鄧文靜 張宏意 歐曉華 盧昌華 黃偉展 嚴(yán)寒靜

摘?要：?分析外源性茉莉酸甲酯對廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因JAZ2、MYC2、COI1及倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因PTS、FPPS、SQLE表達的影響，為深入研究茉莉酸甲酯調(diào)控廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及倍半萜合成途徑的分子機制奠定基礎(chǔ)。該文分別用0.10和0.25 mmol·L-1的MeJA噴施廣藿香葉片，于處理后的0、2、6、12、24、48、72 h摘取葉片，運用實時熒光定量PCR對JAZ2、MYC2、COI1、PTS、FPPS、SQLE基因的表達量進行檢測。 結(jié)果表明：0.10和0.25 mmol·L-1的MeJA對廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑JAZ2、MYC2、COI1及倍半萜合成途徑PTS、FPPS、SQLE基因表達均有不同程度的促進作用，其中對JAZ2基因表達影響最顯著。0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理2 h時，JAZ2表達量上調(diào)13.52倍;0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理48 h時，JAZ2表達量上調(diào)19.09倍。JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因JAZ2與倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因FPPS存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。綜上結(jié)果表明MeJA溶液可誘導(dǎo)廣藿香JAZ2、MYC2、COI1、PTS、FPPS、SQLE基因的表達，且不同濃度MeJA對基因表達有著不一樣的影響;JAZ2是JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑里響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的主要基因，其可激活倍半萜合成途徑FPPS基因的協(xié)同表達，進而影響廣藿香醇等倍半萜合成。

關(guān)鍵詞： 廣藿香， 茉莉酸甲酯， JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 倍半萜合成途徑，基因表達

中圖分類號：?Q943

文獻標(biāo)識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0559-08

Abstract：?The effects of exogenous methyl jasmonate （MeJA） on the key genes （PTS， FPPS， SQLE） expressions of Pogostemon cablin for the JA signal transduction and sesquiterpene synthesis pathways were studies. This would establish a foundation of the molecular mechanisms of MeJA in these two pathways. We treated the leaves of patchouli with 0.10 and 0.25 mmol·L-1 MeJA respectively and picked them at 0， 2， 6， 12， 24， 48， 72 h after treatments.?We used qRT-PCR to detect the key genes expression of JAZ2， MYC2， COI1， PTS， FPPS， SQLE. The results were as follows： 0.10 and 0.25 mmol·L-1 MeJA promoted the expression of these genes in different degrees， with the most significant effect on JAZ2. The expression levels of JAZ2 increased 13.52-fold after 2 h at 0.10 mmol·L-1 MeJA treatment and 19.09-fold after 48 h at 0.25 mmol·L-1 MeJA treatment. There was a significant positive correlation between the key gene JAZ2 in JA signal transduction pathway and FPPS in sesquiterpene synthesis pathway. The above results demonstrated that MeJA promoted the expression of JAZ2， MYC2， COI1， PTS， FPPS， SQLE， and different concentrations of MeJA had different effects on gene expression. JAZ2 was the main gene induced by MeJA in JA signal transduction pathway， which can activate the co-expression of FPPS gene in sesquiterpene synthesis pathway， so as to affect the synthesis of sesquiterpene such as patchouli alcohol.

Key words： Pogostemon cablin， methyl jasmonate， JA signal transduction pathways， sesquiterpene synthesis pathways， gene expression

廣藿香（Pogostemon cablin）為唇形科（Lamiaceae）刺蕊草屬（Pogostemon）植物，以干燥地上部分入藥，是我國傳統(tǒng)中藥之一，具有芳香化濕、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功效（國家藥典委員會，2015）。廣藿香中的揮發(fā)油主要為倍半萜類化合物，數(shù)量超過24種，其中以廣藿香醇為主要成分（Deguerry et al.， 2006）。廣藿香醇具有保護胃腸道、抗病原微生物、抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用（Ito et al.， 2016; 徐雯，2017）。近年來，廣藿香被用作藥用提取物、食品添加劑和香料，廣泛應(yīng)用于藥品、食品及日用化妝品行業(yè)。因此，研究廣藿香醇合成的分子機制，從分子水平上調(diào)控廣藿香倍半萜的代謝以提高廣藿香醇含量，具有重要的實際意義。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）是一種新型植物激素，參與植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)和防御反應(yīng)，可有效調(diào)控藥用植物中次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Avanci et al.， 2010）。茉莉酸（jasmonicacid， JA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成的主要途徑之一（Ryan， 1990），由多個基因或蛋白的協(xié)同作用完成。其中茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白（jasmonate ZIM domain-containing protein， JAZ）、冠菌素不敏感蛋白1（coronatine insensitive 1， COI1）、轉(zhuǎn)錄因子MYC2等是JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心模塊，常通過彼此之間的相互作用來調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的合成（Katsir et al.， 2008; Browse， 2009; Chini et al.， 2009）。

