葛曉玉，吳水清，陳仕璽*，孫 超，蔡雅博，鄭樂云

(1.廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門 361102； 2.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

近年來，隨著石斑魚養(yǎng)殖技術的成熟與產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]，雜交育種在石斑魚新品種的育種中具有重要作用[2]。國內(nèi)外學者開展了不同石斑魚品種間雜交，并成功培育了“虎龍雜交斑”[3]和“云龍石斑魚”[4]新品種。赤點石斑魚(Epinephelusakaara)和云紋石斑魚(E.moara)均屬于鱸形目(Perciformes)，魚旨科(Serranidae)，石斑魚亞科(Epinephelinae)，石斑魚屬(Epinephelus)，是重要的海洋經(jīng)濟魚類[5-10]。福建省水產(chǎn)研究所在2013年開展了赤點石斑魚(♀)和云紋石斑魚(♂)雜交的研究，并成功獲得了雜交子一代，俗稱紅云石斑魚(紅云斑)；該雜交育種技術初步證明了赤點石斑魚(♀)與云紋石斑魚(♂)雜交的可行性，且可用于規(guī)?；a(chǎn)，為石斑魚種間雜交經(jīng)濟型利用提供證據(jù)[8]。

魚類染色體核型的研究在魚類雜交育種、親緣關系分析和遺傳變異等方面均具有重要意義。目前，鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)[11-12]、斜帶石斑魚(E.coioides)[13-14]、赤點石斑魚[14]、蜂巢石斑魚(E.merra)[15]、鮭點石斑魚(E.fario)[15]、點帶石斑魚(E.malabaricus)[15]、黑邊石斑魚(E.fasciatus)[15]、云紋石斑魚[16-17]、褐點石斑魚(E.fuscoguttatus)[18]、巨石斑魚(E.tauvina)[19]、七帶石斑魚(E.septemfasciatus)[20]、六帶石斑魚(E.sexfasciatus)[21]、布氏石斑魚(E.bleekeri)[22]和藍身大斑石斑魚(E.tukula)[23]等均已進行了核型報道。隨著石斑魚產(chǎn)業(yè)和雜交育種的發(fā)展，雜交斑在市場中占有巨大的優(yōu)勢，珍珠龍膽石斑魚(E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)[24]、云龍石斑魚(E.moara♀×E.lanceolatus♂)[25]和金虎石斑魚(E.fuscoguttatus♀×E.tukula♂)[26]染色體核型也均已陸續(xù)被報道。紅云石斑魚為新雜交種，還尚未見到有關其染色體核型分析的相關研究。

本研究通過活體注射牛血清白蛋白(BSA)、植物血球凝集素(PHA)和秋水仙素溶液，采用頭腎細胞直接制片法，對紅云石斑魚進行染色體核型分析，掌握種間雜交細胞遺傳學特征，以此為石斑魚雜交新品種選育和種質鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚為福建省水產(chǎn)研究所培育，2017年5月利用雌性赤點石斑魚與雄性云紋石斑魚通過人工授精，獲得雜交子一代受精卵，經(jīng)過人工育苗，共培育雜交石斑魚約5 000尾。2018年隨機選取6尾生長正常的雜交石斑魚(體長17～22 cm，體重180～300 g)進行實驗，雜交子一代的形態(tài)見圖1。

1.2 染色體的制備

參考劉蘇等[23]的方法稍作改動。先對雜交幼魚進行抽血刺激，按照1 mL/100 g對其尾靜脈抽血；按照2 mg/100 g的劑量胸腔注射牛血清白蛋白(BSA)。12 h之后腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，1 mg/100 g。2.5 h之后胸腔注射0.1%秋水仙素(0.1 mL/100 g)，效應時間為3 h。剪鰓放血15 min，取頭腎組織制備細胞懸液，3 500 r/min離心3 min收集沉淀，加入0.075 mol/L KCl低滲溶液沖散沉淀，并低滲40 min，之后加入與低滲溶液等量新配制的冰卡諾氏固定液(4℃，甲醇∶冰醋酸=3∶1)進行預固定10 min，3 500 r/min離心3 min收集沉淀，加入適量的冰卡諾氏固定液進行固定，輕輕打散沉淀，1 000 r/min離心10 min收集沉淀，重復固定步驟2次，最后一次固定時間為12 h，-20℃保存。采用冷滴片法進行制片，將細胞懸液于1 m左右高度滴在冰凍的載玻片上，自然晾干，用10% Giemsa染色液染色30 min，用蒸餾水輕輕沖洗載玻片去掉染料顆粒，用中性樹脂封片之后，在顯微鏡下觀察。

1.3 觀察與統(tǒng)計

染色體制備好后，在顯微鏡下挑選75個染色體形態(tài)清晰、分散良好、著絲點位置明確的中期分裂相細胞，進行觀察、拍攝，統(tǒng)計各分裂相染色體數(shù)目。

