黃麗麗，陳嬋嬋，汪佳兵，張佳楓，吳建章

1.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 藥劑科，浙江 寧波 315040；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)研究中心，浙江 溫州 325035；3.臺(tái)州市立醫(yī)院 臺(tái)州學(xué)院附屬市立醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000

氧化應(yīng)激與心血管疾病、腦缺血、癌癥和衰老等多種病理過(guò)程密切相關(guān)，過(guò)量產(chǎn)生的自由基在這些病理生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1-4]。自由基的持續(xù)產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化促使細(xì)胞形成了強(qiáng)大而復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，可清除已存在的活性氧所引發(fā)的連鎖反應(yīng)。同時(shí)，體外抗氧化劑的補(bǔ)充也極為重要[5]。查爾酮類似物屬于黃酮類化合物[6]，廣泛存在于水果蔬菜和天然藥物中，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[7]。近年來(lái)的研究表明合成的查爾酮類似物一般也具有天然查爾酮高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。但目前有關(guān)抗氧化活性查爾酮類化合物的報(bào)道主要是天然查爾酮，鮮少有抗氧化活性的合成查爾酮類似物的研究報(bào)道。

研究表明具有多羥基的抗氧化劑具有較好的生物活性[8]。本研究通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)，合成一系列含羥基或不含羥基的查爾酮類似物，檢測(cè)其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，為得到高效低毒的抗氧化候選藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 H2O2（上海國(guó)藥化工公司），DMSO（廣州四佳生物科技公司），DPPH和槲皮素（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化（PC12）細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所），DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（FBS，美國(guó)HyClone公司），Bcl-2抗體（3498，1:300）、Bax抗體（5023S，1:1 000）、cleavedcaspase-3抗體（9664，1:1 000） 和山羊抗兔IgG二抗（7074，1:3 000）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH抗體（sc-47724，1:1 000，美國(guó)Santa Cruz公司）；MDA酶聯(lián)免疫試劑盒和Hoechst染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），MTT和其他化學(xué)品（美國(guó)Sigma公司）。所用試劑均為分析純。薄層和柱層析用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 查爾酮類似物的合成：以不同取代苯乙酮和芳醛為原料，通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)合成了16個(gè)查爾酮類似物。在極性溶劑中，以HCl為催化劑，室溫下合成了含羥基的查爾酮；在5～8 ℃的NaOH條件下合成了不含羥基的查爾酮。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，得到沉淀物或向混合物中加水沉淀產(chǎn)物。純化后化合物產(chǎn)率為20%～95%。其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜（ESI-MS）和核磁共振氫譜（1H-NMR）確證。

1.2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)：DPPH粉末用無(wú)水乙醇溶解，配置成母液（7.5×104μmol/L）于4 ℃下避光保存，使用前用無(wú)水乙醇稀釋到150 μmol/L。 將化合物用DMSO溶解，配置成初始濃度為1.0× 104mg/L，于4 ℃下避光保存，使用前用無(wú)水乙醇稀釋到20 mg/L。在96孔板上將80 μL（20 mg/L）的化合物加入120 μL的DPPH（150 μmol/L）乙醇溶液中（記為樣品組A）。對(duì)照組B為80 μL（20 mg/L）化合物與120 μL乙醇混合，空白組C為80 μL乙醇與120 μL（150 μmol/L）DPPH溶液混合?；靹蚧旌衔?，于室溫下放置30 min后，在酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（OD）。根據(jù)下列公式將OD值換算為DPPH自由基清除率：DPPH清除率（%）=[1-（A樣品- B對(duì)照）/C空白]×100。每個(gè)化合物每次測(cè)定3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。IC50值為清除50% DPPH自由基的化合物濃度。