倍半萜是藥用植物中常見的有效成分。研究倍半萜合成途徑中關(guān)鍵酶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對調(diào)控?fù)]發(fā)性萜類合成具有重要價值。其中倍半萜合酶基因角鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase， SQLE）位于倍半萜類化合物骨架合成的上游途徑，能促進倍半萜物質(zhì)的合成（王煥，2015）。法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase， FPPS）是合成倍半萜的前體法尼基焦磷酸（FPP）的關(guān)鍵酶。倍半萜合酶（terpene synthase， TPS）如廣藿香醇合酶（patchoulol synthase， PTS）能進一步催化FPP生成廣藿香醇等倍半萜類化合物（Frister et al.， 2015）。

前人研究表明，MeJA可通過JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開啟一系列萜類合成途徑相關(guān)基因的協(xié)同表達，從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響植物的萜類代謝，增加萜類化合物的積累（Xu et al.， 2004; Suttipanta et al.， 2011;何雪瑩，2016）。目前，對MeJA處理廣藿香后JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及倍半萜合成途徑相關(guān)性的研究尚未見報道，而進一步研究其分子機制對提高廣藿香倍半萜類化合物的合成與積累具有重要價值。因此，本實驗用不同濃度MeJA處理廣藿香，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測JAZ2、MYC2、COI1、PTS、FPPS、SQLE基因的表達量，旨在了解MeJA對廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因表達的影響，挖掘受MeJA調(diào)控的基因，為深入研究廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及倍半萜合成途徑的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

選擇廣東省四會市廣藿香植株，將扦插苗移栽至廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院種植10個月，株高約90 cm。經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴(yán)寒靜教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香（Pogostemon cablin）。

1.2 用MeJA處理廣藿香植株

選取長勢相近且良好的廣藿香16株，隨機分為兩組，分別是實驗組和對照組，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。以1 mL無水乙醇為溶劑，配制0.10 mmol·L-1 MeJA溶液，用小噴瓶均勻噴施在廣藿香葉片表面，直至水滴滴落，立即用透明塑料膜將植株覆蓋，1.5 h后移除塑料膜。分別于處理后的0、2、6、12、24、48、72 h摘取葉片，用錫紙包裹放入液氮中速凍0.5 h后，放入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA提取。以1 mL無水乙醇按照同倍數(shù)稀釋后噴施于廣藿香為對照組。

0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理方法同上。

1.3 廣藿香總RNA提取及cDNA第一鏈合成

使用TRI pure Reagent和RNA prep Pure Plant試劑盒，按照說明書提取廣藿香總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，超微量紫外分光光度計UV2450測定其濃度和純度，將RNA放入-80 ℃冰箱保存。從冰箱取出RNA，測定其濃度和純度，計算用于反轉(zhuǎn)錄的RNA量，使用Evo M-MLV RT For PCR試劑盒按說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈。

1.4 基因表達量的測定

根據(jù)本課題組廣藿香轉(zhuǎn)錄組測序得到的JAZ2、MYC2、COI1、SQLE、FPPS基因序列及NCBI公布的PTS基因序列，用CmSuite8軟件設(shè)計qRT-PCR引物（表1）。以18S rRNA為內(nèi)參基因，18S引物同見表1（劉璐等，2016）。

使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒，按照說明書配制20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Premix Pro Taq HS Premix 10 μL，cDNA 1.5 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4μL，RNase free water 7.7 μL。qRT-PCR（Bio-Rad Laboratories，Inc）反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、30 s，1個循環(huán);變性95 ℃、5 s，退火及延伸60 ℃、30 s，40個循環(huán)?？瞻讓φ沼盟鎐DNA模板，每個樣品設(shè)三個技術(shù)重復(fù)，復(fù)孔間Ct值的STD<0.2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量（Livak & Schmittgen， 2001）。ΔCt處理= Ct處理-Ct內(nèi)參（處理）;ΔCt對照 = Ct對照-Ct內(nèi)參（對照）;ΔΔCt=ΔCt處理-ΔCt對照;2-ΔΔCt即基因的相對表達量。運用SPSS分析軟件，用獨立樣本T檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析;用Pearson法對JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和倍半萜合成途徑中的關(guān)鍵基因進行相關(guān)性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 廣藿香總RNA的質(zhì)量檢測

