重組豬α干擾素的安全性及體外抗病毒效果評(píng)價(jià)

劉延亭 ，宮瑞雪 ，張美美 ，代發(fā)文，趙寶凱

（1.北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司 100091；2. 滄州偉嘉畜牧有限公司 061199；3. 樂山師范學(xué)院 614099；4. 沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司 110144 ）

干擾素( Interferon，IFN) 是一種由同屬動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒作用的分泌性糖蛋白，目前被認(rèn)為是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，也是病毒感染的第一道防線［1］。IFN 因在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面具有較好的效果被視為人和動(dòng)物某些疾病和病毒感染的首選治療性藥物，特別是近些年在治療嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）和新型冠狀病毒[2-3]（2019-nCoV）上面顯示出的突出效果，已越來(lái)越受到科學(xué)家們的重視。豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前除非洲豬瘟病毒外，威脅我國(guó)豬群健康的三個(gè)最主要病毒，雖然市場(chǎng)上有較多疫苗種類可供選擇，但仍然無(wú)法阻止豬場(chǎng)，特別是小規(guī)模豬場(chǎng)不定時(shí)疫病的暴發(fā)，尤其是冬季的PEDV，已對(duì)很多養(yǎng)殖場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在使用疫苗正常免疫的同時(shí)，研究相關(guān)抗病毒細(xì)胞因子的抗病毒效果就顯得很有必要，而豬Ⅰ型干擾素中IFN-α因能誘導(dǎo)啟動(dòng)全身性和系統(tǒng)性的先天性免疫反應(yīng)[4]，已成為多數(shù)養(yǎng)殖人的第一選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬α干擾素原核重組表達(dá)載體pET-32a-PoIFN-α，為本公司實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.1.2 病毒 水泡性口炎病毒（VSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）NB株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 細(xì)胞 MDBK細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。ST、PK15、vero、Marc145細(xì)胞均為本試驗(yàn)保存。

1.1.4 其他試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM高糖培養(yǎng)基，均購(gòu)自Gibco公司；內(nèi)毒素去除試劑盒和內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XIOD公司；鎳膠購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；Tris、氯化鈉等購(gòu)自國(guó)藥。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白表達(dá)與純化 將含pET-32a-PoIFN-α的菌種按培養(yǎng)基總體積的0.5%接種LB液體培養(yǎng)基，同時(shí)加入終體積100μg/ml的氨芐青霉素， 37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)0.4～0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mM，28℃、200 r/min誘導(dǎo)過夜，收集菌體。離心獲得的沉淀用pH7.9的Tris-HCl緩沖液重懸，超聲破碎后再次離心，上清液用0.45μm濾器過濾，按照親和層析鎳柱純化說明書進(jìn)行純化，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定純度。

1.2.2 內(nèi)毒去除與生物學(xué)活性檢測(cè) 將目的蛋白洗脫液經(jīng)ToxinEraserTM樹脂吸收后，再洗脫濃縮，用ToxinSensor?凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量。并參考《中國(guó)藥典（2010版）》附錄“干擾素生物學(xué)活性測(cè)定法（細(xì)胞病變抑制法）”，以牛腎細(xì)胞（MDBK）和水泡性口炎病毒（VSV）為評(píng)價(jià)體系，測(cè)定純化重組蛋白PoIFN-α的生物學(xué)活性。

1.2.3 安全性測(cè)定 采用小鼠試驗(yàn)法，每批樣品用5只小鼠，注射前每只小鼠稱體重，應(yīng)為18～22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5mLl，觀察7d。觀察期內(nèi)，小鼠應(yīng)全部健存，且無(wú)異常反應(yīng)，到期時(shí)每只小鼠體重均應(yīng)增加，同時(shí)設(shè)注射DMEM工作液對(duì)照組。

1.2.4 體外抗病毒效果評(píng)價(jià)

1.2.4.1 培養(yǎng)細(xì)胞 用含10%FBS的DMEM工作液分別稀釋ST、Marc145和Vero細(xì)胞消化液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，各接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μLl，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6h。

1.2.3.2 干擾素稀釋 用含7%FBS的DMEM工作液將去除內(nèi)毒素的重組PoIFN-α做10-1、10-2、10-3、10-4稀釋。

1.2.3.3 接種干擾素 棄去96培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，加入干擾素稀釋液，每孔100μL，每個(gè)稀釋度做6個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)陰性和病毒陽(yáng)性對(duì)照，37℃、5%二氧化碳條件下繼續(xù)培養(yǎng)18h。

1.2.3.4 病 毒 稀 釋 用 含2%FBS的DMEM工 作 液 分別 稀 釋PRV、PRRSV和PEDV至 預(yù) 定 濃 度，即PRV至100TCID50/0.1mL、PRRSV至100TCID50/0.1mL、PEDV至100TCID50/0.1mL。

1.2.3.5 接種病毒 棄去96孔培養(yǎng)板內(nèi)上清液，每孔分別加入100μl各病毒稀釋液，陰性對(duì)照孔加入100μL 含2%FBS的DMEM工作液，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24～48h。

1.2.3.6 觀察病變情況，記錄結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組純化蛋白檢測(cè)結(jié)果 重組蛋白用SDS-PAGE電泳結(jié)合Bio-Rad Image Lab軟件確定蛋白純度。樣品上樣量不低于1μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳、染色和脫色之后，電泳膠上均只有與目的蛋白分子量相符的條帶，看不到明顯的雜蛋白條帶，且Image Lab軟件分析的純度均在90.0%以上，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 PoIFN-o重組蛋白純度SDS-PAGE鑒定圖

2.2 內(nèi)毒素及生物學(xué)活性測(cè)定結(jié)果 經(jīng)ToxinSensor?凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，去內(nèi)毒素樣品純化液中的內(nèi)毒素含量為50EU/mL；經(jīng)細(xì)胞病變抑制法測(cè)定生物學(xué)活性為1.4×109.0U/mL。

2.3 安全性測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)組5只小鼠，試驗(yàn)過程當(dāng)中，體重均有增加，證明純化的重組PoIFN-α蛋白對(duì)動(dòng)物安全，與對(duì)照組無(wú)差異。具體結(jié)果見表1。

表1 安全性測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.4 體外抗病毒效果評(píng)價(jià)結(jié)果 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒觀察結(jié)果，具體見表2。從結(jié)果可知，在體外，重組PoIFN-α蛋白對(duì)PRV、PRRSV和PEDV均有一定的抑制或延緩病毒增殖的效果。其中，對(duì)PEDV的抑制效果最好，重組蛋白即使1000倍稀釋仍然能夠完全抑制PEDV的增殖；重組蛋白高濃度（10倍稀釋）時(shí)，對(duì)PRRSV也具有完全抑制其增殖的效果。

表2 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒效果評(píng)價(jià)匯總結(jié)果

3 討論

干擾素是所有抗病毒藥物中最為廣譜、高效、生物學(xué)活性廣泛的特效治療性藥物。除了日常臨床中應(yīng)用于抗病毒作用外，還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，可以刺激多種免疫細(xì)胞如NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，如用作滅活疫苗佐劑或免疫增強(qiáng)劑[5-7]，對(duì)于疫苗的免疫效果具有正向的促進(jìn)作用。考慮到通過基因工程手段獲得的豬用干擾素?zé)o論是含量或是活性，均高于機(jī)體受病毒或其他干擾素誘生劑刺激產(chǎn)生的干擾素，因此重組豬α干擾素具有極大的研究及推廣潛力。