程興滕，尹亞東，張 賽，孫中磊

(1.棗莊礦業(yè)集團(tuán)滕南醫(yī)院，山東 棗莊 277000；2.棗礦集團(tuán)中心醫(yī)院，山東 棗莊 277100；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 腦科研究所，天津 300162)

顱腦創(chuàng)傷(Traumatic brain injury，TBI)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率不斷上升，其引發(fā)的神經(jīng)退行性變機(jī)制多種多樣，例如，彌漫性軸索損傷破壞微管功能，為tau和淀粉樣蛋白病的發(fā)展提供了潛在的環(huán)境。大量的研究表明，tau低聚物與TBI后的神經(jīng)變性和記憶障礙相關(guān)[1-3]。tau低聚物還被證明與突觸功能障礙、變形和隨之而來的慢性神經(jīng)突觸損傷有關(guān)[4]。由于不同類型TBI后腦組織tau低聚物的生化特性及毒性特性仍不清楚，因此對(duì)于研究TBI后的tau低聚物與神經(jīng)變性和記憶障礙對(duì)應(yīng)的聯(lián)系至關(guān)重要。本研究利用小鼠爆炸損傷TBI模型探索和表征單次輕度顱腦創(chuàng)傷(Single mild traumatic brain injury，sTBI)和重復(fù)性輕度顱腦創(chuàng)傷(Repeat mild traumatic brain injury，rTBI)小鼠大腦中的tau低聚物，研究tau低聚物的結(jié)構(gòu)差異和毒性差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 野生型C57BL / 6雄性小鼠32只，6月齡，體重(28±2.5)g，新生24 h內(nèi)C57BL / 6小鼠32只，購買自北京維通利華。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(天津醫(yī)科大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))；硝酸纖維素膜(上海博亞公司，中國)； TOMA1、T22、Tau-5、突觸后標(biāo)記物(PSD95)、突觸前標(biāo)記物(Synaptophysin)、突觸樹突標(biāo)記物(Drebrin)、β-action購自美國abcam公司；重組R40-tau購自美國cayman公司；其余試劑如非特殊說明均由當(dāng)?shù)卦噭┥烫峁?/p>

1.2 動(dòng)物模型及分組 將小鼠置于PVC管中，頭部從一端伸出，使用1%～4%的異氟烷麻醉小鼠后用20 psi沖擊波射向頭部以產(chǎn)生TBI[5-6]。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只： SB-24 h組：?jiǎn)未伪ê?4 h組； SB-3周組：?jiǎn)未伪ê?周組； RB-3周組：反復(fù)爆炸后3周組，是在第1、3、5、7、9和12天完成6次爆炸； sham組：假TBI后3周組，小鼠置于與其他組相同的條件下，但沒有爆炸。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的各時(shí)間點(diǎn)取腦組織，使用tau低聚物特異性T22抗體進(jìn)行快速蛋白脂質(zhì)色譜(FPLC)免疫沉淀分離可溶性tau低聚物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 配制 DMEM 培養(yǎng)液，將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在10% FBS 的DMEM中。將培養(yǎng)箱中的平皿拿出，加入 10 mL 完全 DMEM 培養(yǎng)液，小心不要讓培養(yǎng)液沖掉細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底 80%時(shí)，按1∶3 的比例進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增。海馬神經(jīng)元細(xì)胞提取自新生24 h內(nèi)的小鼠8只。其提取方法如下：小鼠浸泡于濃度為75%的乙醇中消毒，斷頭處死，逐層暴露腦組織，取海馬組織。體式顯微鏡下仔細(xì)剝離附著于海馬組織表面的微小血管，并檢查是否有紅色絮狀組織殘留。將所得海馬組織放入含有800 μL 取材培養(yǎng)基的EP管中，用眼科鑷剪碎成小于1 mm的組織塊。然后向EP管中加入200 μL的2.5%胰酶，在37 ℃消化15 min，然后吸取組織在洗脫培養(yǎng)基里轉(zhuǎn)移3遍，用1 mL移液槍反復(fù)吹打，直至不見明顯的組織塊。然后將EP管放入離心機(jī)，1 000 rpm、5 min，棄上清后加入接種培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，以文獻(xiàn)常用的細(xì)胞量8×104/cm2的密度進(jìn)行接種。接種4 h后全量更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基，后續(xù)每隔3 d半量換液。