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)：將PC12以3 000個(gè)/孔接種于96孔板，在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜。每孔加入不同的查爾酮類似物孵育1 h，再給予H2O2（600 μmol/L）刺激一定時(shí)間，最后加入MTT（5 mg/mL） 20 μL放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將完整細(xì)胞中形成的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜溶解于DMSO中，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)其OD值。細(xì)胞生存率（%）= （OD處理組/OD對(duì)照組）×100%。DMSO組的生存率為100%。設(shè)置對(duì)照組（DMSO組）、模型組（H2O2組）和給藥組，其中槲皮素組為陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4 化合物細(xì)胞毒性檢測(cè)：將PC12以3 000個(gè)/孔 接種于96孔板，貼壁后每孔加入查爾酮類似物孵育24 h，MTT法測(cè)定OD值。4 h后溶解于DMSO中，在 490 nm處測(cè)其OD值。生存率（%）=（OD處理組/OD對(duì)照組）× 100%。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.5 脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)：將PC12細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、給藥組。給藥組中加入藥物孵育24 h，對(duì)照組則在同一時(shí)間加入同等體積的DMSO溶液，以排除溶劑DMSO的影響。之后在給藥組和模型組中給予H2O2刺激24 h。用預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞后收集，測(cè)定蛋白濃度，按照MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MDA水平的測(cè)定。

1.2.6 Hoechst染色：將PC12細(xì)胞（3×104個(gè)/孔） 接種于6孔板后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，用化合物13（1或5 μmol/L）和槲皮素（5 μmol/L） 預(yù)處理1 h，再用H2O2（600 μmol/L）刺激24 h，然后用固定液固定15 min，PBS洗滌2次。加入熒光染料Hoechst 33258染色5 min。用PBS洗滌2次后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot：PC12細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的化合物13和槲皮素孵育24 h，再用H2O2（600 μmol/L）刺激24 h；然后用PBS洗滌3次，用預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞后收集， 12 000×g離心10 min。用BCA蛋白分析試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用脫脂牛奶封閉2 h，然后與抗體cleaved-caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:300）、Bax（1:1 000）或GAPDH（1:1 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后，在室溫下用HRP標(biāo)記的二抗（1:3 000）孵育1 h。最后用Image J軟件檢測(cè)靶蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graphpad prism 5進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 查爾酮類似物的合成 采用HCl或NaOH作為催化劑，在乙醇或甲醇等極性溶劑中通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)，合成16個(gè)查爾酮類似物（見(jiàn)圖1和表1）。通過(guò)重結(jié)晶或柱層析純化，通過(guò)TLC檢測(cè)和熔點(diǎn)測(cè)定來(lái)檢驗(yàn)純度，通過(guò)ESI-MS和1H-NMR進(jìn)行構(gòu)像表征。

表1 查爾酮類似物的結(jié)構(gòu)

圖1 查爾酮類似物的合成路線

化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和16的化學(xué)信息可在文獻(xiàn)[9-16]中獲得。其中，化合物12、13、14和15是新型的查爾酮類似物，其1H-NMR和ESI-MS數(shù)據(jù)如下：

（E）-3-（2-氯苯基）-1-（3，5-二氟苯基）丙-2-烯-1-酮（12）：白色粉末，產(chǎn)率35.22%，mp 91.2～94.5 ℃。1H-NMR（CDCl3）δ：8.132（d，J=15.6 Hz，1H，H-β），7.733（d，J=9.6 Hz，1H，H-6），7.5～7.531 （m，2H，H-2’，H-6’），7.490（d，J=15.6 Hz，1H，H-α），7.431（d，J=9 Hz，1H，H-3），7.307（m，1H，H-5），7.302（m，1H，H-4），7.028（tt，J=2.4 Hz，8.4 Hz，H-4’）。ESI-MS m/z：279.0（M+H）+，calcd for C15H9ClF2O：278.03。

（E）-1-（3，5-二氟苯基）-3-（3，4-二羥苯基）丙-2-烯-1-酮（13）：黃色粉末，產(chǎn)率46.57%，mp 240.2 ℃ Decompose。1H-NMR（Acetone-d6）δ：7.729～7.764（m，3H，H-β，H-2’，H-6’），7.672（d，J=15.6 Hz，1H，H-α），7.379（d，J=1.8 Hz，1H，H-2），7.305（tt，J=2.4 Hz，8.4 Hz，1H，H-4’），7.251（dd，J=1.8 Hz，7.8 Hz，1H，H-6），6.912（d，J=7.8 Hz，1H，H-5）。ESI-MS m/z：277.1（M+H）+，calcd for C15H10F2O3：276.23。

