張玉娟，張 夢(mèng)，王 晴，張 蓓1,

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，江蘇 徐 州 221000；3.徐州市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221000)

卵巢癌是婦科常見腫瘤，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，患者中85%～90%為上皮性卵巢癌，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)約1/3卵巢癌患者檢測(cè)到NF-1基因突變，NF-1蛋白能夠抑制Ras蛋白活化，而Ras又是卵巢癌的重要參與蛋白[2]。NF-1基因的上游調(diào)控因子是調(diào)控蛋白APOBEC-1，其可以通過精確的介導(dǎo)腫瘤抑制基因的失活，從而參與上皮卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[3]。但是APOBEC-1在上皮性卵巢癌中的作用鮮有報(bào)道。因此本研究初步探討APOBEC-1/NF-1在上皮性卵巢癌中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 A2780、IOSE80細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))、si-APOBEC-1、pcDNA-APOBEC-1由西安擎科提供；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和Western blot試劑盒(久禾生物公司)； DMEM、FBS、胰蛋白酶消化液(HyClone，美國(guó))；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛、0.1%結(jié)晶紫、33%乙酸(科昊公司)；Elisa試劑盒、APOBEC-1/NF-1抗體(Abcam，英國(guó))，Trans-well小室(Corning，美國(guó))。

1.2 患者資料 本研究收集2017年6月至2019年7月在我院進(jìn)行手術(shù)治療卵巢癌患者組織，按照國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)合會(huì)(International federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO)卵巢癌臨床分期分為上皮性卵巢癌患者組織(EOC)50例、低度潛能惡性卵巢腫瘤患者組織(LMO)15例、卵巢良性腫瘤(BOT)患者組織30例及正常對(duì)照組(Normal)卵巢組織40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行放化療、免疫治療或激素治療；所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為卵巢癌，排除其他類型惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者。所有患者治療均以手術(shù)切除為主?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺@得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 免疫組化 樣本進(jìn)行石蠟包埋切片，依次進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗和二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片以及顯微鏡鏡檢拍照。

1.4 Trans-well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 1∶9配制混勻BD膠和培養(yǎng)液，37 ℃孵育5 h，隨后水化基底膜30 min。Trans-well小室細(xì)胞鋪板，上室200 μL無(wú)血清DMEM加入5×104/孔A2780細(xì)胞，下室正常10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)液600 μL。培養(yǎng)48 h后，PBS進(jìn)行3次清洗，每次5分鐘；4%多聚甲醛固定15 min后小室室溫風(fēng)干。隨后0.1%結(jié)晶紫染色15 min后用棉簽擦去上層細(xì)胞，33%乙酸脫色，A570nm讀值分析。

1.5 Trans-well細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) Trans-well小室細(xì)胞鋪板，上室200 μL無(wú)血清DMEM加入5×104/孔A2780細(xì)胞，下室正常10% 胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液600 μL。培養(yǎng)24 h后，其余步驟同1.4。

1.6 qRT-PCR TRIzol和氯仿提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR儀器上機(jī)檢測(cè)APOBEC-1表達(dá)水平。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min；在95 ℃下退化10 s; 在60 ℃下退火20 s并在72 ℃下延伸35 s。2-△△t方法計(jì)算APOBEC-1表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot 調(diào)整細(xì)胞數(shù)5×104/mL，細(xì)胞密度達(dá)70%，收集細(xì)胞，冰上裂解30 mins，4℃離心吸取上清。完成蛋白定量后，計(jì)算上樣量，加上樣緩沖液，100 ℃煮5 min。SDS-PACE電泳進(jìn)行蛋白分離，分離結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVD膜，最后脫脂牛奶封閉后PBS清洗，與一抗孵育過夜，次日再與二抗孵育，PBS清洗，ECL發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光拍照。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔6×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)過夜后將細(xì)胞用si-APOBEC-1、pcDNA-APOBEC-1和相應(yīng)的陰性對(duì)照(si-NC)轉(zhuǎn)染它們，分別是從西安擎科公司購(gòu)買的。將siRNA混合液緩慢加入Lipofectamine 2 000混合液中室溫避光靜置20 min。分別取上述混合液200 μL加入6孔板，37℃、5%CO2轉(zhuǎn)染8 h，更換完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)檢測(cè)試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。簡(jiǎn)而言之，在轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種在6孔板中，融合30%～40%。每次轉(zhuǎn)染使用si-APOBEC-1和si-NC(各20nM)。

1.9 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞同1.8轉(zhuǎn)染成功后96孔板鋪板，設(shè)置時(shí)間點(diǎn)0、12、24、36、48 h，每孔加入20 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育3 h，搖晃15 min。酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)OD值并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 APOBEC-1/NF-1在卵巢癌患者組織中表達(dá) 與Normal組相比，APOBEC-1在EOC中的表達(dá)量與強(qiáng)度均最高，在Normal的相關(guān)表達(dá)則最低，而NF-1表達(dá)與之相反(P<0.05，見圖1)。

圖1 APOBEC-1/NF-1在卵巢癌組織中表達(dá)