1.4 tau低聚物制備 取小鼠大腦，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腦組織都用數(shù)字隨機(jī)編碼后，并從前額葉皮層區(qū)域免疫沉淀獲取tau低聚物。從接受單次和重復(fù)爆炸的大腦中獲得了免疫沉淀的低聚物。根據(jù)寡聚分離物的濃度、分子量和PK消化曲線進(jìn)行選擇。具體如下[7-8]， 30 μL甲苯磺?；罨拿庖叽胖橛?0 μg抗tau低聚物特異性多克隆抗體T22(1.0 mg / mL)包被，并在50 μL 0.1 mol/L硼酸溶液(pH 9.5)中稀釋，以保持珠濃度為20 mg/mL。將珠粒在37 ℃下保持過夜，然后洗滌珠子(0.2 mol/L Tris-HCl，0.1%牛血清白蛋白，pH 8.5)，與100 μL的TBI腦勻漿[磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution ，PBS)混懸物]孵育，在室溫下旋轉(zhuǎn)1 h。然后將珠子用PBS洗滌3遍并用pH 2.8的0.1 mol/L甘氨酸洗脫，在amicrocon離心過濾裝置中離心。在4 ℃下以14 000 g 離心25 min，截取分子量值為25 kDa。將低聚物重懸于無菌PBS中，并使用二辛可寧酸蛋白測(cè)定法測(cè)量蛋白濃度。將樣品再次在amicrocon離心過濾器設(shè)備中(截取25 kDa)在4 ℃下以14 000 g離心25 min，儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆肹7,9]。

1.5 tau低聚物擴(kuò)增 通過將凍干的重組4R-Tau沉淀物以1 mg / mL的濃度溶解在PBS中獲得的重組4R-Tau單體[53]接種TBI腦源性tau寡核苷酸。在室溫下旋轉(zhuǎn)4 h，以1∶100(w/w)的比例制備低聚物-單體混合物。每次接種后，均取等分取樣并立即用于蛋白質(zhì)印跡分析，以確保維持質(zhì)量。

1.6 MTT和乳酸脫氫酶測(cè)定 SH-SY5Y細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞分組為sham組、RB-3周組、SB-24 h組、SB-3周和4R-Tau組，分別用對(duì)應(yīng)的tau低聚物0.5 μmol/L處理24 h。按照試劑說明，使用MTT測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力，使用乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定細(xì)胞毒性。

1.7 分離突觸小體 原代神經(jīng)細(xì)胞分組為sham組、Untreated組、RB-3周組、SB-24 h組、SB-3周和4R-Tau組，用對(duì)應(yīng)的tau低聚物0.5 μmol/L處理24 h。使用Syn-PER試劑按照試劑使用說明書分離包含突觸前、突觸后和樹突標(biāo)記的突觸小體。從新生24 h的C57/B6小鼠24只，分離出完整的海馬組織，并將其與手中的每個(gè)寡聚樣品一起在人工腦脊液中充氣孵育1 h。孵育后，將組織在Syn-PER試劑(1 mL Syn-PER/100 mg組織)以及蛋白酶和磷酸酶抑制劑中勻漿。使用組織研磨器將海馬組織研磨10次，并將懸浮液以1 200 g離心10 min。收集上清液，然后以15 000 g在 4 ℃下離心20 min，隨后將含有所需突觸小體的沉淀重懸于HEPES緩沖的Krebs緩沖液中，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析。