（E）-3-（3，4-二氟苯基）-1-（3，5-二氟苯基）丙-2-烯-1-酮（14）：白色粉末，產(chǎn)率37.24%，mp 178.4～187.0 ℃。1H-NMR（CDCl3）δ：7.694（d，J=15.6 Hz，1H，H-β），7.456（d，J=15.6 Hz，1H，H-α），6.833～6.820（dd，J=1.8 Hz，7.8 Hz，2H，H-2’，H-6’），6.601～6.565（tt，J=2.4 Hz，8.4 Hz，1H，H-4’），7.468（d，J=8.4 Hz，1H，H-6），7.354（brs，1H，H-2），7.183～7.227（m，1H，H-5）。ESI-MS m/z：281.1（M+H）+，calcd for C15H8F4O：280.05。

（E）-1-（3，5-二氟苯基）-3-（3，4，5-三甲氧基苯基）丙-2-烯-1-酮（15）：白色粉末，產(chǎn)率64.53%，mp 194.7～195.8 ℃。1H-NMR（Acetone-d6）δ：7.264（d，J=15.6 Hz，1H，H-β），7.038（d，J=15.6 Hz， 1H，H-α），6.858（tt，J=2.4 Hz，5.4 Hz，1H，H-4’），6.768（m，2H，H-2’，H-6’），6.280（d，J= 5.4 Hz，2H，H-2，H-6），3.738（s，3H，4-OCH3），3.611（m，6H，3-OCH3，5-OCH3）。ESI-MS m/z：335.2（M+H）+， calcd for C18H16F2O4：334.31。

2.2 查爾酮類似物體外抗氧化活性 采用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)測(cè)定查爾酮類似物的抗氧化活性。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)上含有3，4-二羥基取代的化合物6、8和10均表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除活性（≥90%），而只有一個(gè)羥基取代的化合物（化合物3）或沒(méi)有羥基取代的化合物（化合物7和11）則表現(xiàn)出較低的DPPH自由基清除活性[9]。在此研究的查爾酮類似物（1、2、4、5、9、12、13、14、15和16）的DPPH清除實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)具有3，4-二羥基的查爾酮類似物2和13具有優(yōu)異的DPPH清除活性，IC50分別為4.59±0.24和11.11±0.19。見(jiàn)圖2。

圖2 查爾酮類似物（20 mg/L）的DPPH自由基清除活性

2.3 查爾酮類似物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 采用MTT法檢測(cè)了16個(gè)查爾酮類似物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。經(jīng)查閱文獻(xiàn)和前期工作基礎(chǔ)，選擇10 μmol/L濃度進(jìn)行活性和毒性研究。其中DMSO為空白對(duì)照，槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照。相對(duì)于DMSO組，H2O2組細(xì)胞生存率降至60.38%（P＜0.05），而3，4-二羥基查爾酮（化合物2、4、6、8、10和13）預(yù)處理后，細(xì)胞存活率均在75%以上，其中化合物13的活性最強(qiáng)，見(jiàn)圖3A。再通過(guò)MTT法檢測(cè)活性化合物對(duì)PC12細(xì)胞的毒性，相對(duì)于DMSO組，6個(gè)活性化合物作用24 h后，對(duì)PC12細(xì)胞的增殖均無(wú)抑制作用。因此，這6個(gè)活性查爾酮類似物對(duì)PC12細(xì)胞均不表現(xiàn)毒性，見(jiàn)圖3B。

圖3 細(xì)胞活力分析

2.4 活性化合物13呈劑量依賴性地抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞凋亡 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選出高效低毒的化合物13進(jìn)行下一步的研究。細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn)顯示，與DMSO組相比，H2O2組細(xì)胞生存率降低明顯（P＜0.05）；化合物13在1～10 μmol/L的濃度范圍內(nèi)明顯提高H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞生存率（P＜0.05），且呈劑量依賴性（見(jiàn)圖4A）。脂質(zhì)過(guò)氧化是生物體內(nèi)氧中毒的重要標(biāo)志[17]。與DMSO組相比，H2O2處理PC12細(xì)胞后MDA水平明顯升高（P＜0.05）；與H2O2組相比，化合物13（5或 10 μmol/L）預(yù)處理1 h后，均明顯抑制MDA的產(chǎn)生 （P＜0.05），見(jiàn)圖4B。通過(guò)Hoechst染色檢測(cè)了化合物13對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。與H2O2組相比，13（1或5 μmol/L）預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后H2O2刺激24 h，明顯改善PC12細(xì)胞核皺縮的現(xiàn)象。見(jiàn)圖5。