1.4 核型分析

選取3個染色體數(shù)目完整、分散良好、形態(tài)清晰的分裂相，利用Photoshop軟件進行圖片處理，對沿邊緣剪下的染色體進行編號；依據(jù)其形態(tài)特征和大小，進行初步配對；隨后分別測量染色體長度，利用Excel軟件對各染色體參數(shù)進行統(tǒng)計整理，計算相對長度、臂比，將配對好的染色體分類、排列其組型。按Levan A等[27]提出的標準(表1)構建染色體核型。

表1 Levan A染色體劃分標準[27]

2 結果與分析

2.1 染色體數(shù)目

對75個紅云石斑魚細胞的染色體中期分裂相(圖2)進行觀察并計數(shù)統(tǒng)計。結果顯示，紅云石斑魚染色體數(shù)目從45～51不等，但是染色體數(shù)目48出現(xiàn)的頻率最高，其頻率為42.7%(表2)，占絕對優(yōu)勢，由此確定紅云石斑魚染色體數(shù)目為48，即2n=48。

表2 紅云石斑魚染色體數(shù)目

2.2 染色體組型

分別統(tǒng)計了3個中期分裂相(圖2)染色體相對長度和臂比(表3)，繪制了紅云石斑魚的染色體組型(圖3)。根據(jù)Levan A的標準，可將紅云石斑魚的48條染色體分為4組，其中中部著絲點染色體(m)和亞中部著絲點染色體(sm)各1對，有2對為亞端部著絲點染色體(st)和20對為端部著絲點染色體(t)。在紅云石斑魚48條染色體中，相對長度最大的為(5.15±0.28)，最小的為(2.84±0.11)。根據(jù)分析可知，紅云石斑魚的染色體核型公式為：2n=48=2m+2sm+4st+40t，NF=56。

表3 紅云石斑魚各染色體相對長度和臂比

3 討論

3.1 石斑魚染色體核型研究概況

至今為止，國內(nèi)外已有29種石斑魚的染色體核型被報道(表4)，這些石斑魚物種的染色體數(shù)目均為2n=48，本文所研究的紅云石斑魚的染色體數(shù)目與此一致?？梢?，2n=48可能是石斑魚屬最基本的染色體核型特征，在石斑魚進化過程中，染色體數(shù)目具有高度保守性，是種間雜交的遺傳基礎[25-26，28]。但這29種已報道的石斑魚的染色體核型具有明顯不同，其中約有14種石斑魚的染色體核型為2n=48t，且這些種類均屬于石斑魚原始類群[25]；另外12種石斑魚和3種雜交石斑魚出現(xiàn)了染色體特化現(xiàn)象，本研究中紅云石斑魚的染色體核型也出現(xiàn)了染色體的特化現(xiàn)象。同一種石斑魚物種，會存在不同學者所得染色體核型組成不同，這可能是由于地理位置不同導致的，也可能是制備染色體的方法差異導致的。例如，蔡巖等[28]報道的海南野生三斑石斑魚(E.trimaculatus)的染色體核型為2n=48，48t，NF=48，而舒琥等[12]報道的廣東野生三斑石斑魚的染色體核型則為2n=48，2sm+2st+44t，NF=50。這可能是由于地理位置不同導致的。

表4 30種石斑魚的核型比較

續(xù)表4

3.2 雜交后代紅云石斑魚與親本核型的比較

紅云石斑魚的親本分別為赤點石斑魚和云紋石斑魚，兩者的核型均已有報道。在對赤點石斑魚的染色體核型研究中，王云新等[14]表明其核型為2n=48=10st+38t，NF=58；而王世峰[29]的研究則表明其核型為2n=48=2sm+8st+38t，NF=50。郭豐等[16]對云紋石斑魚的染色體核型研究中，表明其核型為2n=48=2st+46t，NF=50；而郭明蘭[17]的研究則顯示云紋石斑魚染色體核型為2n=48=4sm+44t，NF=52。出現(xiàn)同一種魚類染色體核型不一致的結果，這可能是由于種群差異體現(xiàn)出的染色體多態(tài)性[17]，也可能是因為不同研究者的實驗操作誤差所造成的差異。

本研究中，雜交子一代紅云石斑魚的染色體核型公式為2n=48=2m+2sm+4st+40t，NF=56，其染色體數(shù)目與2個親本相同，但染色體核型與2個親本具有明顯差異，在雜交子一代中出現(xiàn)了1對中部著絲點染色體(m)，在已報道的親本的染色體中均未出現(xiàn)。雜交子一代中的亞中部著絲點染色體(sm)，亞端部著絲點染色體(st)和端部著絲點染色體(t)在王世峰[29]對赤點石斑魚的染色體核型中均有存在，且中部著絲點染色體(sm)的數(shù)目與其一致。理論上，雜交子一代紅云石斑魚應遺傳父母本各1套染色體，但就所分析出的核型公式而言，雜交子一代染色體卻不能全部在親本中找到原型，其間可能發(fā)生了復雜的染色體變異。因此，關于雜交子一代紅云斑與其2個親本之間的親緣關系還需要使用染色體顯帶和熒光原位雜交技術等其他生物學手段進行更為精確的分析和鑒定。