1.8 Western blot分析 每個(gè)樣品10 μg上樣在預(yù)制的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后半干轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將膜用在含0.1%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在室溫下將膜封閉1 h。PBST洗滌后與PBST中的一抗4 ℃孵育過夜： TOMA1(1∶10 000)、T22(1∶10 000)、Tau-5(1∶10 000)、PSD95(1∶10 000)、Synaptophysin(1∶10 000)、Drebrin(1∶10 000)、重組R40-tau (1∶10 000)和β-actin(1∶10 000)。PBST洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h。PBST洗滌使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測(cè)免疫反應(yīng)性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Prism 7.0軟件(GraphPad)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。樣本采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單次和重復(fù)的TBI小鼠大腦tau低聚物的生化特性不同 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種檢測(cè)試劑RB-3周組tau低聚物與sham組相比均表現(xiàn)出明顯差異，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其他組與sham組相比沒有明顯差異(P>0.05，見圖1A，表1)。FPLC色譜圖表明，tau低聚物表現(xiàn)出不同的尺寸分布曲線。SB-24 h、SB-3周和sham組tau低聚物的主峰在75至150 kDa之間，對(duì)應(yīng)于二聚體和三聚體，另外還有一個(gè)小的單體對(duì)應(yīng)峰。RB-3周中的主峰對(duì)應(yīng)于三聚體及以上(150～250 kDa，見圖1B)。

圖1 各組tau低聚物表達(dá)量及FPLC色譜峰值

表1 各組蛋白相對(duì)含量

2.2 RB-3W組tau低聚物毒性最強(qiáng) SH-SY5Y 的MTT、LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham組低聚物相比RB-3周和4R-Tau組顯示出明顯的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡率(P<0.05)，而SB-24 h和SB-3周組與sham組沒有差異(P>0.05，見表2)。tau低聚物分別用T22和TOMA1抗體進(jìn)行了預(yù)孵育，結(jié)果與無抗體孵育組相比與T22 和TOMA1預(yù)孵育后，RB-3周組細(xì)胞生存力均顯著提高(P<0.05)。在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中重復(fù)MTT、LDH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與sham組低聚物相比RB-3周和4R-Tau組顯示出明顯的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡率(P<0.05，見表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)各組tau低聚物毒性檢測(cè)

2.3 sTBI和rTBI誘導(dǎo)功能不同的tau低聚物的形成 與未處理組相比突觸提取物Synaptophysin水平在RB-3周和4R-Tau組降低， PSD95水平在TBI各組均降低， Drebrin水平僅在RB-3周組降低(P<0.05)，而與sham相比，僅RB-3周組可引起PSD95和Drebrin水平的降低(P<0.05，見圖2，表3)。

圖2 PSD95，Synaptophysin，Drebrin和β-actin免疫印跡條帶

表3 各組蛋白相對(duì)含量

3 討論

既往的研究表明，從爆炸后72 h開始，輕度爆炸(小鼠承受沖擊力為20 psi)會(huì)破壞皮質(zhì)的血管完整性和血腦屏障，爆炸還引起皮質(zhì)中星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達(dá)的增加，以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物和tau低聚物水平的增加(對(duì)T22有反應(yīng))[5]。還有研究表明，在爆炸一次后3周和重復(fù)爆炸1個(gè)月后的腦組織分析結(jié)果顯示兩組的磷酸化tau病理學(xué)(AT8)和tau構(gòu)象變化標(biāo)記物(CP13)均顯著增加，在時(shí)間上與sTBI和rTBI誘導(dǎo)的記憶力和認(rèn)知缺陷重疊[5-6]。這種差異性的風(fēng)險(xiǎn)可能歸因于tau蛋白的多態(tài)性。為此，本研究從野生型sTBI和rTBI小鼠大腦中分離tau低聚物，以檢測(cè)其在不同類型TBI后觀察到的神經(jīng)變性差異的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)RB-3周組在不同tau低聚物抗體(tau-5、T22 、TOMA1)檢測(cè)中均表現(xiàn)出明顯差異，而其余各組與sham組相比均未見明顯差異，并且FPLC色譜圖分析表明tau低聚物表現(xiàn)出不同的尺寸分布曲線，RB-3周組峰值與其它各組存在差異。為了進(jìn)一步評(píng)估sTBI和rTBI小鼠腦組織tau低聚物的毒性差異，本研究采用tau低聚物(0.5 mM/L)與SH-SY5Y細(xì)胞和原代神經(jīng)元(來自C57BL / 6野生型小鼠)共培養(yǎng)，結(jié)果表明，RB-3周組tau低聚物毒性最強(qiáng)，為了明確這種毒性作用是tau低聚物介導(dǎo)的，本研究將5種TBI腦源性tau低聚物分別用T22和TOMA1抗體進(jìn)行了預(yù)孵育，結(jié)果RB-3周低聚物與T22 和TOMA1預(yù)孵育后細(xì)胞生存力均顯著提高。這些研究結(jié)果表明，我們所觀察到的細(xì)胞毒性是由tau低聚物介導(dǎo)的。