提取的廣藿香總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量。電泳圖顯示18S、28S條帶清晰分明且28S條帶的亮度大致為18S條帶的兩倍（圖1），表明RNA完整性良好;紫外分光光度計檢測結(jié)果顯示，OD260/OD280在1.8～2.1之間，表明RNA純度較高。RNA質(zhì)量較好，滿足后續(xù)實驗需要。

2.2 MeJA處理對廣藿香基因表達量的影響

2.2.1?MeJA對廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因JAZ2、MYC2、COI1表達的影響

JAZ2在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理后2、6、12、24、48、72 h表達變化顯著，其表達量與對照組相比分別上調(diào)13.52、4.54、4.15、9.27、9.10、3.23倍，差異達極顯著和顯著水平;JAZ2在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理后24、48、72 h，其表達量分別上調(diào)9.69、19.09、3.37倍，差異達極顯著和顯著水平（圖2：A）。MYC2在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理后2、6、48、72 h，其表達量與對照組相比分別上調(diào)3.49、2.47、3.23、2.69倍，差異達極顯著水平;MYC2在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理后24、48、72 h，其表達量分別上調(diào)2.18、2.19、2.55倍，差異達顯著水平（圖2：B）。兩種不同濃度MeJA溶液處理后，COI1的表達量變化不大（圖2：C）。由此可知，0.10 mmol·L-1 MeJA溶液可在處理初期促進廣藿香JAZ2和MYC2的表達，而用0.25 mmol·L-1 MeJA溶液誘導(dǎo)后基因響應(yīng)較慢，直到24 h表達量才開始上調(diào)。其中JAZ2表達量上調(diào)最顯著，而對COI1的表達影響不大。

2.2.2 MeJA對廣藿香倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因PTS、FPPS、SQLE表達的影響?SQLE在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理后2、48、72 h表達變化明顯，其表達量與對照組相比分別上調(diào)1.64、2.53、1.76倍，差異達顯著水平;SQLE在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理后2、6 h表達量分別下調(diào)73%、63%，48 h表達量上調(diào)2.37倍，差異達顯著水平（圖2：D）。PTS在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理后6、48、72 h表達變化明顯，其表達量與對照組相比分別上調(diào)2.65、4.81、2.55倍，差異達極顯著和顯著水平;PTS在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理后12、48、72 h，其表達量與對照組相比分別上調(diào)2.67、4.88、2.23倍，差異達極顯著和顯著水平（圖2：E）。FPPS在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理后48、72 h，表達量與對照組相比分別上調(diào)2.53、1.86倍，差異達顯著水平;FPPS在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理后48 h，表達量與對照組相比上調(diào)2.20倍，差異達顯著水平（圖2：F）。由此可知，在0.10 mmol·L-1 MeJA溶液處理初期，SQLE表達量上調(diào)，而在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液處理初期，SQLE表達量則下降。PTS和FPPS均在MeJA溶液處理后的48 h上調(diào)表達明顯。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 0.10 mmol·L-1 MeJA處理后廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因表達的相關(guān)性分析?從表2可以看出，0.10 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)后，PTS與SQLE、FPPS與SQLE、PTS與FPPS均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.3.2 0.25 mmol·L-1 MeJA處理后廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因表達的相關(guān)性分析?從表3可以看出，0.25 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)后，PTS與SQLE、FPPS與SQLE、PTS與FPPS均存在顯著正相關(guān)關(guān)系;JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因JAZ2與倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因FPPS存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r達到0.914。

3?討論與結(jié)論

在植物中，茉莉酸甲酯的作用與植物激素發(fā)揮的作用相似，可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有效調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)以及代謝產(chǎn)物 （Devoto &Turner， 2003; 蔣科技等，2010）。通過研究植物JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和倍半萜合成途徑，挖掘受MeJA調(diào)控的基因是進一步研究兩個途徑分子機制的關(guān)鍵。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.10和0.25 mmol·L-1的MeJA噴施廣藿香，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的JAZ2、MYC2、COI1及倍半萜合成途徑的PTS、FPPS、SQLE基因表達量均有不同程度的上調(diào)，其中JAZ2表達量上調(diào)極顯著。這與已報道的丹參JAZs基因（裴天林，2019）、丹參SmMYC2基因（周陽云，2015）、青蒿JAZ和COI1基因（陳俞裴，2017）、廣藿香FPPS基因（Tang et al.， 2019）、菊花TPS基因（王威姣，2020）經(jīng)MeJA處理后上調(diào)表達的結(jié)果類似。本研究結(jié)果表明廣藿香JAZ2、MYC2、COI1、PTS、FPPS、SQLE基因在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)了MeJA的誘導(dǎo)，關(guān)于進一步的響應(yīng)調(diào)節(jié)機制仍需深入研究。

