì)照組、EMT組（不加索拉菲尼）和EMT+索拉菲尼組（加20μmol/L索拉菲尼）。EMT細(xì)胞模型中，處理20μmol/L索拉菲尼，培養(yǎng)48h后，Western blot檢測(cè)ELK-3和EMT相關(guān)分子（上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin）蛋白以及MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)。

1.3.3 肝纖維化動(dòng)物模型制備及索拉菲尼處理

SD大鼠隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組（Control組）、肝纖維化組（CCl4組）和肝纖維化+索拉菲尼組（CCl4+sorafenib組），20只/組。肝纖維化組和肝纖維化+索拉菲尼組大鼠給予皮下注射1.0mg/kg四氯化碳，正常對(duì)照組大鼠給予等體積的橄欖油，2次/周，共持續(xù)8周。肝纖維化+索拉菲尼組從肝纖維化造模后第三周開始每日以索拉菲尼溶液10mg/kg灌胃，連續(xù)20天。Masson's trichrome染色觀察肝組織的膠原沉積水平，Western blot檢測(cè)ELK-3、EMT相關(guān)分子蛋白以及α-SMA蛋白表達(dá)。

1.3.4 蛋白印跡法（Western blot）

利用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣30μg的蛋白質(zhì)，10%SDS-PAGE電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉封閉，E-cadherin抗體（1：1000）、vimentin抗體（1：1000）、α-SMA抗體（1：1000）、ELK-3抗體（1：1000）、p38抗體（1：1000）、p-p38抗體（1：1000）4℃冰箱搖床孵育過夜，HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗（1：1000）37℃孵育1h，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Sigma Plot 2000統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)值均以x±s表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 索拉菲尼對(duì)EMT細(xì)胞模型中EMT標(biāo)志蛋白、ELK-3蛋白表達(dá)和p38磷酸化水平的影響

EMT組與正常對(duì)照組相比，EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Vimentin、ELK-3和p-p38蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。相反，EMT+索拉菲尼組與EMT組相比，EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Vimentin、ELK-3蛋白表達(dá)和p38磷酸化水平均顯著降低（P<0.05）（圖1）。

2.2 肝組織內(nèi)膠原染色面積測(cè)定

肝纖維化+索拉菲尼組膠原染色面積占組織總面積的比例為2.3±0.2%，明顯小于肝纖維化組4.8±0.3%（P<0.05）（圖2和圖3）。

2.3 索拉菲尼對(duì)肝纖維化動(dòng)物組織中EMT標(biāo)志蛋白、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)的影響

肝纖維化組與正常對(duì)照組相比，EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。相反，肝纖維化+索拉菲尼組與肝纖維化組相比，EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）（圖4）。

3 討論

肝纖維化是由于肝組織內(nèi)ECM過度沉積導(dǎo)致的病理生理過程[11，12]。研究表明，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，而且HSC的活化可以轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，是肝纖維化發(fā)生關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。最近研究顯示，肝細(xì)胞可以通過EMT獲得肌成纖維細(xì)胞的表現(xiàn)型產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)行[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞中TGF-β1/p38 MAPK調(diào)控ELK-3可以誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)行[9]。索拉菲尼最早用于治療肝癌的靶向激酶抑制劑，對(duì)肝纖維化是否有作用目前尚無(wú)定論。近年來(lái)學(xué)者認(rèn)為，索拉菲尼能減輕實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蟮母卫w維化進(jìn)程[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，索拉菲尼通過調(diào)控p38 MAPK/ELK-3抑制肝細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及抑制肝纖維化的進(jìn)展。在EMT細(xì)胞模型中，索拉菲尼的處理使E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，Vimentin、ELK-3蛋白表達(dá)和p38磷酸化水平均顯著降低，提示索拉菲尼通過下調(diào)p38 MAPK/ELK-3抑制肝細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在肝纖維化動(dòng)物灌胃索拉菲尼使E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，Vimentin、α-SMA和ELK-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示索拉菲尼通過下調(diào)ELK-3抑制肝纖維化的進(jìn)展。

綜上，索拉菲尼通過下調(diào)p38 MAPK/ELK-3抑制肝細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制肝纖維化的進(jìn)展，為肝纖維化的治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

〔1〕Campana L， Iredale JP. Regression of liver fibrosis[J]. Semin Liver Dis， 2017， 37 （01）：1-10.

〔2〕Trautwein C， Friedman SL， Schuppan D， et al. Hepatic fibrosis： concept to treatment[J]. J Hepatol， 2015， 62：S15-S24.

〔3〕Wu K， Ye C， Lin L， et al. Inhibiting miR-21 attenuates experimental hepatic fibrosis by suppressing both the ERK1 pathway in HSC and hepatocyte EMT[J]. Clin Sci （Lond）， 2016， 130（16）：1469-1480.

〔4〕Kim SM， Choi JE， Hur W， et al. RAR-related orphan receptor gamma （ROR-γ） mediates epithelial-mesenchymal transition of hepatocytes during hepatic fibrosis[J]. J Cell Biochem， 2017， 118（08）：2026-2036.

〔5〕Wilhelm SM， Carter C， Tang L， et al. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis[J]. Cancer Res， 2004， 64：7099-7109.

〔6〕Chen YL， Lv J， Ye XL，et al. Sorafenib inhibits transforming growth factor β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and apoptosis in mouse hepatocytes[J]. Hepatology， 2011， 53（05）：1708-1718.

〔7〕Cheng Yang， Zheng Hang， Wang Biao， et al. Sorafenib and fluvastatin synergistically alleviate hepatic fibrosis via inhibiting the TGFβ1/Smad3 pathway[J]. Dig Liver Dis， 2018， 50（04）：381-388.

〔8〕Buchwalter G，Gross C，Wasylyk B. The ternary complex factor Net regulates cell migration through inhibition of PAI-1 expression[J]. Mol Cell Biol， 2005， 25（24）：10853-10862.

〔9〕Li TZ， Kim SM， Hur W， et al. Elk-3 contributes to the progression of liver fibrosis by regulating the epithelial-mesenchymal transition[J]. Gut Liver， 2017， 11 （01）：102-111.

〔10〕李天柱，崔鳳姬，王文濤，等.索拉菲尼通過調(diào)控ELK-3抑制人肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J]. 赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，33（01）：135-137.

〔11〕Kitto LJ， Henderson NC. Hepatic Stellate Cell Regulation of Liver Regeneration and Repair[J]. Hepatol Commun， 2020， 5（03）：358-370.

〔12〕王肖輝，周霖，杜秋爭(zhēng)，等.五味子甲素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（22）：2725-2730.

〔13〕楊悅杰，黃芬.肝星狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在肝纖維化形成中的作用[J].世界華人消化雜志，2007，15（27）：2885-2890.

〔14〕孫建鷹，黃育梅，李靜，等.索拉非尼抑制大鼠肝纖維化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2014，42（01）：26-29.

〔15〕Ma Z， Liu X， Dong H， et al. Sorafenib and praziquantel synergistically attenuate Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis in mice[J]. Parasitol Res， 2018， 117（09）：2831-2839.

〔16〕Ma R， Chen J， Liang Y， et al. Sorafenib： A potential therapeutic drug for hepatic fibrosis and its outcomes[J]. Biomed Pharmacother， 2017， 88：459-468.