2.2 APOBEC-1/NF-1在卵巢癌患者血清中表達(dá) APOBEC-1在EOC中的表達(dá)最高，在Normal中的表達(dá)最低，而NF-1的表達(dá)則相反(P<0.05，見圖2)。

圖2 APOBEC-1/NF-1在各組患者血清中表達(dá)

2.3 EOC組織中APOBEC-1/NF-1表達(dá)與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、卵巢癌分型有關(guān) APOBEC-1/NF-1表達(dá)水平與EOC 患者的年齡、臨床分期和組織學(xué)類型無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.209，0.107，0.801)，而與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.039，0.029，見表2)。

表2 EOC患者中APOBEC-1/NF-1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4 APOBEC-1抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780中NF-1的表達(dá) APOBEC-1在A2780中的表達(dá)顯著高于IOSE80(見圖3A)，與組織檢測(cè)結(jié)果相一致。隨后si-APOBEC-1沉默APOBEC-1在A2780中的表達(dá)，qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)si-APOBEC-1顯著沉默APOBEC-1在A2780中的表達(dá)(見圖3B，D)，而NF-1隨著APOBEC-1表達(dá)的降低而增高(見圖3C，E)。

A：APOBEC-1在A2780細(xì)胞和IOSE80細(xì)胞中的表達(dá)；B：PCR檢測(cè)沉默A2780細(xì)胞中APOBEC-1的表達(dá)；C ：PCR檢測(cè)沉默A2780細(xì)胞中APOBEC-1后NF-1表達(dá)；D：Western bloting檢測(cè)沉默A2780細(xì)胞中APOBEC-1(37KD)的表達(dá)；E：Western bloting檢測(cè)沉默A2780細(xì)胞中APOBEC-1后NF-1(50KD)表達(dá)。

2.5 APOBEC-1促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780的遷移和侵襲能力 隨著APOBEC-1表達(dá)降低，A2780細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱(見圖4)。

圖4 沉默APOBEC-1后A2780細(xì)胞遷移和侵襲能力變化

2.6 APOBEC-1促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖能力 隨著APOBEC-1表達(dá)降低，A2780細(xì)胞增殖能力降低(見圖5)，而隨著APOBEC-1表達(dá)增加，A2780細(xì)胞增殖能力部分挽救。

圖5 沉默APOBEC-1后A2780細(xì)胞增殖能力變化

3 討論

卵巢癌是婦科最常見的腫瘤之一，其死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤之首[4]。全世界每年死亡卵巢癌病例約140,200，其中85%～90%為上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)[5]。由于卵巢癌早期無(wú)明顯癥狀，約80%的患者就診時(shí)已屬晚期[6]，手術(shù)后進(jìn)行化療是目前臨床主要的治療方法，但由于致病機(jī)制不清楚和耐藥等因素，卵巢癌患者5年生存率僅25%～30%左右[1]。因此，闡明卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)于其臨床診斷和治療具有重要意義。

NF-1腫瘤抑制基因突變?cè)诼殉舶┑陌l(fā)生和化療耐藥過程中具有重要作用[1,7]。超過1/3的漿液性卵巢癌患者檢測(cè)出NF-1基因突變[8-9]，NF-1基因突變的卵巢癌組織中Ras 信號(hào)通路持續(xù)激活，可能是卵巢癌發(fā)生的重要因素[3]。APOBEC-1是一個(gè)RNA編輯酶，通過調(diào)控細(xì)胞增殖調(diào)控因子PGE2(Prostaglandin E2)合成參與腫瘤發(fā)生和腺瘤到癌的轉(zhuǎn)變[10-13]。有研究指出APOBEC-1可以特異性編輯NF-1 mRNA，從而調(diào)控NF-1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-16]。但是APOBEC-1/NF-1在上皮性卵巢癌中的報(bào)道幾乎沒有。

不同的方法檢測(cè)APOBEC-1/NF-1在EOC、LMO、BOT和Normal中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)APOBEC-1在EOC中的表達(dá)最高，在BOT的表達(dá)最低，而NF-1表達(dá)與其相反，卵巢癌細(xì)胞惡性程度越高APOBEC-1表達(dá)越高，NF-1越低，這說明APOBEC-1在上皮性卵巢癌中發(fā)揮促癌作用，而NF-1發(fā)揮抑癌作用。同時(shí)ELISA血清檢測(cè)結(jié)果與組織學(xué)檢測(cè)一致，APOBEC-1在EOC中的表達(dá)顯著增高，NF-1表達(dá)明顯降低。隨后發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中APOBEC-1表達(dá)水平與患者病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，而NF-1的水平與患者病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)。最后在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)APOBEC-1在A2780細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，且NF-1隨著APOBEC-1表達(dá)降低而增高，同時(shí)APOBEC-1表達(dá)降低顯著抑制A2780細(xì)胞遷移和侵襲能力。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)APOBEC-1在上皮性卵巢癌患者卵巢組織和細(xì)胞水平均高表達(dá)，APOBEC-1可能通過降低NF-1的表達(dá)參與卵巢的發(fā)生發(fā)展。本研究為卵巢癌的診斷和治療可能提供新的靶點(diǎn)，為下一步研究APOBEC-1相關(guān)信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。