不同濃度MeJA的應(yīng)用對基因表達量和表達趨勢的影響是不一樣。本研究中，0.10 mmol·L-1MeJA溶液可在處理初期促進廣藿香JAZ2、MYC2和SQLE的表達，而在0.25 mmol·L-1 MeJA溶液誘導(dǎo)初期，基因表達量沒有明顯上調(diào)，甚至出現(xiàn)抑制基因表達的現(xiàn)象。梁曉薇等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，0.02和0.05 mmol·L-1的低濃度MeJA在處理初期能促進甘草酸相關(guān)合成途徑酶基因表達，但較高濃度的MeJA（0.10 mmol·L-1）在處理初期沒有誘導(dǎo)相關(guān)基因表達。筆者推測MeJA濃度過高會抑制基因的表達，隨著處理時間的延長，植物體內(nèi)MeJA降解到合適的濃度，進而促進基因的表達。MeJA濃度的高低是一個相對值，不同植物不同品種或者是同種植物的不同基因都有著不同的適宜誘導(dǎo)濃度。

用Pearson法分析廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與倍半萜合成途徑關(guān)鍵基因的相關(guān)性，可知0.25 mmol·L-1 MeJA溶液誘導(dǎo)后，廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑JAZ2與倍半萜合成途徑FPPS基因存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r高達0.914，推測外源性茉莉酸甲酯可通過廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑JAZ2基因激活倍半萜合成途徑FPPS基因的協(xié)同表達，進而調(diào)控廣藿香倍半萜類合成，這與前人研究發(fā)現(xiàn)MeJA可通過JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開啟一系列萜類合成途徑相關(guān)基因的協(xié)同表達，從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響植物的萜類合成的結(jié)果相符（Xu et al.， 2004; Suttipanta et al.， 2011; 何雪瑩，2016）;而低濃度MeJA溶液誘導(dǎo)后，兩個途徑關(guān)鍵基因間不存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。由于植物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜性，推測只有當(dāng)MeJA溶液達到一定濃度時，廣藿香JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因才能開啟倍半萜合成途徑相關(guān)基因的協(xié)同表達。此外，0.10 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)后，倍半萜類合成骨架的上游基因SQLE與廣藿香醇合成途徑的下游基因PTS、FPPS存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系，且0.25 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)也具有類似的正向調(diào)節(jié)效果，推測MeJA誘導(dǎo)后倍半萜類合成骨架的上游基因能夠影響廣藿香醇合成途徑下游基因的表達。下游基因PTS和FPPS在兩種濃度MeJA誘導(dǎo)下分別存在極顯著和顯著正相關(guān)關(guān)系，表達量均在48 h達到最大值，F(xiàn)PPS能夠催化異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）生成法尼基焦磷酸（FPP）等前體物質(zhì)，而PTS則可以催化FPP生成廣藿香醇等倍半萜類化合物（Frister et al.， 2015），推測MeJA誘導(dǎo)48 h后廣藿香醇含量會有一定程度的增加。

經(jīng)外源MeJA處理后，基因表達量在一定時間內(nèi)上調(diào)，隨著時間的延長會逐漸下調(diào)至處理前水平（魏潔書等，2013;梁曉薇等，2017）。本研究中，用兩種濃度MeJA溶液處理廣藿香，JAZ2、SQLE、PTS、FPPS基因表達量均在48 h達到最大值，MYC2和COI1基因表達量分別在2 h和12 h達到最大值，但72 h時各個基因的表達均呈現(xiàn)逐漸回落的趨勢，說明基因表達受MeJA的調(diào)控是激發(fā)式的，隨著時間的延長最終會恢復(fù)至正常水平。綜上所述，MeJA溶液可誘導(dǎo)廣藿香JAZ2、MYC2、COI1、PTS、FPPS、SQLE基因的表達，且不同濃度MeJA對基因表達有著不一樣的影響;JAZ2是JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑里響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的主要基因，其可激活倍半萜合成途徑FPPS基因的協(xié)同表達，進而影響廣藿香醇等倍半萜合成。

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（責(zé)任編輯?何永艷）