還有研究表明，腦源性tau低聚物會(huì)影響神經(jīng)元傳遞并損害海馬長期增強(qiáng)記憶[10]。為了分析評(píng)估tau低聚物對(duì)突觸的影響之間的差異，本研究測(cè)量了低聚物中幾種突觸標(biāo)記的水平，標(biāo)記包括PSD95、Synaptophysin和drebrin。研究不同的tau低聚物對(duì)新鮮海馬突觸小體的影響是一種離體測(cè)定，并且是對(duì)tau低聚物功能特性進(jìn)行體內(nèi)研究的最接近方法。本研究結(jié)果首次顯示TBI腦源性tau低聚物會(huì)影響海馬神經(jīng)元突觸小體，即不同損傷類型TBI后tau低聚物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞突觸的影響不同，這些發(fā)現(xiàn)再次支持了這些tau低聚物不同的觀點(diǎn)。

最早在TBI后24h檢測(cè)到tau低聚物，tau在TBI后積聚，是神經(jīng)退行性疾病高度相關(guān)的證據(jù)之一[11]。最近的一項(xiàng)研究報(bào)告說rTBI后3個(gè)月內(nèi)，大腦中tau低聚物的數(shù)量增加[12]。另一項(xiàng)研究比較了人腦中的tau聚集物與慢性顱腦創(chuàng)傷(CTE)和阿爾茨海默癥(AD)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照大腦相比，tau低聚物在診斷為CTE(I～I(xiàn)V期)和AD的大腦中顯著增加，并且CTE IV期和AD的可溶性tau低聚物水平非常相似[3]。此外，在TBI后，還會(huì)出現(xiàn)諸如出血、腦血流變化、腦血管損傷、軸突損傷和神經(jīng)元過度興奮等多種因素與tau釋放、磷酸化、聚集和從大腦清除的減少相關(guān)[13-14]。 總的來說，已經(jīng)確定晚期阿爾茨海默氏病腦中可溶性tau低聚物的水平與記憶力喪失相關(guān)。因此TBI后腦中tau低聚物的升高、擴(kuò)散和長期存在很可能與后來的神經(jīng)變性有關(guān)。本研究調(diào)查了TBI后長達(dá)3周的小鼠大腦中tau低聚物的存在，這些研究結(jié)果補(bǔ)充了上述研究，并支持以下觀念：TBI后的內(nèi)源性tau可能變形、獲得毒性，這很可能與神經(jīng)變性有關(guān)。

總之，本研究證明不同類型的TBI導(dǎo)致形成不同的tau形態(tài)，具有不同的毒性和損傷潛能，可以預(yù)測(cè)TBI后神經(jīng)變性和癡呆的風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了鑒定與tau神經(jīng)退行性相關(guān)的多態(tài)性并開發(fā)針對(duì)每種毒性、低聚、多態(tài)性的不同療法的重要性。這突出了開發(fā)特定的免疫療法干預(yù)方法的重要性，該方法在神經(jīng)變性發(fā)作之前表達(dá)有毒tau低聚物的高特異性和清除潛能。除了這些研究外，研究宿主對(duì)tau低聚物形成的影響也至關(guān)重要。對(duì)于諸如APOE[15]和TREM2[16]等位基因也會(huì)影響tau低聚物，因此有助于確定神經(jīng)變性和晚期癡呆的風(fēng)險(xiǎn)[17]。