圖4 化合物13對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

圖5 化合物13抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

2.5 化合物13對(duì)cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的調(diào)節(jié)作用 化合物13預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，再用H2O2刺激24 h，隨后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cleavedcaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平。與DMSO組比，H2O2組cleaved-caspase-3蛋白和Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。與H2O2組比，化合物13（5和10 μmol/L）處理后均顯著抑制cleaved-caspase-3蛋白和Bax蛋白表達(dá) （P＜0.05），化合物13在10 μmol/L濃度下促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 化合物13對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

各種刺激誘導(dǎo)ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，繼而破壞細(xì)胞的正常功能，降低多種酶的活性，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等的損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。研究人員致力于抗氧化藥物，如蘿卜硫醚、二硫雜硫酮和依達(dá)拉奉等的研究[19-21]。依達(dá)拉奉是一種有效的自由基清除劑，被批準(zhǔn)用于治療急性卒中患者[21]。為發(fā)掘高效低毒的抗氧化候選化合物，本研究合成了一系列查爾酮類似物，并研究其清除DPPH自由基活性和保護(hù)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的抗氧化活性。

DPPH是一種具有單一穩(wěn)定電子的自由基，可接受氫自由基或另一個(gè)電子。當(dāng)有自由基清除劑時(shí)，接受氫自由基后，DPPH在517 nm處的吸光度消失。而查爾酮類似物可提供這些氫自由基。研究發(fā)現(xiàn)，查爾酮類似物苯環(huán)上的羥基越多，DPPH自由基清除活性越好。在含有二羥基的查爾酮類似物中，3，4-二羥基查爾酮類似物具有更強(qiáng)的抗氧化活性。這表明化合物的抗氧化活性不僅取決于羥基的數(shù)量，跟羥基的相對(duì)位置也密切相關(guān)。相比于化合物1和6，羥基的鄰位二取代方式似乎更有利于抗氧化活性，這可能是由于一個(gè)羥基的氫原子與另一個(gè)羥基的氧原子容易形成分子內(nèi)氫鍵，分子內(nèi)氫鍵的存在使脫氫后的自由基更加穩(wěn)定。

H2O2已被廣泛用于誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[4]，本研究采用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型研究查爾酮類似物的細(xì)胞保護(hù)作用。相比于對(duì)照組，損傷組細(xì)胞生存率僅為60.38%，表明細(xì)胞對(duì)H2O2的刺激較為敏感。其中，6個(gè)3，4-二羥基查爾酮（化合物2、4、6、8、10和13）均表現(xiàn)出較好的細(xì)胞保護(hù)作用，且不表現(xiàn)細(xì)胞毒性。但它們之間也存在一定的藥效差異，其抗氧化能力13＞10＞8＞4＞2＞6，其中活性較好的化合物10和13的b環(huán)上均含有鹵素原子，表明b環(huán)上的吸電子基團(tuán)增強(qiáng)化合物的抗氧化活性。

優(yōu)選出高效低毒的化合物13進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)化合物13呈劑量依賴性地提高H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的生存率，降低MDA水平。Hoechst染色分析發(fā)現(xiàn)化合物13有效抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族主要由抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax）組成，它們相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[22]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，也是細(xì)胞凋亡的特異性執(zhí)行者，cleaved-caspase-3是caspase-3的激活型[23-24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明損傷組的cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達(dá)上升，Bcl-2蛋白表達(dá)下降；而化合物13能減弱cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達(dá)量的上升和Bcl-2的下降，也表明13能有效改善H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。PC12細(xì)胞是一種研究神經(jīng)系統(tǒng)功能的理想模型，研究13在PC12細(xì)胞中的保護(hù)作用，可能為其在缺血性卒中或神經(jīng)退行性疾病中的潛在治療作用提供直接證據(jù)。

本研究合成了16個(gè)查爾酮類似物，其中化合物12、13、14和15為新型的查爾酮類似物，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。其中，篩選得到的高效低毒3，4-二羥基查爾酮類似物13不僅具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，而且對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有較好保護(hù)作用。